Миронов А.А.(Миронин Сигизмунд Сигизмундович), Комиссарчик Я.Ю. Миронов В.А. : другие произведения.

Методы электронной микроскопии в биологии и медицине

Самиздат: [Регистрация] [Найти] [Рейтинги] [Обсуждения] [Новинки] [Обзоры] [Помощь|Техвопросы]
Ссылки:
Школа кожевенного мастерства: сумки, ремни своими руками
Оценка: 8.00*3  Ваша оценка:
  • Аннотация:
    В монографии изложено большинство современных подходов к препарироќванию биологических объектов для исследования в трансмиссионных и сканируќющих микроскопах различные способы их криофиксации и прямого исследования в электронном микроскопе (замораживание-скалывание), низкотемпературная дегидратация (замораживание-замещение) и дегидратация в критической точке, низкотемпературные заливочные среды и условия их пропитки и полимеризации, существующие методы гистохимии и иммуноцитохимии с использованием разќличных электронно-плотных меток и др. В книге приведен также ряд рутинных методов, которые оправдали себя и до сих пор широко используются: различные способы химической фиксации, дегидќратации, заливки в эпоксидные смолы, микротомирование стеклянными и алмазќными ножами, контрастирование солями тяжелых металлов и др. Большое место отведено критическому анализу возникающих в процессе препарирования артефактов. Рассмотрены причины их возникновения и пути их профилактики. Значительное внимание уделено количественному анализу в элекќтронной микроскопии, в том числе рентгеновскому микроанализу. Специальные разделы посвящены методам изучения проницаемости и транспорта веществ в клетках, тканях и органах, а также сочетаемости различных методов электронной микроскопии. Обстоятельно рассмотрены вопросы интерпќретации и объемной реконструкции электронно-микроскопических изображений. В конце книги дан перечень рекомендуемых авторами протоколов основных методов препарирования объектов для электронно-микроскопического исследоќвания. Книга рассчитана на широкий круг научных сотрудников, аспирантов, стуќдентов и практических работников, занимающихся или интересующихся морфоќлогическими аспектами различных биологических дисциплин.


   0x01 graphic
   Оглавление
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

А. А.МИРОНОВ, Я. Ю. КОМИССАРЧИК, В. А.МИРОНОВ

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Ответственный редактор Н. Н. Никольский

  
  
   Санкт-Петербург "НАУКА" 1994
  
   Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной мик­роскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. - СПб. Наука, 1994. - 400 с.
   В монографии изложено большинство современных подходов к препариро­ванию биологических объектов для исследования в трансмиссионных и сканиру­ющих микроскопах различные способы их криофиксации и прямого исследования в электронном микроскопе (замораживание-скалывание), низкотемпературная дегидратация (замораживание-замещение) и дегидратация в критической точке, низкотемпературные заливочные среды и условия их пропитки и полимеризации, существующие методы гистохимии и иммуноцитохимии с использованием раз­личных электронно-плотных меток и др.
   В книге приведен также ряд рутинных методов, которые оправдали себя и до сих пор широко используются: различные способы химической фиксации, дегид­ратации, заливки в эпоксидные смолы, микротомирование стеклянными и алмаз­ными ножами, контрастирование солями тяжелых металлов и др.
   Большое место отведено критическому анализу возникающих в процессе препарирования артефактов. Рассмотрены причины их возникновения и пути их профилактики. Значительное внимание уделено количественному анализу в элек­тронной микроскопии, в том числе рентгеновскому микроанализу.
   Специальные разделы посвящены методам изучения проницаемости и транспорта веществ в клетках, тканях и органах, а также сочетаемости различных методов электронной микроскопии. Обстоятельно рассмотрены вопросы интерп­ретации и объемной реконструкции электронно-микроскопических изображений.
   В конце книги дан перечень рекомендуемых авторами протоколов основных методов препарирования объектов для электронно-микроскопического исследо­вания.
   Книга рассчитана на широкий круг научных сотрудников, аспирантов, сту­дентов и практических работников, занимающихся или интересующихся морфо­логическими аспектами различных биологических дисциплин.
   Библиогр. 377 назв. Ил. 39. Табл. 5.
  
  
   Рецензенты: Г.А. Алимов, М.Д. Донскова, С.А. Кроленко, В.А. Отеллин
  
   ISBN 5-02-026743-0
   А.А. Миронов, Я.Ю. Комиссарчик, В.А. Миронов, 1994
   Российская академия наук, 1994
   Художественное оформле­ние - Ю.П. Амбросов, 1994
  
  

ПРЕДИСЛОВИЕ

  
  
   В настоящее время, с одной стороны, морфологическая наука имеет в своем распоряжении большой набор методических прие­мов, позволяющих проводить анализ как на молекулярном, так и на органном и даже системном уровне. Электронный микроскоп превратился из уникального, экзотического прибора в обычный, доступный большинству морфологов инструмент исследования, спектр возможностей которого чрезвычайно широк. С другой сто­роны, при проведении диагностических и экспериментальных исследований все чаще возникает потребность в привлечении для уточнения диагноза и расшифровки патогенеза заболеваний мето­дов высокого разрешения: просвечивающей (трансмиссионной) и сканирующей электронной микроскопии, замораживания - скалывания, молекулярных зондов, иммуноэлектронной микроско­пии и т.д.
   Электронная микроскопия в последние годы совершила качественный скачок в своем развитии. Разработаны и успешно используются новые методы выявления различных компонентов клеток и тканей, такие как иммуноэлектронная микроскопия (с помощью, антител) и гибридизация in situ; совершенствуются уже известные методические подходы как в плане аппаратурного обеспечения, так и в вопросах подготовки объектов к просмотру в микроскопе.
   Стремительное развитие науки и техники делает особенно важ­ным их информационное обеспечение. К сожалению, существую­щие за рубежом руководства практически недоступны для широ­кого круга отечественных ученых. Однако даже за рубежом отсут­ствует руководство, в котором были бы в достаточно краткой форме, но в полном объеме изложены все методы электронной микроскопии. Поэтому публикация всеобъемлющего отечествен­ного руководства по гистологической технике в электронной мик­роскопии стала насущно необходимой.
   Авторы предлагаемой к рассмотрению монографии имеют большой опыт работы в области практической электронной мик­роскопии: Я.Ю. Комиссарчик - профессор, доктор биологических наук, работает в области электронной микроскопии более 40 лет, возглавляет лабораторию ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург); А.А. Миронов - профессор, доктор медицинских наук, работает в области элект­ронной микроскопии более 20 лет, является руководителем лаборатории электронной микроскопии Ивановского медицинско­го института (г. Иваново); В.А. Миронов - кандидат медицинских наук, в настоящее время работает на кафедре клеточной биологии и анатомии медицинского университета Южной Каролины (г. Чарльстон, США), является действительным членом обществ электронной микроскопии Германии и США. Авторы имеют мно­жество публикаций методического плана, в том числе обзорных работ, посвященных тому или иному методу электронной микро­скопии. Кроме того, Я.Ю. Комиссарчик разработал один из первых отечественных ультратомов.
   Академик РАН Н.Н. Никольский
   ВВЕДЕНИЕ
  
   Возникновение электронной оптики, в частности электронной микроскопии (ЭМ), основывается на трех основных достижениях в области физики, относящихся к 1897-1926 гг. открытие элект­рона, установление волновой природы движущихся материальных частиц и обнаружение отклоняющего действия электрических и магнитных полей на заряженные частицы. Эти предпосылки позволили Э. Руска и М.Кнолю в 1931 г. разработать первый про­свечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп (ТЭМ), а в 1935 г. - первый сканирующий электронный микро­скоп (СЭМ). Если в 40-х годах в ТЭМ было достигнуто разреше­ние 4 нм, то в 50-х - уже 0.4 нм. В 1938 г. появился сканирующий трансмиссионный электронный микроскоп (СТЭМ) с диаметром электронного зонда 10 нм.
   Первая промышленная модель электронного микроскопа (ЭМ) была выпущена в 1939 г. фирмой "Сименс и Гальске" (Нидерлан­ды). Эффективное использование ТЭМ началось с 1950 г. Первый серийный СЭМ "Стереоскан" был разработан фирмой "Кембридж Инструменте" (Англия) и поступил в продажу в 1964 г.
   Трое исследователей, начавших в этот период работы по электронно-микроскопическому изучению биомембран и функций органелл (в основном митохондрий и лизосом), Г.Палад, К. Де-Дюв и А.Клод, получили в 1974 г. Нобелевскую премию за достижения в области сравнительного ультраструктурного и биохимического анализа. А в 1987 г. Э.Руска за разработку первого электронного микроскопа был удостоен Нобелевской премии по физике.
   Быстрое развитие техники и технологии создает принципиаль­но новые возможности для ЭМ. Предельный уровень разрешения ТЭМ (0.1 нм) и СЭМ (2-3 нм) уже в настоящее время позволяет наблюдать крупные молекулы и надмолекулярные структуры in situ [127, 255, 284, 286].
   В современных ЭМ успешно используется ряд конструктивных особенностей, значительно облегчающих их эксплуатацию: 1) съемка осуществляется на фотопленку, расположенную вне ва­куумной системы; 2) в колонну ТЭМ встраивается телекамера, это дает возможность увеличить контрастность изображения и умень­шить интенсивность электронного пучка; 3) используются турбо-молекулярные насосы, что позволяет избежать загрязнения парами масла; 4) применяются устройства для изучения объектов на сверхмалых увеличениях с сохранением разрешения и использо­ванием особомелкозернистой пленки; 5) внедрены приспособле­ния, позволяющие фокусировать пучок электронов на небольшом поле объекта; 6) микроскопы комплектуются анализаторами изо­бражения; 7) приборы оборудованы микропроцессорами, позволяющими фокусировать изображение, оптимизировать контраст­ность и экспозицию, сохранять изображение в памяти; 8) исполь­зуются системы электромеханического перемещения образцов в колонне [127, 284].
   Новые СЭМ, оснащенные электронной пушкой с холодной эмиссией электронов, имеют чрезвычайно малый (менее 1 нм) диаметр пучка электронов [167]. Это приближает достигаемое в них разрешение к уровню ТЭМ. В современных СЭМ высокого разрешения образцы вводятся прямо в поле нижней электромаг­нитной линзы, что дает возможность улавливать с практически одинаковой эффективностью электроны, вылетающие из любых участков образца.
   В ближайшее время ожидается внедрение высокотемператур­ных сверхпроводящих материалов, обеспечивающих получение сверхвысокостабильных параметров СЭМ, и новых детекторов, по­зволяющих регистрировать одиночные электроны; кроме того, намечается все более широкое использование криометодов: замеще­ния в замороженном состоянии, напыления в условиях сверхниз­ких температур. Еще большие перспективы открывает применение СТЭМ [127, 284].
   Отличительными особенностями низковольтных СЭМ явля­ются низкое ускоряющее напряжения (ниже 1 кВ), а также нали­чие работающего на основе холодной эмиссии источника электро­нов и короткофокусной проекционной линзы. Низковольтная ска­нирующая ЭМ обеспечивает более высокую топографическую контрастность и меньшую выраженность артефактов, связанных с лучевыми повреждениями объектов.
   Низковольтная сканирующая ЭМ дает возможность изучать особенности строения зоны, расположенной непосредственно под поверхностью объекта. Применение низковольтной сканирующей ЭМ позволяет исследовать образцы без нанесения электропроводя­щего покрытия. Температура объекта в коммерческих низкотемпературных СЭМ (крио-СЭМ) поддерживается на уровне -160®С [142,151,285,].
   Низкотемпературная сканирующая ЭМ имеет ряд преиму­ществ перед обычной сканирующей ЭМ: 1) поверхность фазового раздела содержит воду; 2) размеры клеток и тканей не искажены, в то время как после высушивания в критической точке величина линейного сжатия достигает 20 % и более, а при сублимации - до 7 %; 3) сохраняются все тканевые компоненты, удаляемые при препарировании объектов для обычных СЭМ; 4) фиксация проис­ходит быстрее, метаболические процессы прекращаются почти мгновенно; 5) рентгеновский микроанализ (РМА) проводится без потерь и перемещения основных химических компонентов; 6) электронная бомбардировка не приводит к нагреванию объекта; 7) при раскалывании объектов прямо в колонне низкотемпературного СЭМ достигается комплементарность сколотых поверх­ностей, что упрощает реконструкцию объемного изображения объ­екта [292].
   Однако у данного метода имеются существенные недостатки: 1) в процессе замораживания могут образовываться кристаллы льда, разрушающие структуры и перераспределяющие химические компоненты; 2) требуются специальные процедуры для предотвра­щения контаминации образцов при переносе их в колонну СЭМ; 3) цены на современные микроскопы становятся все более высо­кими [265].
   В 1989 г. для исследователей, работающих с СЭМ, стал досту­пен новый тип этого прибора, названный "СЭМ в условиях окру­жающей среды" (environmental SEM), сущность которого состоит в том, что объекты во время исследования находятся не в высоком вакууме, а в условиях остаточной воздушной среды, что предохра­няет их от полного высыхания. Некоторые организмы, например насекомые, способны выживать в этих условиях. Этот тип СЭМ позволяет исследовать не фиксированные, не замороженные и не покрытые проводящим слоем биологические образцы при давле­нии, в 106 раз превышающем таковое в обычных СЭМ. Разреше­ние таких микроскопов составляет 10 нм [105, 247].
   В настоящее время ЭМ является методом, позволяющим изу­чать макромолекулярную структуру клеток, а в некоторых случаях переходить и на молекулярный уровень. Можно без преувеличения сказать, что ЭМ в современной биологии и медицине как бы свя­зывает воедино различные пути исследований молекулярных ос­нов жизни. В то же время (при увеличении порядка 1000-3000 раз) она сохраняет ряд возможностей методов световой микроско­пии (СМ), а использование полутонких срезов перекидывает мосты между современными и классическими морфологическими подходами к изучению клеток и тканей. И все же хотелось бы подчеркнуть, что даже сейчас возможности ЭМ почти целиком определяются методами электронно-микроскопического препари­рования, поскольку в большинстве случаев разрешение методов препарирования существенно ниже разрешения самих ЭМ. Имен­но это и определило направленность рукописи.
   Основная задача книги - дать общее представление о методах ЭМ. Мы попытались создать унифицированную классификацию методов ЭМ-исследования и сопроводить описание методов крат­ким справочником, который включал бы в себя основные, хорошо зарекомендовавшие себя прописи. Процедуры, относящиеся к химии, биохимии и иммунологии, мы в книге, как правило, не приводим, отсылая заинтересованного читателя к соответству­ющей литературе, количество которой настолько велико, что нам пришлось цитировать лишь обзорные статьи и руководства, а также статьи последних лет.
  
   Между тем известно, что в каждой лаборатории ЭМ существу­ют свои "секреты", которые остаются секретами не потому, что их тщательно оберегают, а потому, что в публикуемые статьи часто физически невозможно включить все те методические тонкости и уловки, которые применяются в повседневной работе. Таким обра­зом, чтение любого руководства не всегда может заменить личное общение с авторами методов, поэтому роль конференций, симпо­зиумов, школ и других научных форумов в современной науке трудно переоценить.
   В 1993 г., когда эта рукопись была сдана в издательство, исполнилось 30 лет со дня выхода в свет первой отечественной монографии по электронной микроскопии - "Основы гистологи­ческой техники электронной микроскопии", - автор которой, Л.С. Гольдин [16], являлся учителем одного из авторов настоящей книги, Я.Ю. Комиссарчика. В этом нам видится определенная пре­емственность данной монографии.
  
   Глава 1 ФИКСАЦИЯ
  
   Все биологические процессы, которые исследуют с помощью ЭМ, можно подразделить на четыре группы, определяющие возможные методы препарирования: 1) очень быстрые, к примеру слияние биологических мембран во время экзоцитоза (для их изу­чения используются сверхбыстрая криофиксация с соответствую­щим последующим препарированием); 2) быстрые процессы, например сокращение мышц, экзо- и эндоцитоз, трансцитоз, про­цессы везикуляции мембран, перемещения ионов и тд. (методы препарирования те же); 3) медленные процессы, например класте­ризация внутримембранных частиц, перестройки других структур клеточной мембраны, изменения формы и размеров органелл, реорганизация структуры цитоскелета и щелевых соединений и т.п. (можно использовать рутинные методы ЭМ); 4) очень медлен­ные процессы, например движения хромосом, клеточное деление [284].
   В процессе препарирования образцов для ТЭМ выделяют сле­дующие этапы: взятие материала, префиксация, дофиксация, про­мывание, постфиксация, обезвоживание, инфильтрация промежу­точными растворителями, пропитывание заливочной смолой, заключение в смолу и перевод ее в твердое состояние, изготовле­ние полутонких срезов (ПС) и ультратонких срезов, или ультра­срезов (УС), окрашивание (контрастирование) УС и их просмотр. В этот перечень при использовании различных методов ЭМ могут включаться этапы высушивания, замораживания, нанесения элек­тропроводящего покрытия, напыления (оттенения) и др. [9,11, 76, 81, 193].
   Цель фиксации - сохранить структуру ткани в состоянии, близком к прижизненному. Фиксация защищает ткани от повреж­дения во время заливки, резки и воздействия электронного пучка. Фиксация решает две взаимосвязанные задачи: 1) останавливает идущие в тканях метаболические процессы и препятствует посмертному распаду структур; 2) стабилизирует то пространст­венное положение молекул, надмолекулярных структур и органелл, которое они занимали при жизни в момент, предшествующий фиксации. При этом в результате фиксации могут выявляться структуры двух типов: 1) прижизненно существующие; 2) не существующие при жизни (артефакты), которые в свою очередь делятся на два подтипа - артефакты, закономерно возникающие при фиксации, и артефакты, связанные с нарушением условий препарирования.
   В зависимости от способа прекращения метаболических про­цессов различают физическую и химическую фиксацию. Физиче­ская фиксация осуществляется в процессе замораживания или теплового воздействия, чаще всего с помощью микроволнового излучения (МВИ) [193].
  

1.1. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА

   Пробы для ЭМ берут у только что забитых животных как мож­но быстрее, чтобы предотвратить посмертные изменения. Агональная фаза фиксации - это время между прекращением артери­ального кровотока к тканям и моментом блокирования фиксато­ром процесса аутолиза. Следует учитывать, что при работе на человеческом материале она может оказаться довольно продолжи­тельной. Правильное взятие материала - важная предпосылка ус­пеха как фиксации, так и всей дальнейшей работы, поэтому иссле­дователь должен делать это сам, не поручая другому лицу.
   При работе с экспериментальными животными обязательным является соблюдение правил эфтаназии. Отметим, что при взятии материала для ЭМ сублетальные дозы анестетиков предпочтитель­нее декапитации или цервикальной диссоциации (обычно перелом шейного отдела позвоночника). Анестетики желательно подбирать для каждого вида животного. В ряде случаев для этой цели исполь­зуют сухой лед. Идеального способа взятия материала не сущест­вует. Так, анестетики могут изменять физиологическое состояние клеток, а вырезание образцов ведет к механическим деформациям, вызывает состояние гипоксии.
   Взятие материала для фиксации нужно осуществлять с вели­чайшей осторожностью, поскольку механическое воздействие на ткани может сделать материал непригодным для исследования. Обычно в руководствах по ЭМ указывается, что размеры объектов, от которых можно с уверенностью получить хорошие срезы, не должны превышать 1 мм. Сразу вырезать такой кусочек из ряда органов часто не представляется возможным. Тем не менее мы не можем рекомендовать метод, который до сих пор применяют во многих лабораториях, - измельчение ткани в капле фиксатора. Не всегда оправданной представляется тактика первоначального взя­тия кусочков больших размеров с последующим вырезанием из них более мелких кусочков в процессе обработки. Лучше вначале разрезать образец свежим лезвием бритвы, опустить в фиксатор, а затем (примерно через 1 ч) с помощью нового лезвия бритвы приготовить (со стороны разрезанной профиксированной поверх­ности) тонкие (толщиной не более 1 мм) ориентированные пла­стинки, которые дофиксировать [88, 193].
  

1.2. ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ

   Несмотря на наличие существенных ограничений, химическая фиксация наиболее широко используется для ЭМ. Она предпола­гает воздействие на образцы веществ, которые, химически связы­ваясь с компонентами ткани, стабилизируют их. Возможны следу­ющие варианты химической фиксации: перфузионная, иммерси­онная, накалывание in situ. Для СЭМ фиксация может осуществляться одним из следующих способов: 1) заполнение (например, с помощью инъекции) просвета полого органа (кишка, желчный и мочевой пузырь, воздухоносные пути, желудочки мозга), 2) сосудистая перфузия, 3) иммерсия, 4) накалывание, 5) тканевая микроинъекция, 6) в парах фиксатора [9, 11, 215]. В последнем случае фиксация объектов может осуществляться в вакууме (например, с помощью молекулярных пучков четырехокиси осмия) после быстрого замораживания и сублимации воды [223].
   Критическими факторами фиксации являются используемый фиксатор, рН, ионная сила раствора, ионный состав, диэлектриче­ская константа, осмолярность, температура, длительность фикса­ции, метод нанесения фиксатора.
   Фиксирующие вещества применяются обычно в виде водных растворов. Величина рН этих растворов в течение фиксации под­держивается на уровне физиологических значений с помощью бу­ферных растворов, а изоосмотическое давление создается добавле­нием некоторых осмотически активных веществ. Ткани, фиксиро­ванные при значениях рН фиксатора от 6 до 8, мало отличаются по структуре, однако в случае исследований, требующих предель­ных разрешений, соблюдение рН считается очень важным. Боль­шая концентрация фиксатора требует меньшего времени фикса­ции, но значительно изменяет антигенные свойства и ультра­структуру тканей [17, 72, 193].
   Высокая температура увеличивает скорость химических ре­акций и проникновения фиксатора, но одновременно растет и ско­рость аутолиза, низкая температура оказывает противоположное действие. Фиксация при t=О®С проводится для того, чтобы све­сти к минимуму посмертные изменения ткани и экстрагирование тканевых компонентов. Большинство исследователей используют фиксирующие растворы комнатной температуры [193]. В этом случае некоторые клеточные органеллы, например микротрубочки, выявляются лучше.
   При химической фиксации необходимо соблюдать ряд усло­вий. 1. Объем фиксатора должен в 10 раз превышать объем образ­ца. 2. Если при погружении образца в фиксатор последний мутне­ет, то его необходимо немедленно заменить. 3. Нельзя переносить образцы из одного флакона в другой с помощью пинцетов. Отра­ботанные растворы либо удаляют пипеткой, либо сливают через край. Чтобы не потерять образцы, рекомендуется делать это над чашкой Петри или сливать жидкость через ситечко из инертного материала. При наклоне флаконы лучше развернуть этикеткой вверх, чтобы капли жидкости не смыли надпись. Для удаления ос­татков жидкости флаконы переворачивают вверх дном на кусок фильтровальной бумаги. Образцы при этом, как правило, прили­пают ко дну флакона. 4. Следует учитывать скорость проникнове­ния фиксатора в ткани (см. ниже). 5. Очень мало известно о ре­зультатах перефиксации. Отмечено, однако, что с увеличением длительности химической фиксации растут степень сжатия тканей и величина экстракции тканевых компонентов. Возможны и тка­невые повреждения, если фиксирующие агенты являются сильны­ми окислителями (четырехокись осмия, перманганат калия и др.) [25, 26].
  

1.3. ХИМИЧЕСКИЕ ФИКСАТОРЫ

   Фиксатор для ЭМ должен отвечать следующим требованиям: 1) быстро проникать в ткани; 2) сохранять третичную структуру молекул антигенов и их доступность для взаимодействия с антите­лами; 3) его рН, молярность и ионный состав должны быть близкими к таковым у вне- или внутриклеточной жидкости. Требуется тщательный подбор метода фиксации для каждой новой задачи [367].
   Все фиксаторы можно разделить на четыре группы: 1) быстро проникающие и быстро фиксирующие (акролеин); 2) медленно проникающие и медленно фиксирующие (четырехокись осмия); 3) медленно проникающие, но быстро фиксирующие (глютаральдегид); 4) быстро проникающие, но медленно фиксирующие (формальдегид) [15, 26, 193, 367].
  

1.3.1. Характеристика фиксаторов

   Наиболее широко в ЭМ используются аддитивные фиксаторы - глютаральдегид, формальдегид, четырехокись осмия и акролеин, которые получили это название из-за того, что они как бы встраи­ваются в структуру фиксируемых веществ, прежде всего протеи­нов. Идеальных фиксаторов нет - любой из применяемых имеет свои положительные и отрицательные стороны.
  

1.3.1.1. Четырехокись осмия (ЧО)

   ЧО (OsО4, тетроксид осмия) представляет собой блестящие бесцветные или слегка желтовато-зеленоватые игольчатые кри­сталлы. Они светочувствительны и гигроскопичны. ЧО - непо­лярное вещество, проникающее как сквозь заряженные, так и неза­ряженные поверхности липидного бислоя и растворяющееся как в полярных, так и в неполярных средах. Насыщенный водный раствор при t=25®С содержит 7,24 % ЧО. Раствор ЧО в этаноле нестабилен.
   ЧО взаимодействует с липидами по месту двойных связей, а затем реагирует с их полярными группами, она слабо реагирует с олеиновой, линолевой и молочной кислотами, фибрином, почти совсем не реагирует с пальмитиновой и стеариновой кислотами. ЧО способствует образованию поперечных связей между молеку­лами белков, в том числе за счет взаимодействия с SS- и SH-гpyппами и аминогруппами боковых цепей. Нуклеиновые кислоты и углеводы, вероятно, не реагируют с ЧО. Однако если нуклеиновые кислоты связаны с белками, как, например, в рибосомах или хромосомах, то такой комплекс оказывается реакционноспособным. Малорастворимые частицы агрегированного гликогена обычно удерживаются в клетках молекулярной сетью фиксирован­ных белков. Небольшие растворимые молекулы, как правило, фиксируются плохо [105]. ЧО блокирует ферментативную актив­ность и стабилизирует липопротеиновые комплексы, фосфолипиды ядра и цитоплазмы в первую очередь за счет реакций с липи­дами, а также с SH- и SS-группами белков. Кроме того, ЧО "окрашивает" субмикроскопические структуры клеток, меняет антигенные свойства тканей. Немедленно после контакта с ней плазмалемма теряет свои барьерные свойства для малых молекул. ЧО действует и как мордант, т.е. вещество, которое способно свя­зываться с красителем, усиливая контрастность структуры в ЭМ. В частности, ЧО является мордантом (см. гл. 7) для ионов свинца [193].
   ЧО чаще используется в качестве постфиксатора. При этом не­насыщенные связи жирных кислот оксигенируются ею, а сама ЧО восстанавливается до осмиевой черни. Образцы приобретают чер­ный цвет. Контрастность биологических тканей возрастает. Осми­евая чернь, образующаяся в тканях, представляет собой смесь сво­бодного металла, оксидов и циклических осматополимеров. В про­цессе обезвоживания в этаноле восстановление ЧО продолжается, что приводит к дальнейшему почернению объектов.
   При обработке фиксированных в ЧО тканей избытком тиокарбогидразида его молекула присоединяется одним концом к атому Os в ткани, при повторной экспозиции в растворе ЧО с этими уча­стками дополнительно связываются атомы ЧО, что усиливает контрастность осмиофильных компонентов клеток [193, 367].
   ЧО образует поперечные связи с белками, в результате чего возникает гелеподобная структура, но и длительная инкубация с ЧО может привести к разрывам белковых молекул. Продукты реакции многих белков и липидов с ЧО растворимы в воде, особенно при длительной фиксации, поэтому оправдана кратко­временная фиксация или использование при длительной фикса­ции хромовой кислоты в качестве стабилизатора липидов [105, 193].

1.3.1.1.1. Режим использования

   В настоящее время ЧО чаще всего используется в качестве пост­фиксатора. Скорость проникновения ЧО в ткани (0.5 мм/ч) ниже, чем глютаральдегида (ГА). Поэтому в центре кусочка фиксация иногда хуже, чем на периферии, где он может быть даже перефик­сирован.
   Для фиксации обычно используют 1%-ные растворы ЧО на буфере. Продолжительность постфиксации 1 ч. Если применяется одноступенчатая процедура, то время удлиняется до 2 ч (t=4®С). Постфиксация может продолжаться до 12 ч. При фиксации ткани в незабуференной ЧО рН за 48 ч падает с 6.2 до 4.4. Продолжи­тельность воздействия ЧО влияет на структуру тканей. Очень ко­роткая фиксация приводит к недофиксации, слишком продолжи­тельная - к экстракции тканевых компонентов, особенно во время последующего обезвоживания [193].
   Фиксацию цитологических отцечатков и мазков желательно проводить в парах ЧО. Однако в этом случае фиксируется только поверхностная зона объекта. Поэтому фиксация в парах ЧО при­менима главным образом для мелких объектов - вирусов, бакте­рий, одиночных клеток крови, культуры тканей, мелких нервов и др. На практике на стекло помещают каплю с объектами и при­крывают этим стеклом (объектом вниз) сосуд с раствором ЧО на 1-3 ч (рис. 1).
   ЧО не рекомендуется использовать для перфузии, так как она вызывает резкий спазм кровеносных сосудов и тромбоз капилля­ров. Пары ЧО могут применяться для осмирования образцов по­сле их лиофилизации. Процесс продолжается в течение 12 ч. Сле­дует отметить, что объекты после этого становятся серыми. Но при добавлении воды немедленно приобретают черный цвет [105, 193] (см. Приложение, 1.7).
  
  

0x01 graphic

   Рис. 1. Устройство для фиксации объектов в парах водного раствора ЧО. а - объект; б - фиксатор; в - предметное стек­ло с клетками (капли с объектами) (по: [9]).
  
  

1.3.1.1.2. Приготовление растворов

   Чаще всего ЧО поставляется фирмами в виде запаянных в ам­пулы кристаллов, из которых потом готовят 2%-ный раствор ЧО. Сосуд для раствора ЧО должен быть сначала вымыт (например, азотной кислотой - для удаления органических примесей, а затем водой - для удаления следов кислоты). В абсолютно чистую банку из темного стекла наливают нужное количество нейтральной бидистиллированной воды. Тщательно моют стеклянную ампулу с кристаллами ЧО, затем делают на ней надрез (алмазом или на­пильником), снова споласкивают водой, помещают в сосуд с водой и там разбивают абсолютно чистой стеклянной палочкой. ЧО растворяется медленно - при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Для ускорения растворения кристаллов ЧО рекомендуется пользоваться магнитной мешалкой, перемешивая раствор-метал­лической палочкой в стеклянной оболочке. Процесс можно уско­рить с помощью быстрого нагревания на паровой бане или воз­действия ультразвука [72, 105].
   Обычно раствор ЧО хранят в темной герметично закрытой стеклянной посуде при комнатной температуре. Исходный раствор ЧО длительное время можно хранить в холодильнике. Раствор должен быть прозрачным и иметь слегка желтоватый цвет. Для его стабилизации с целью предохранения ЧО от самопроизвольного восстановления рекомендуется добавлять на 150 мл раствора не­большой кристаллик хромового ангидрида или несколько капель 1%-ного раствора бихромата калия, кроме того, фиксатор можно приготовить на 0.1%-ном растворе хромовой кислоты. В этом слу­чае в стеклянном флаконе с хорошо притертой пробкой фиксатор сохраняется годами.
   Пыль и воздействие света быстро портят раствор ЧО. Для ингибирования процесса восстановления ЧО в раствор можно доба­вить несколько кристаллов MgCh. Появление мути, осадков или изменение цвета с соломенно-желтого на коричневый, зеленый, бордовый или фиолетовый свидетельствуют о непригодности рас­твора для использования. Если базовый раствор становится фио­летовым (лиловый) или слегка коричневым из-за образования ди­оксидов Os, то он может быть регенерирован добавлением капли перекиси водорода [72, 105].
   Пары осмия проникают наружу практически через любую крышку и вызывают потемнение внутренней поверхности холо­дильника, если там есть следы жиров. Поскольку ЧО очень летуча, то хранить ее лучше в отдельном холодильнике, либо помещать сосуд с раствором ЧО в больший сосуд с массивной резиновой крышкой или с крышкой, снабженной резиновым уплотнением (хранить бутылку с осмием в еще одной экранирующей бутылке). Лучше всего банку с раствором ЧО закрыть тефлоновой крышкой и запечатать парафильмом (после каждого открывания пробку следует протирать чистой фильтровальной бумагой). Через дру­гие пластики пары ЧО легко проникают. Менее желательно ис­пользовать двойные бутыли с притертыми пробками, так как они позволяют ЧО испаряться, при этом концентрация ЧО в растворе снижается, что приводит к потере стандартизации ре­зультатов. В некоторых лабораториях 2%-ный раствор ЧО раз­ливают по ампулам и хранят в замороженном состоянии. Ис­пользованный ЧО можно регенерировать (см. Приложение, 3.3) [11, 15, 16, 105].
  

1.3.1.2. Глютаральдегид (ГА)

1.3.1.2.1. Механизмы действия

   В основе механизма действия ГА лежит стабилизация белковых молекул с образованием поперечных связей, что является особенно важным для сохранения их локализации в клетке. В то же время не­прочность ряда связей, образуемых ГА, а также то, что фосфолипиды и ненасыщенные липиды не стабилизируются при этой фиксации, вызывает необходимость дополнительной фиксации в ЧО.
   При использовании ГА протекает следующая химическая ре­акция: 2 протеина + ГА - протеин-ГА-протеин + 2Н2О. ГА реаги­рует с аминогруппами белков, а не с гидроксильными группами. Тем самым ГА как бы сшивает растворимые белки цитозоля и од­новременно фиксирует их, препятствуя их перераспределению. В некоторой степени ГА реагирует с липидами, карбогидратами, нуклеиновыми кислотами.
   ГА практически не фиксирует ДНК прокариотов, так как они не содержат достаточного количества связанных белков, а имею­щиеся быстро теряются в начальный момент фиксации. Поэтому во время дегидратации молекулы ДНК агрегируют случайным об­разом. После воздействия ГА ДНК становится более резистентной к ДНКазе, так как диальдегиды реагируют с аминогруппами цитозина и гуанина [193].
   Поглощение ГА тканями продолжается 5-10 мин, поэтому продолжительность перфузионной фиксации должна составлять приблизительно 10 мин. Аэрация фиксатора улучшает связывание ГА тканями. После фиксации в ГА клетки в ряде случаев сохраня­ют осмотическую активность. Проникновение ГА в ткани делает их бледно-желтыми (образование оснований Шиффа) и тверды­ми. Скорость проникновения ГА в ткань низкая. Сжатие тканей вследствие фиксации ГА достигает 5-10 % [72, 193].
   ГА вызывает разрушение сети актиновых микрофиламентов (МФ), зависимое от осмолярности буфера в фиксаторе, и иниции­рует появление гранулярной субстанции на образцах, которая от­сутствует в криофиксированных клетках. В присутствии ГА движение органелл прекращается через 30-45 с, а везикуляция продол­жается в течение 2.5 мин. ГА способствует слиянию микровезикул с клеточными мембранами. Если применяется очень низкая кон­центрация ГА, то появляется множество миелиновых фигур. Сход­ный артефакт вызывается очищенным ГА [23, 105, 178, 179].
  

1.3.1.2.2. Режим использования

   Для иммерсионной фиксации удобно использовать ГА, имею­щий, гриф: "для электронной микроскопии" и продающийся в стеклянных запаянных ампулах. Для перфузионной фиксации этот раствор слишком дорог - в большинстве случаев применяется ГА с грифом: "для биологических целей". Концентрация ГА может варьировать от 2 до 6 %. Изменение концентрации ГА в этих пределах не оказывает заметного воздействия на структуру интактной ткани, особенно в присутствии оптимального по осмолярности растворителя. Однако для рутинной ТЭМ концентрация не должна превышать 25 %. Продолжительность фиксации зави­сит от плотности образца. Средняя продолжительность фиксации ГА от 30 мин до 2-4 ч.
   В некоторых случаях время фиксации может достигать 24 ч. Резко укороченные сроки фиксации (10-15 с) без дофиксации в ЧО с последующей заливкой в водорастворимые смолы исполь­зуют только для проведения гистохимических реакций. При необ­ходимости получения высоких разрешений не следует фикси­ровать ткань более 15-2 ч. Охлаждать фиксатор до t=4®С в большинстве случаев не требуется. Для животных клеток чаще всего рекомендуется 2 %-ный раствор ГА на 0.1 М какодилатном буфере, содержащем 100 ммоль/л сахарозы (рН 7.2). Надежная сохранность клеток достигается путем использования вначале 0.1-0.2 %-ного, а затем 1-3%-ного раствора ГА. При этом не про­исходит коагуляции плазменных протеинов и загрязнения поверх­ности клеток. Оптимальная фиксация может быть также достигну­та в 1.2-1.5%-ном растворе ГА на 0.1 М фосфатном буфере (ФБ), рН 7.4, содержащем 2.5 % поливинилпирролидона. Гарантирован­ная сохранность тканей во всех отделах объекта достигается при использовании ГА только в том случае, если размер кусочка не превышает 1 мм3 [178, 179, 193]. Предпочтительными для разве­дения ГА являются фосфатный и какодилатный буферные раство­ры. Высокий рН (8.0) растворов ГА более эффективен при фиксации растений, однако в этом случае происходит быстрая полимеризация ГА. Иногда фиксацию начинают при рН 7.0, а затем рН поднимают до 8.0 путем постепенного добавления 0.1 М NaOH. Фиксация тканей в ГА при увеличении температуры до 45®С также позволяет вполне удовлетворительно сохранять ультра­структуру [178, 192].
   Добавление в 3 %-ный раствор ГА небольшого количества ами­нов существенно улучшает сохранность актиновых филаментов. К примеру, лизин эффективен в концентрации 20-25 ммоль/л, соот­ношение концентраций амина и ГА равно 1 : 12 [104]. Продукты реакции ГА с первичными аминами являются активными компо­нентами фиксатора [178].
  

1.3.1.2.3. Состав коммерческих растворов ГА

   ГА поступает в продажу в виде 25-и 50 %-ных бесцветных вод­ных растворов. Чистый раствор содержит ГА в мономерной фор­ме, которая имеет максимум поглощения в области 235 нм и является действующим началом фиксатора. Обычно его хранят в стеклянной посуде с плотной крышкой или в запаянных ампулах под азотом при t=4®С или t=-20®С. Обычно коммерческий ГА имеет два пика поглощения в ультрафиолетовой области спектра -235 нм (мономер) и 280 нм (димер). Оптимальный уровень соот­ношения между пиками от Г: 1 до 1 : 2. Коммерческий раствор ГА с рН 4.0 вполне пригоден для использования. Если во время хранения рН раствора понижается до 3.4, то его использовать не­желательно. Падение рН связано с образованием полимеров, кото­рые резко снижают качество фиксатора и часто делают его совсем непригодным. Перед употреблением рекомендуется проверить на спектрофотометре наличие полимеров и, если требуется, очистить раствор. В настоящее время коммерческие растворы ГА содержат стабилизаторы, предотвращающие образование полимеров. Часто при употреблении смесей из такого ГА фиксатор мутнеет и его не­обходимо профильтровать перед употреблением. Однако отмечено, что высокое содержание мономерного ГА не дает фиксатору какого-либо преимущества в случае рутинной ТЭМ. В то же время, мономерный ГА лучше сохраняет антигенные свойства тканей [178, 193].
   Растворы ГА при комнатной температуре образуют сложные смеси. Такие смеси состоят примерно из 4 % альдегида, 16 % мо­ногидрата, 9 % дигидрата и 70 % полуацеталя. В разбавленном растворе полимеризации ГА практически не происходит. Среди примесей коммерческого ГА встречаются глютаровая кислота, ак­ролеин, глютарадозин, этанол, метанол, различные полимеры и продукты фотохимической деградации.
   Мономерный ГА может быть отделен от других компонентов с помощью вакуумной дистилляции, фильтрации через активиро­ванный уголь или через ионообменные смолы. Фильтрация через уголь - наиболее простой, но малоэффективный способ (см. При­ложение, 3.2). При дистилляции под атмосферным давлением ди­стиллят собирают при t=100®С порциями по 50 мл, в которых определяют рН. Если рН ниже 3.4, то порцию выбрасывают. Дис­тилляцию под вакуумом проводят в колбах при нагревании до t=65®С. После снятия вакуума дистиллят (вязкая прозрачная жидкость) разводят таким же количеством свежепрокипяченной деминерализованной воды путем медленного добавления последней (t=75®С) к дистилляту на магнитной мешалке под азотом.
   Осмолярность 2%-ного коммерческого раствора ГА из различ­ных источников варьирует от 190 до 280 мОсм. После очистки коммерческого ГА с помощью активированного угля осмоляр­ность растворов ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.2-7.3), оцененная с по­мощью осмометра, будет следующей: 1.2%-ный ГА - 370 мОсм, 2.3%-ный - 490 мОсм, 4.0%-ный - 685 мОсм.
   ГА должен храниться (особенно после очистки) в закрытой по­суде, так как быстро окисляется кислородом до глютаровой кисло­ты. Длительно хранившийся ГА рекомендуется очищать. ГА при хранении вне ампулы будет полимеризоваться, и при его добавле­нии к раствору образуется белесоватая муть. Такой раствор ис­пользовать нельзя [178, 192].
  

1.3.1.3. Формальдегид (ФА)

   При взаимодействии ФА с тканями наиболее реактивными местами являются первичные амины (например, лизин) и тирлы (например, цистеин), а после сшивания этих групп начинается реакция с менее активными группировками, такими как первич­ные амиды (глютамин, аспарагин), гуанидиновые группы (арги­нин) и тирозиновые карболовые кольца. ФА плохо реагирует с ДНК, чуть лучше - с РНК. При растворении ФА в воде быстро об­разуется метиленгликоль.
   Равновесие этой реакции сдвинуто в сторону гликоля, и соот­ветственно образование ФА занимает много времени (часы). Когда ткань погружена в раствор ФА, последний в нее быстро проникает (метиленгликоль), но плохо фиксирует (карбонилформальдегид) -это своеобразный парадокс ФА. При фиксации водным раствором ФА полное равновесие реакций образования химических связей в объекте достигается за 24 ч при t=20®С и за 16 ч при t=37®С [148].
   Раствор ФА вызывает определенные альтерации плазмалеммы и митохондрий, хотя не ясно, связано ли это с присутствием метиленгликоля, или нет. Под воздействием ФА могут формировать­ся блебсы на поверхности клеток и возникать везикуляция клеточной мембраны. Для улучшения фиксации можно рекомендовать вначале перфузировать препарат ФА при рН 65 (достигается быс­трота и гомогенность распределения вещества), а затем увеличи­вать рН до 11, что приводит к окончательной стабилизации препа­рата [96, 148, 178, 193].
   Сам ФА при стандартной концентрации 4 % (1.33 М без буфе­ра) имеет осмолярность несколько меньшую (1300 мОсм), чем расчетная (1330 мОсм). Соответственно добавление буфера делает фиксатор чрезмерно гипертоничным. Зачастую осмолярность ФА (в действительности метиленгликоля) при вычислении осмолярности фиксатора в расчет не принимается.
   Формальдегид (ФА) поступает в продажу в виде параформальдегида (порошок белого цвета). Для ТЭМ желательно использовать химически чистый параформальдегид. ФА должен быть свободен от метанола и муравьиной кислоты. Перед употреблением обычно готовят свежий раствор ФА на бидистиллированной воде [193] (см. Приложение, 3.4 и 3.6).
  

1.3.1.4. Акролеин

  
   Коммерческий акролеин содержит 0.1 % гидрохинона (инги­битор оксидации). Если раствор мутный или рН его меньше 6.4, то необходима дистилляция. В растворы акролеина нельзя добав­лять сахарозу. После акролеиновой фиксации обязательна постфиксация в ЧО. Часто акролеин используют в комбинации с дру­гими альдегидами. Предложено множество различных прописей смеси акролеина с другими фиксаторами (см. Приложение, 3.9.3-3.95). Из-за относительно высокой скорости проникновения акролеина его растворы обеспечивают удовлетворительную фиксацию сравнительно крупных образцов [178, 192].
  

1.3.2. Выбор фиксаторов

  
   Выбор в большой степени зависит от цели исследования (см. Приложение, 3.5-3.10). Так, обнаружено, что при фиксации в ГА экстрагируется 37 %, в ЧО 75 %, а в ФА 96 % свободных ами­нокислот из тканей [192]. Важным показателем является скорость проникновения фиксатора в ткани. За 4 ч 5%-ный ФА удовлет­ворительно фиксирует ткань на глубину 25 мм, 3%-ный ГА - на 0.5 мм, 2%-ный ЧО - на 0.8 мм. Скорость проникновения фикса­тора можно увеличить путем добавления диметилсульфоксида (ДМСО) до концентрации 2 %. Добавление ДМСО увеличивает проницаемость тканей, однако он проникает в ткань быстрее фик­сирующего вещества и губительно действует на живую ткань, по­вреждая ее. Поэтому применение ДМСО для рутинной ЭМ не всегда целесообразно. Для качественной фиксации всех компонен­тов тканей лучше всего использовать смеси различных фиксирую­щих веществ. Для рутинных ЭМ-исследований рекомендуется забуференная смесь, содержащая 4 % ФА и 1 % ГА (можно хранить в течение 3 мес). Популярен фиксатор Карновского [193] (см. Приложение, 3.9.1 и 3.9.2).
   Ненасыщенные липиды и фосфолипиды не стабилизируются при фиксации альдегидами. Если не проводить постфиксации в ЧО, то эти вещества экстрагируются при обезвоживании. Однако альдегиды фиксируют белки эффективнее, чем ЧО. Качество фиксации в значительной степени зависит от чистоты применяемых альдегидов. ФА используют, когда необходимо сохранить актив­ность ферментов и антигенные свойства исследуемых тканей. Еще чаще в этих случаях используют смесь ГА и ФА. Добавление акро­леина к ФА уменьшает экстракцию протеинов из тканей. Хорошая фиксация эмбриональной ткани достигается в смеси, которая со­держит 3 % ГА, 2 % ФА, 1 % акролеина, 25 % диметилсульфокси­да. Смесь 2 % ФА и 2 % ГА на буфере (200 мОсм) обеспечивает удовлетворительную фиксацию тканей печени на глубину 2.0; 2.5 и 5.0 мм через 2, 4 и 24 ч соответственно [148, 178, 193]. Хотя при смешивании ГА и ЧО реагируют между собой с образованием ос­миевой черни и глютаминовой кислоты, однако такие смеси ис­пользуются на практике. Реакция между ЧО и ГА имеет лаг-пери­од продолжительностью 30 мин. Если за это время успеть прове­сти фиксацию, то осадок не образуется и получаются неплохие результаты. При одновременной фиксации в ГА и ЧО лучше выявляется структура мембран и меньше экстрагируются нуклеи­новые кислоты. Добавление 0.05 % ЧО к ГА улучшает фиксацию внутриклеточных структур, так как делает мембраны более прони­цаемыми для ГА.
   Для визуализации эндоплазматического ретикулюма приме­няется специальный режим фиксации: фиксатор должен содер­жать хелатирующее вещество и дивалентные катионы - кальций или никель [95].
   При добавлении к фиксаторам таниновой кислоты (ТК) улуч­шается сохранность ряда структурных компонентов клеток, напри­мер мембран, микротрубочек и микрофиламентов. ТК действует как мордант, усиливающий окрашивание структур тяжелыми ме­таллами - ЧО и цитратом свинца (ЦС). ТК легко проникает в по­врежденные клетки, увеличивая их плотность, что позволяет отли­чать такие клетки от интактных, мало растворима в ФБ, выпадает в осадок при рН выше 7.2-7.4. Лучше использовать ТК с низкой молекулярной массой (ММ) и предпочтительно после действия ЧО [323, 324] (см. Приложение, 3.10.5). Следует помнить, что промывание объектов только водой не удаляет избытка ТК, поэто­му требуется обработка сульфатом натрия.
   Для постфиксации иногда используют смесь ЧО и феррициа-нида калия, при этом обеспечивается хорошее выявление не толь­ко мембран, но и хроматина, однако рибосомы и некоторые фиб­риллярные структуры не окрашиваются. Для их визуализации необходимо контрастировать объекты уранилацетатом (УА) [12, 178] (см. Приложение, 3.10.1).
  

1.3.3. Буферные растворы

   Важнейшее значение для качественной фиксации имеет состав буферных растворов, используемых для приготовления фиксато­ров (см. Приложение, 2.2). К примеру, при фиксации в альдегидах и дофиксации в ЧО растворы лучше приготавливать на одном и том же буферном растворе с одинаковыми значениями рН и осмо-лярности, а при ЭМ-исследовании клеток культуры фиксатор желательно готовить на культуральной среде. Составляющие буфера для фиксатора рекомендуется готовить ex tempore. Сахаро­зу (3-6 %) и глюкозу (4 %) следует растворять непосредственно перед употреблением [178, 193].
   Буферные растворы фиксаторов должны отвечать следующим требованиям: 1) обеспечивать сохранение рН в пределах от 6.0 до 8.0; 2) плохо проникать через клеточные мембраны; 3) иметь низ­кую ионную силу; 4) характеризоваться отсутствием субстанций, реагирующих с компонентами фиксатора; 5) величина диссоциа­ции не должна зависеть от концентрации; 6) устойчивость к окси­дации, стабильность; 7) дешевизна и легкость приготовления. Если во время фиксации живой ткани не используются буферные растворы, то рН фиксирующего раствора быстро падает. Примене­ние буферных систем, которые поддерживают рН на уровне физи­ологических значений (7.2-7.4 для большинства тканей млекопи­тающих), существенно снижает повреждающее действие фикса­ции. Очень удобно определять рН фиксирующих растворов с по­мощью добавления к ним нейтрального красного, который имеет малиновый цвет при рН от 7.1 до 7.6 [193] (см. Приложение, 1.1).
   В ЭМ чаще всего используются фосфатные буферы (ФБ), а также S-коллидиновый, трис-малеатный и какодилатный буфер­ные растворы. ФБ принято считать "физиологическими буфера­ми", поскольку их составляющие содержатся в живых организмах. Они стабильно поддерживают рН на уровне 7.4 и обладают высо­кой буферной емкостью, но плохо держит рН выше 7.5. Недостат­ком ФБ является и то, что при их использовании иногда (особенно при цитохимических методиках) образуются осадки. Кроме того, ФБ непригодны для приготовления растворов УА. ФБ в процессе хранения часто зарастает микроорганизмами и грибами. Поэтому после приготовления ФБ желательно отфильтровать, прокипятить и хранить при t=4®С. Такой буфер сохраняет рН в течение нес­кольких недель. Смесь КН2РО4 + Na2HPО4 более устойчива, чем смесь одних натриевых солей [178].
   Какодилатный буфер (КБ) пригоден как для осмиевых, так и для альдегидных фиксаторов. КБ легко готовить, он стабилен при хранении, но непригоден для приготовления растворов УА. КБ эф­фективен в интервале значений рН от 6.4 до 7.4, широко исполь­зуется в ЭМ-гистохимии, поскольку удаляет из тканей ионы фосфата, не зарастает грибами, так как содержит мышьяк, оказы­вает сильное токсическое влияние (осторожно!) на живые клетки [70, 178].
   Коллидиновый буфер (используют только очищенный S-коллидин) позволяет не применять осмотические добавки, стабилен даже при комнатной температуре, не меняет рН в течение года, способствует проникновению фиксатора в ткани и не зарастает бактериями и грибами в течение длительного времени. Однако он токсичен и имеет неприятный запах. Коллидиновый буфер эффек­тивен в интервале рН от 6 до 8. Он способствует экстрагированию фосфолипидов и протеинов. Смесь ФА с коллидином может по­вреждать мембраны [178, 193].
   Веронал-ацетатный буфер широко применялся ранее. Он ока­зался непригодным для альдегидных фиксаторов, поскольку реак­ция, происходящая между фиксатором и буфером, лишает послед­ний буферных свойств. Как веронал-ацетатный буфер, так и Трис-буфер вступают в химическую реакцию с альдегидами. Веронал-ацетатный буфер плохо растворим в воде, и поэтому кон­центрированные растворы приготовить сложно. Необходимы ос­мотические добавки. Использование веронал-ацетатного буфера ухудшает условия окрашивания полутонких срезов (ПС). Веронал-ацетатный буфер эффективен в интервале рН от 4.2 до 5.2 [178].
   Буферы на базе сложных органических веществ, называемых Трис, ГЕПЕС и ПИПЕС, применяют в ЭМ реже, в основном в тех случаях, когда требуется длительная фиксация материала. Органи­ческие буферы могут реагировать с ЧО. Они несколько уменьша­ют экстракцию компонентов клеток, делая их более электронно-плотными. ПИПЕС используют, если важно сохранить липиды мембран. Трис-буфер плохо удерживает рН ниже 7.5 и вступает в реакцию с альдегидами. При повышении температуры его рН, как правило, снижается, однако повышение концентрации буфера уве­личивает буферную емкость системы и предупреждает падение рН [70, 178, 193].
  

1.3.4. Осмотическое давление

   Важное значение для сохранности тканей и клеток имеет осмолярность фиксатора. При неправильном подборе осмолярности появляется множество артефактов: клеточные органеллы сморщи­ваются (если раствор гипертонический) или набухают (если рас­твор гипотонический) [231].
   Концентрация ионов в растворе равна молярной концентрации растворенного вещества, умноженной на число частиц, образую­щихся при диссоциации каждой молекулы, и пропорциональна осмотическому давлению (см. Приложение, 1.2). Однако эта. зависимость не является линейной. В растворе молекулы и ионы взаимодействуют друг с другом. С другой стороны, осмотическое давление раствора, содержащего белки и соли, сильно отличается от осмотических свойств раствора, содержащего только электроли­ты. Осмотическое давление плазмы крови составляет приблизи­тельно 0.3 Осм. Это давление является изотоническим (т. е. в нем клетки не меняют свой объем). Таким же действием обладает 0.16 М (0.9 %-ный) раствор NaCl. Эффективное осмотическое давление (ЭОД), например для ГА, можно вычислить по формуле: ЭОД - (мОсм ГА : 2) + мОсм растворителя. Общая осмолярность фиксатора включает осмолярность буфера и фиксирующего аген­та. Чаще всего наилучшие результаты дает слегка гиперосмолярный фиксатор. Для большинства тканей осмолярность буферных растворов может варьировать от 0.05 до 0.2 мОсм. Однако клас­сический фиксатор Карновского имеет общую осмолярность 2010 мОсм. [70, 193].
   Наиболее чувствительными органоидами к осмолярности яв­ляются митохондрии: они "чувствуют" изменения в 20 мОсм. В нативных условиях клеточная мембрана обладает свойством изби­рательной проницаемости для различных ионов. В процессе фиксации осмолярность фиксатора в тканях меняется: фиксатор мо­жет разводиться внутриклеточной жидкостью. В некоторых тканях, например в почке, имеются клетки с разной осмолярностыо.
   Осмолярность не зависит от температуры. Если растворы не диссоциируют, то молярность равна осмолярности. Из-за того что диссоциирующие на ионы вещества могут взаимодействовать, их осмолярность меньше, чем расчетная. Следовательно, растворы одинаковой молярности могут иметь разную осмолярность. Экс­периментально показано, что оптимум осмолярности фиксирую­щих растворов лежит в интервале 285-540 мОсм. При увеличении или снижении осмолярности вне этого интервала в клетках обнаруживаются повреждения митохондрий и гладкой эндоплазматической сети [180]. Нежелательно, чтобы общая осмолярность фиксатора превышала 500 мОсм, а растворителя 300 мОсм. Для лучшей сохранности ультраструктур к фиксаторам, особенно содержащим ФА и ЧО, рекомендуется добавлять сахарозу или глюкозу. 05 М сахароза имеет осмолярность 670 мОсм. К этим цифрам следует добавить величину осмолярности среды, в кото­рой растворен фиксатор. Поливинилпирролидон и декстран, добавляемые в фиксатор, предупреждают отек клеток [23, 178].
   Добавление к фиксатору NaCl ухудшает качество фиксации, так как в раствор вносятся свободно перемещающиеся ионы, несущие электрический заряд. Добавление сульфата аммония и КН2РО4 к фиксатору стабилизирует нативную конформацию протеинов. При добавлении к фиксатору CaCh (например, 10 ммоль/л) наблюда­ется: 1) уменьшение набухания клеточных компонентов; 2) улуч­шение сохранности клеточной формы; 3) уменьшение экстракции клеточного материала; 4) стабилизация мембран. В то же время, поскольку CaCh стимулирует секрецию и сокращение гладкомышечных клеток, его заменяют на MgCb. Кроме того, MgCb не вызывает преципитации протеинов. Сахароза и поливинил­пирролидон ингибируют активность некоторых ферментов [178, 193].
   Лучше всего использовать растворитель с осмолярностью 295-310 мОсм/л. В случае использования ГА наилучшие резуль­таты получены при осмолярности фиксатора около 300 мОсм. Из­менения концентрации ГА от 2 до 5 % не оказывают заметного воздействия на структуру интактной ткани, особенно в присутст­вии оптимального по осмолярности растворителя. Считается, что молекулы самих фиксаторов не оказывают существенного влия­ния на осмолярность фиксирующих тканей. Поэтому варьируют составом буферных растворов. Однако это справедливо в основном для ГА, который быстро связывается с реакционноспособными группировками в тканях. ФА не обладает такой афинностью как ГА, и может на начальных этапах фиксации вносить вклад в осмолярность фиксатора.
   Точно сказать, какое влияние на клетки и ткани оказывают различные компоненты фиксатора, невозможно. Поэтому чаще всего осмолярность подбирается опытным путем. Когда для фик­сации используют ЧО, в ткани сначала проникает среда, в которой растворено фиксирующее вещество, а затем - более тяжелые моле­кулы ЧО. Если применяют метод двойной фиксации, например фиксируют сначала в ГА, а затем осмием, то целесообразно ис­пользовать один и тот же буфер для обоих фиксаторов. При оптимальной осмолярности буферного раствора фиксатора повышение или понижение концентрации альдегида и какодилатного буфера на 50 % мало влияет на сохранность структуры клетки [23].
  

1.3.4.1. Промывание

   Спорным является вопрос о том, необходимо ли отмывать первый фиксатор перед постфиксацией в ЧО. Ряд авторитетных исследователей считают, что для промывания лучше использо­вать умеренно гипертонические растворы. Другие вообще этому вопросу не придают большого значения, так как полагают,, что после фиксации вряд ли важно соблюдать изотоничность растворов.
   Тем не менее в большинстве случаев после префиксации ткани в альдегиде ее промывают в буфере, осмолярность которого долж­на . соответствовать 350 мОсм. Это снижает осмотический шок между гипертоническим ГА и изотонической ЧО [65, 105, 178, 193]. Для сохранения изотоничности следует применять сахарозу. В качестве промывающего раствора лучше всего использовать тот же буферный раствор, что и для приготовления фиксатора. Про­мывание объектов рекомендуется проводить не менее чем в трех сменах раствора. Неотмытый фиксатор создает мелкий зернистый фон на ЭМ-изображениях. Промывание в течение ночи полностью удаляет непрореагировавший ГА [23, 28, 193].
  

1.3.5. Способы химической фиксации

1.3.5.1. Перфузионная фиксация

   Преимуществами перфузионной фиксации являются, во-первых, быстрая и однородная доставка фиксатора к тка­невым элементам (при этом меньше влияют диффузионные градиенты и последствия ишемии), во-вторых, сохранение естественных взаимоотношений в ткани, что снимает проблемы дисторсий, вызванных сосудистым коллапсом. Она незаменима при СЭМ нативных препаратов. Однако перфузионная фиксация имеет следующие ограничения: 1) трудности при ее осуществ­лении на человеческом материале; 2) невозможность примене­ния на бессосудистых тканях; 3) ограниченность использова­ния на биопсийном материале; 4) необходимость адекватной анестезии или анальгезии (между тем, до сих пор не совсем по­нятно влияние анестетиков на субмикроскопическую организа­цию тканей); 5) трудоемкость и необходимость соответствую­щего оборудования; 6) большая опасность для исследователя (лучше всего делать перфузию под вытяжным шкафом); 7) воз­можность изменения объема объектов, что связано с онкотическими воздействиями; 8) отек, вызванный фильтрацией фикса­тора в ткань; 9) неоднородность перфузии. К недостаткам пер­фузии следует отнести также большой расход реактивов [23, 178, 192].
  

1.3.5.1.1. Отмывание

  
   Необходимость удаления крови из сосудистого русла обуслов­лена тем, что белки и форменные элементы крови при фиксации осаждаются на поверхности эндотелия и затрудняют изучение объекта, особенно в СЭМ. В большинстве исследований для отмывания крови применяются сбалансированные солевые растворы (Хэнкса, Эрла, Рингера, среда 199, ФБФР и т.д.) с добавлением гепарина (см. Приложение, 2.1). Гепарин используется в дозе 05-1.0 мл на 1 кг массы тела. Гепарин уменьшает число кратеров и пузырей на поверхности эндотелия. Однако обнаружен и Проти­воположный эффект. Одним из способов исключения прямого контакта гепарина при его высоких концентрациях с эндотелиоцитами является внутримышечное введение до начала эксперимента [23].
   Дискуссионным остается также вопрос о необходимости вклю­чения в промывающие растворы онкотических добавок: альбуми­на, декстрана, поливинилпирролидона и т.п. Эти вещества в ряде случаев вызывают гистаминоподобный эффект и могут изменять заряд на поверхности эндотелия. Одна из причин противоречиво­сти данных, касающихся микрорельефа эндотелия, кроется в от­сутствии стандартизации всех используемых промывающих рас­творов. Наиболее подходящими растворами для отмывания крови являются среда 199, растворы Хэнкса и Эрла (рН 7.2-7.5). Во время промывания перфузионное давление должно поддерживать­ся на уровне среднего артериального. Длительность процедуры не должна превышать 1-1.5 мин, если это время оказывается недостаточным, то необходимо к промывочной жидкости добавить 1-2 % поливинилпирролидона или альбумина и раствор подверг­нуть оксигенации. Перфузия сосудов оксигенированным сбалан­сированным солевым раствором, содержащим метаболиты и нейт­ральные онкотические добавки (например, сыворотки), в течение 5-10 и даже 60 мин не вызывает структурных повреждений эндотелиоцитов [23, 178, 193].
   Не менее важен и вопрос о введении в промывающий раствор спазмолитиков. Для предупреждения спазма сосудов применяется новокаин. Хорошим релаксантом является MgCb. В качестве вазодилятатора можно использовать нитрит натрия, который добавля­ют в промывочную жидкость (0.5 мл 1%-ного раствора на 200 г массы животного). В этом случае возможно блокирование функ­ции артериол. Наиболее подходящим спазмолитиком является ксилокаин. Для определения степени проникновения промываю­щего раствора и фиксатора в ткани к ним можно добавлять каплю 1%-ного раствора трипанового синего.
   Материал, маскирующий микрорельеф изучаемой поверхно­сти в СЭМ, можно также удалять тонким пинцетом или обработ­кой свежей либо фиксированной ткани тестикулярной гиалурони-дазой или коллагеназой I типа. Для очистки поверхности объектов от слизи и других загрязняющих структур можно использовать ультразвук или струю жидкости. После высушивания слизь можно сдуть чистым сухим инертным газом. Слизь обычно удаляют на стадии препарирования объектов в 80%-ном этаноле [23, 178].
  

1.3.5.1.2. Введение фиксатора

   После удаления крови сосуды перфузируют фиксирующим раствором. В ряде случаев можно не удалять кровь полностью, а сразу начинать перфузию фиксаторами. Однако при этом поверх­ность эндотелия иногда покрывается прилипшими клетками крови. Если перфузионная фиксация проводится без отмывания крови, то в первые 10-15 с перфузионное давление должно быть повышено. Этим же способом можно предупредить коллапс сосу­дов и полнее удалить из них кровь. Особенностью препарирования органного трупного материала в связи с особой чувствительно­стью переживающих тканей к промыванию является использова­ние для отмывания сосудов от крови разведенного фиксирующего раствора [3].
   Чтобы сохранить детали строения поверхности эндотелия, очень важно начать перфузию прижизненно, постоянно контроли­руя давление внутри сосуда, особенно в момент начала введения фиксатора. Для предупреждения развивающегося в это время опистотонуса животным за несколько секунд до фиксации вводят суксаметоний или другой миорелаксант. Иногда промывают сосуды раствором, содержащим сильно разведенный фиксатор. Для боль­шинства целей достаточно 5-минутной перфузии фиксатором, после чего кусочки органа могут быть вырезаны из ткани и поме­щены в свежую порцию ГА [23, 178].
   Величину перфузионного давления лучше поддерживать на уровне среднеартериального или систолического давления, свойст­венного данному животному. Если фиксация осуществляется под давлением, равным диастолическому, то продольные складки сосудов становятся более глубокими, а использование перфузион­ного давления ниже диастолического приводит к появлению вере­тенообразных эндотелиоцитов. Локальное внутрисосудистое давле­ние должно быть равно локальному систолическому артериально­му давлению. Однако чрезмерно длительная перфузионная фиксация под физиологическим давлением ведет к растяжению просвета сосудов. В течение 2-часовой перфузии раствором ГА происходит увеличение диаметра артерий и других сосудов. Коле­бания давления в сторону повышения могут также существенно повреждать поверхность эндотелия.
   Необходимо, чтобы гидродинамические параметры перфузии тщательно контролировались перед введением фиксатора и во время фиксации, а также чтобы сосудистые реакции, вызываемые действием фиксатора, были известны. Для прикидочной оценки необходимого количества перфузионного раствора нужно исхо­дить из следующего эмпирического правила: количество перфу­зата должно составить 15 % от массы тела; 5 % от массы головы и 1-2 % от массы мозга. Перфузат желательно оксигенировать, но следует избегать попадания пузырьков воздуха в систему. Сосуды с растворами должны быть достаточно емкими, чтобы их не надо было заполнять во время работы. В системе необходим фильтр.
   Лучшие результаты дает ретроградное введение полиэтилено­вой канюли в общую подвздошную артерию. К сожалению, такой подход применим только для мелких лабораторных животных. Да­же в случае кроликов и кошек, когда требуется большой расход фиксатора, этот метод оказывается малопригодным. Одним из выходов из данного положения может быть перевязывание всех ветвей аорты, не используемых в данном эксперименте, или пере­жатие крупных коллатеральных сосудов исследуемой области [23, 177, 178].
   При работе с мелкими лабораторными животными удобно ис­пользовать перфузию через аорту. Для этого наркотизированному животному двумя окологрудинными разрезами вскрывают груд­ную клетку (в это время спонтанное дыхание прекращается). На основание образовавшегося лоскута передней грудной стенки на­кладывают зажим Кохера и над зажимом лоскут иссекают. Вскры­вают перикард.
   Под восходящую аорту подводят лигатуру. Вскрывают левый желудочек и через полость вводят канюлю в аорту. Закрепляют ка­нюлю лигатурой. Пускают фиксирующий раствор. Вскрывают правое предсердие для оттока раствора. Брюшная аорта для эконо­мии раствора может быть пережата. Время с момента прекраще­ния спонтанного дыхания до момента введения фиксирующего раствора в аорту не должно превышать 15 мин. Рекомендуется ис­пользование искусственного дыхания и гипотермии. При экспери­ментах на более крупных животных целесообразно применять местную перфузию, вводя фиксатор в сонные или позвоночные артерии (для мозга). Давление фиксирующего раствора при выхо­де из канюли не должно превышать общего артериального давле­ния животного более чем на 10-15 %. После перфузии рекоменду­ется дофиксировать материал погружением в тот же фиксирую­щий раствор [23, 178, 193].
   Канюлировать левый желудочек сердца можно особыми каню­лями с ободком на конце, которые после прокола захватываются сокращающимся миокардом и надежно крепятся в стенке сердца. Однако при исследовании крупных кровеносных сосудов канюлирование сердца опасно тем, что в момент введения канюли проис­ходит падение давления в сосудистой системе. Кроме того, вскры­тие грудной полости приводит к пневмотораксу и гипоксемии. По этим же причинам неадекватна перфузия, начатая после умерщв­ления животного. Для фиксации печени лучше всего использовать перфузию через воротную вену под низким давлением. Для сосу­дистой перфузии желательно использовать альдегиды в более низ­ких концентрациях (1 % ФА + 1 % ГА). Многое зависит от того, какой исследуется орган. Так, для предупреждения артефактов при перфузионной фиксации центральной нервной системы рекомен­дуется вначале использовать концентрированный раствор ГА (до 19 %), а через несколько десятков секунд - раствор обычной кон­центрации [178, 371]. Наиболее оптимальная фиксация клубочков и проксимальных канальцев в почках достигается с помощью пер­фузионной префиксации 3%-ным раствором ФА на ФБ (осмоляр­ность 1100 мОсм, рН 7.1), дофиксации в этом же растворе и пост­фиксации в 1%-ном растворе ЧО на ФБ [315].
   Таким образом, принципиально важными моментами началь­ных этапов перфузионной фиксации являются ограничение вре­мени отмывания сосуда, использование перфузионной фиксации in situ при условии поддержания перфузионного давления на уров­не среднеартериального, а также фиксирующих растворов с рН в пределах 7.1-7.6 и осмотичностью 300-600 мОсм. Для исследова­ния (после перфузионной фиксации) в СЭМ лучше брать крупные кусочки.
   Это позволяет точнее локализовать повреждения и сравнивать их с окружающей нормальной тканью. Введение в перфузат онкотических добавок предупреждает расширение межклеточных про­странств. Так, при фиксации тканей мозга необходимо добавление поливинилпирролидона [23].
   При проведении экспериментальных работ, в которых требу­ются исследования органа с помощью других методов, можно рекомендовать перфузионную фиксацию части (сегмента) органа. Для этого игла соответствующего диаметра вставляется в крупный кровеносный сосуд или тщательно прижимается к его входу, от­мывание (до 30 с) и перфузию (3-5 мин) сосудистого русла про­водят под давлением 20-30 мм рт.ст. Если у извлекаемого органа сохраняется питающая его артерия, то последняя канюлируется, и орган отмывается от крови и перфузируется фиксатором. Перфузионное давление для органов, имеющих единое магистральное кровоснабжение, не должно превышать 80 мм рт.ст., в других слу­чаях оно должно быть ниже 60 мм рт.ст.
  

1.3.5.2. Иммерсионная фиксация

  
   В большинстве руководств по ЭМ для иммерсионной фикса­ции рекомендуется новым лезвием бритвы нарезать кусочки тол­щиной менее 1 мм и погрузить их в ГА. Резать надо на парафине, тефлоне или на вощеной бумаге, реже используется корковая пла­стинка. Ткань следует быстро погрузить в фиксатор. Ни в коем случае нельзя дать образцу подсохнуть. Соотношение объемов об­разца и фиксатора должно быть 1 : 10. Фиксацию можно прово­дить при комнатной температуре. Для лучшего проникновения фиксатора желательно фиксирующий раствор с объектом помеши­вать. Можно начинать капать фиксатор на образец до его выреза­ния из организма.
  
   Мы рекомендуем после обнажения органа нанести на него несколько капель фиксатора и провести точно ориентированный разрез так, чтобы поверхность среза сразу стала хорошо доступной для фиксатора. Ткань должна быть разрезана свежим лезвием бритвы одним движением. Разрезанный таким образом образец иссекается и помещается в пузырек с фиксатором. Затем с помощью лезвия бритвы осторожно срезается тонкая (толщиной не более 1 мм) пластинка ткани. Можно использовать специаль­ные приспособления с ограничителями. Пластинка помещается в свежую порцию фиксатора и подвергается дальнейшим манипуля­циям. При проведении гистохимических и иммуногистохимических исследований применяется изготовление срезов в вибратоме [178, 193].
  

1.3.5.3. Инъекция

  
   Метод инъекции сохраняет внутреннюю структуру органа луч­ше, чем метод накалывания. Для этого обычно охлажденный фик­сатор вводится в ткань с помощью шприца или микропипетки [164].
  

1.4. МИКРОВОЛНОВОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ (МВИ)

   В последние годы в ЭМ для ускорения проникновения фикса­тора в клетки и ткани применяют МВИ с диапазоном частот от 300 МГц до 300 ГГц. МВИ используется для стабилизации ткани, ускорения процесса препарирования, быстрой остановки метаболических процессов. Образцы после микроволнового облучения некоторое время могут храниться при t= 4®С, затем для ТЭМ они должны постфиксироваться в ЧО. МВИ применяется не только при фиксации, но и при обезвоживании, окраске и иммуномечении [58, 101, 222, 233, 276].
  

1.4.1. Механизмы действия МВИ

   МВИ увеличивает скорости диффузии растворов и химических реакций. Изменение внутренней температуры реагентов является ключевым механизмом этого процесса. Использование МВИ во время фиксации альдегидами приводит к тому, что, во-первых, альдегиды из полимеров переходят в мономеры, во-вторых, увели­чивается скорость их проникновения в ткани, в-третьих, ускоря­ются химические реакции фиксирующих растворов с компонента­ми тканей. Механизм действия МВИ во время фиксации расшиф­рован не полностью. МВИ нагревает ткань и окружающую жидкость, что приводит к увеличению текучести липидов в мембранах, способ­ствует ориентации полярных групп в сторону водной фазы и тем самым облегчает их реакцию с 40. МВИ увеличивает скорость диффузии ЧО за счет осцилляции (2450 млн в секунду) молекул, которые связывают Os, а это приводит к ускорению перемещения ЧО в тканях [241, 242].
   Сочетание МВИ с применением разбавленных альдегидных фиксаторов позволяет сохранять как субмикроскопическую орга­низацию, так и антигенные свойства тканей. Применение МВИ позволило показать, что наличие темных и светлых клеток в тка­нях является артефактом рутинной фиксации [222, 233]. Фиксиру­ющий эффект МВИ в ряде случаев сопоставим с результатами, получаемыми с помощью сверхбыстрого замораживания. Так, 1 изучение бактерий показало, что после параллельного воздействия химических фиксаторов и МВИ сохраняемость ультраструктуры такая же, как и при препарировании методом сверхбыстрого замо­раживания-травления [262]. МВИ дает хорошие результаты в гистоавторадиографии и рентгеновском микроанализе (РМА). В отношении сохранения ферментативной активности полученные ре­зультаты неоднозначны: некоторые ферменты резистентны к действию микроволн, например щелочная фосфатаза, другие быс­тро повреждаются (кислая фосфатаза, глюкоза-6-фосфатаза). С помощью МВИ можно фиксировать образцы размером до 1 см. Однако для лучшей фиксации тканевые блоки после воздействия МВИ должны инкубироваться в фиксаторе 10-60 мин для целей иммуно-ЭМ или ЭМ-гистохимии и 30-180 мин для обычного ультраструктурного анализа [258, 274].
   При воздействии МВИ физическое состояние биологических мембран изменяется, об этом свидетельствует диффузия ферментов из лизосом. В процессе фиксации с использованием МВИ антигены на поверхности клеток, выстилающих крупные полости, в ряде слу­чаев повреждаются. Кроме того, обнаруживается усиленная вакуоли­зация цитоплазмы, сопровождаемая вымыванием из матрикса гли­когена. Для предупреждения этого явления к фиксатору добавляют глюкозу или полиэтиленгликоль, что ведет к увеличению осмоляр­ности фиксатора и, по-видимому, уменьшает вибрацию молекул воды в тканях. МВИ позволяет также существенно ускорить процесс обезвоживания и инфильтрации, улучшить окрашивание образцов химическими реагентами, увеличить скорость диффузии антител и их реакции с антигенами [222, 274, 374].
  

1.4.2. Устройства для МВИ

   Чаще всего для фиксации (и проводки) образцов используют­ся бытовые микроволновые печи. Работы с установками для МВИ следует вести в вытяжном шкафу. Для получения воспроизводи­мых результатов перед началом работы в каждой данной микро­волновой печи и с каждой данной склянкой необходимо провести картирование температурного режима, а затем строго соблюдать выбранные режимы [241, 242].
  

1.4.3. Режимы фиксации

   Для обычной ТЭМ удовлетворительные результаты при фикса­ции с применением МВИ дают смеси ГА и ФА (см. Приложение, 3.10.9). Хорошая сохранность ультраструктуры клеток и тканей достигается в фиксаторе Карновского и ЧО в течение нескольких секунд (6-30 с). При фиксации образцов в ФА с использованием МВИ для гистохимического исследования наилучшие результаты получены при концентрации ФА 4-8 % и наличии в нем 10 % глю­козы или 5-10 % полиэтиленгликоля-2000 при 45-50®С и на­чальной температуре фиксатора 20®С. Скорость фиксации объек­тов по сравнению с обычной фиксацией увеличивается при этом в 10-40 раз. Для защиты структуры мембран от микроволновых по­вреждений в фиксатор добавляют небольшое количество CaCh или MgCh. Фиксатор, содержащий 0.05-0.1 % таниновой кислоты (ТК), эффективен для фиксации растворимых пептидов и протеи­нов. Некоторые ткани - хрящ, кость, зубы, легкие - требуют осо­бых режимов МВИ, поскольку вода и воздух, находящиеся в них, могут при нагревании быстро увеличить свой объем и повреждать ткань. Для таких тканей рекомендуют дробное облучение (4-5 раз по 5 с с интервалом в несколько секунд). После воздействия МВИ объекты немедленно должны быть помещены в холодный раствор [186, 242, 276, 374].
  

1.4.4. Температурный режим фиксации

  
   При использовании МВИ температура фиксатора является более важным параметром, чем продолжительность излучения. Под воз­действием микроволн объекты нагреваются значительно сильнее, чем окружающая жидкость. Скорость подъема температуры образца при этом зависит от интенсивности радиации, от диэлектрических свойств объекта и раствора, теплоемкости и термопроводности образца, его ориентации и формы и др. В камере необходимо иметь высокочувствительный термометр и таймер с миллисекундным от­счетом или использовать окрашенные красителем Гимза кусочки агарового геля, которые изменяют свой цвет с пурпурного на голубой при температуре 45-55®С (см. Приложение, 3.1). Максимальное нагревание объекта не должно превышать 35-40®С [242, 276].
  

1.5. ФИКСАЦИЯ И ИММУНО-ЭМ

1.5.1. Требования к фиксации

  
   Одной из основных проблем иммуно-ЭМ является необходи­мость одновременного сохранения антигенных детерминант и ультраструктуры тканей. ФА "нежно" фиксирует ткани, но плохо сохраняет их субмикроскопическую организацию. ГА обеспечивает хорошую сохранность ультраструктуры, но изменяет антиген­ные свойства и образует в тканях поперечные сшивки, которые уменьшают доступность антител к антигенам. Степень блокирова­ния антигенных детерминант прямо пропорциональна концентра­ции ГА. Если концентрация ГА минимальна (0.5 % и менее), то степень маскировки антигенов незначительна. В настоящее время наиболее широко используется чистый ФА или ФА в комбинации с ГА при низких (0.1-0.5 %) концентрациях последнего.
   Осмолярность и рН должны находиться в физиологических пределах. Для лучшего сохранения антигенных свойств можно использовать смеси ацетимидата и ФА, ФА и лизина-периодата, либо ГА и пикриновой кислоты. Поперечные сшивки белков, образуемые ФА, могут исчезать, если фиксированный кусочек инкубировать в буфере длительное время. Избыток ФА следует тщательно отмыть, а оставшиеся реактивные альдегидные группы подавить. В ряде случаев для блокирования свободных альдегидных групп после фиксации альдегидами ткань обрабаты­вают 0.05 М раствором хлористого аммония или раствором гли­цина (см. гл. 13). Фиксация при помощи ЧО ведет к фрагмента­ции полипептидов и часто к потере антигенных свойств [105, 178, 193].
   Добавление в формальдегидный фиксатор первичных аминов (циклогексиламина) улучшает сохранность ультраструктуры и ан­тигенных свойств [243]. Качество альдегидной фиксации можно значительно улучшить, если добавить в фиксатор лизин или имид. Карбодиимид взаимодействует со свободными карбоксильными и аминогруппами. ГА присоединяется прежде всего к аминогруп­пам. После фиксации объекта в ГА в тканях остается множество свободных альдегидных групп, которые могут связывать антитела [105, 193].
  

1.5.2. Блокирование остаточных альдегидных групп

   Для блокирования остаточных альдегидных групп исполь­зуются 0.1 М Трис-глициновый буфер (рН 7.2), 1%-ный свеже­приготовленный раствор борогидрида, 0.05 М глицин на физиоло­гическом растворе с ФБ (ФБФР), 1%-ный раствор бычьего сыворо­точного альбумина (БСА), свободного от глобулинов, 1%-ный овальбумин, а также неиммунная сыворотка от животного того же вида, что и донор второго антитела. Время инкубации в этих растворах обычно составляет 10-60 мин. Если фиксатор включает ГА, то объект лучше обработать борогидридом или глицином, так как это уменьшает число остаточных альдегидных групп. Обычно используют 1%-ный борогидрид или глицин в ФБФР [138]. Выбор метода фиксации определяется спецификой конкрет­ной реакции антиген-антитело и предполагаемой локализацией ( антигена [238].
  

1.6. ОСОБЕННОСТИ ФИКСАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

  
   Культивируемые клетки в ряде случаев фиксируют в парах фиксатора (см. рис. 1). Монослой клеток после альдегидной фик­сации можно легко отделить от дна чашки путем аккуратного соскабливания резиновой или мягкой пластмассовой пластинкой или шпателем. При этом разрушается ничтожная часть клеток. Остальные клетки после центрифугирования и дальнейшего препа­рирования обнаруживают хорошую сохранность ультраструктуры. Можно также нефиксированные культивируемые клетки аккуратно соскоблить с помощью резинового шпателя, а затем зафиксиро­вать [193].
  

1.7. ХРАНЕНИЕ ФИКСИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

   После фиксации изредка возникает проблема хранения фикси­рованного материала. Чаще всего хранение объектов после фикса­ции приводит к ухудшению качества получаемых ЭМ-изображений. Обычно накопление и хранение материала осуществляются в том же охлажденном буферном растворе, на котором готовился фиксатор. Однако ФБ при этом быстро зарастает микроорганизма­ми. Для предупреждения зарастания в фиксатор следует добавить 0.1-0.2 % ГА или ФА, конечно, если это не повлияет на антигенные свойства тканей.
  

1.8. АРТЕФАКТЫ 1.8.1. Артефакты, возникающие при взятии материала

   Критерием хорошей фиксации является отсутствие отека ци­топлазмы и органелл [315]. Причинами артефактов в этом случае могут быть интоксикация наркотическими веществами, болевой шок, нарушение кровообращения и длительное кислородное голодание, механические травмы. Эти артефакты в основном выража­ются в изменении нормальных геометрических соотношений структур, в наличии глубоких разрывов мембран клеток и клеточ­ных органелл, а также интерстициального отека с нарушением нормальной топографии тканевых элементов, в резком изменении осмиофильности и электронной плотности клеток, в набуханий митохондрий и пресинаптических терминалей с характерной перегруппировкой синаптических пузырьков и т.п. [11, 121].
   Для предупреждения этих явлений необходимо обеспечить адекватные условия наркоза и умерщвления животных, меньшую травматичность выделения кусочков тканей, быстроту вырезания и погружения их в фиксирующий раствор.
   Механические манипуляции с препаратами ведут к повреждениям клеток и тканей. Гипоксия также вызывает альтерации ультраструктур. Везикулы могут возникать в результате разрыва и последующего слияния мембран [11, 121].
  

1.8.2. Артефакты, возникающие при фиксации

   Эти артефакты чрезвычайно многочисленны и разнообразны. К наиболее частым из них относятся прерывистость плазматиче­ских мембран (на больших увеличениях мембраны имеют вид штриховых линий), набухание цистерн эндоплазматической сети, матрикса и полостей крист митохондрий, вакуолизация цитоплаз­мы, набухание тел клеток, ядер и отростков, извилистость конту­ров мембран. Часто погрешности при взятии материала или фик­сации проявляются в виде характерных аутолитических изменений.
   Причины этих артефактов в основном обусловлены неправиль­ным выбором способа фиксации, использованием старых или грязных растворов, ошибками в процессе приготовления фиксиру­ющего раствора, неадекватными значениями рН и осмолярности, неправильным проведением фиксации (например, неадекватными длительностью и температурой, низким давлением фиксирующей жидкости при перфузии) и т.д. Изменения объема, вызванные осмолярностью фиксатора, как правило, обратимы. Искусственные нарушения структур могут возникать как до, так и после фикса­ции. Тем не менее часто бывает очень трудно определить, где и когда возник артефакт [11, 121].
  

1.8.3. Артефакты, связанные с иммерсионной фиксацией

   Гипоксия вызывает разбухание элементов эндоплазматической сети, митохондрий и других органоидов. Промывание сосудистого русла гипертоническим раствором существенно меняет строение плотных соединений эндотелия, открывая их, а промывание поло­стей растворами с низкой температурой ведет к сглаживанию рельефа поверхности клеток [177, 178]. Время между моментом прекращения кровотока и моментом начала фиксации не должно превышать 15 мин [121, 132].
  

1.8.4. Артефакты, обусловленные постфиксацией

   При недостаточной фиксации в ЧО мембраны не имеют трех­слойного строения. При слишком длительной фиксации теряется четкая структура мембран. Длительная альдегидная фиксация и сильное осмирование приводят к образованию гранулярного изображения в ТЭМ, что обычно рассматривается как артефакт [11, 121,212].
   Глава 2 ЗАМОРАЖИВАНИЕ
  

2.1. МЕХАНИЗМЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

   Процесс замораживания является важнейшим этапом многих методов ЭМ в биологии. Сложность и многоступенчатость этого процесса связаны с многокомпонентностью объектов и соответст­венно с различной температурой перехода компонентов из жидко­го состояния в замороженное. Некоторые из них, например вода, при различных скоростях охлаждения переходят в разные состоя­ния, отличающиеся конечной структурой и занимаемым объемом. Замораживание стабилизирует биологические образцы, но в то же самое время может существенно их повреждать. Это обусловлено кристаллизацией воды, которая разрушает клеточные структуры. Криофиксация относится к процессам иммобилизации биологи­ческих объектов с помощью очень быстрого охлаждения, при этом кристаллы льда либо вообще не образуются, либо эти кристаллы достаточно малы, чтобы не вызвать существенных структурных повреждений. Криофиксация оказывает на образец только физиче­ское влияние. Поэтому правильнее говорить не о криофиксации, а о криоконсервации, или криостабилизации. Прекращение крово­тока и иссечение ткани быстро ведет к потере и перераспределе­нию ионов. Поэтому разработаны методы замораживания in situ, например с помощью охлажденной полой иглы [32, 303, 337].
   Криофиксация имеет следующие преимущества: 1) сохраняет нативный состав элементов в объекте; 2) блокирует скоротечные биохимические и морфологические изменения; 3) предупреждает денатурацию белков; 4) дает возможность препарировать и изучать образцы в их естественном состоянии и окружении; 5) делает образцы твердыми, что позволяет изготавливать УС или сколы. Желательно замораживать объекты in situ [302].
   Можно выделить три состояния замороженных объектов: 1) возникающий лед имеет макрокристаллическое строение (раз­мером кристаллов более 3 нм); 2) образуются микрокристаллы льда (2-3 нм); 3) лед приобретает аморфную структуру (электрон-но-микроскопически кристаллы не определяются). Для большин­ства ЭМ-исследований первое состояние не пригодно из-за повреждения ультраструктур. Для практических целей достаточно достижения второго состояния. С физической точки зрения, толь­ко аморфное состояние льда отвечает идеальной криофиксации [32].
   Достигаемое состояние льда в тканях образца определяется скоростью охлаждения, которая в свою очередь лимитируется тре­мя факторами: 1) теплоемкостью образца, 2) теплопроводностью воды и 3) скоростью отвода потока тепла от препарата. Быстрое замораживание дает много мелких кристаллов, медленное - мало, но крупных. Очевидно, что в биологических исследованиях может быть изменен только первый (уменьшение объекта) и последний параметры, поскольку замена воды другим растворителем резко меняет свойства биологических мембран, приводя к потере мно­гих возможностей метода замораживания-скалывания. Теоретиче­ски скорость отвода тепла от поверхности образца может достигать 10®С/с и более. Однако с увеличением расстояния от поверхности скорость охлаждения составляет не более 10®С/с. На рассто­янии 10 мкм величина этого параметра падает до 10®С/с. Однако на практике эти цифры существенно ниже [32].
   В случае чистой воды для достижения состояния витрификации необходима скорость охлаждения 10®С/с. При этом толщи­на слоя, в котором данный эффект будет обеспечен, составит не более 100 нм. Клетки и ткани требуют скорости охлаждения не менее 104®С/с и могут быть удовлетворительно криофиксированы в слое толщиной 10 мкм и менее. В то же время если такие образцы защитить криопротекторами, то требуемые скорости могут составлять 100®С/с, а достижимая глубина витрификации будет 1000 мкм [32]. Проверка указанных параметров на биологи­ческих тканях показала, что, например, на заднем эпителии роговицы при обычном препарировании кристаллы льда начина­ют формироваться уже на глубине 3 мкм. Скорость охлаждения 6000-10000®С/с предотвращала образование льда в цитоплазме, но в вакуолях он формировался даже на глубине 1 мкм [32].
   Размеры образующихся кристаллов зависят от величины, интервала между точками замерзания воды и ее витрификации. Когда температура объекта после достижения точки замерзания снижается медленно, кристаллы льда образуются крупные. Если скорость отвода тепла больше, чем скорость его выделения, то рост кристаллов уменьшается. При t=-40®С система входит в зону гомогенной кристаллизации, когда каждая молекула воды стано­вится потенциальным центром кристаллизации. Поскольку таких центров много, то размеры кристаллов лимитированы. В чистой воде зона кристаллизации расположена в температурном интерва­ле от 0 до -133®С. Величина интервала зависит от количества воды в биологических объектах, например в морозостойких клетках, где содержание воды уменьшено, зона кристаллизации находится между -13 и -43®С. Быстрое замораживание позволяет стабили­зировать ткани в состоянии, близком к естественному. В этом слу­чае практически не возникает осмотического повреждения и пре­ципитации белков. Единственным строгим и надежным методом контроля за качеством замораживания является анализ гидратированных замороженных Y.C методом дифракции электронов [32].
  

2.2. МЕТОДЫ БЫСТРОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ

   Быстрое замораживание образцов реализуется с помощью ряда приемов: 1) погружение в охлажденную до сверхнизких темпера­тур промежуточную жидкость - криоген; 2) разбрызгивание крио-гена на образец; 3) распыление объекта на охлажденную жидкость; 4) метод "сандвича"; 5) замораживание объекта на охлажденном металлическом зеркале; 6) замораживание при высоком давлении. Подробное описание технических деталей методов и устройств для замораживания приводится в монографиях и обзорах [32, 75, 285, 304].
  

2.2.1. Использование криогенов

  
   В качестве криогенов обычно применяются углеводороды и флюорокарбоны (фреоны, изопрены, пропан и др.), которые пред­варительно охлаждаются в жидком азоте, кислороде или гелии (рис. 2). На практике для этой цели объект обычно погружают в пропан или фреон-22, охлаждаемые в жидком азоте. Фреон-22 замерзает при t=-164®С, пропан при t=-190®С, жидкий азот при t=-210®С. Скорость замораживания при использовании пропана достигает 19100®С/с, фреона-22 - до 9000®С/с, фрео­на-12 - до 6580®С/с, шуги (затвердевающий жидкий азот) - до 1700®С/с. Пропан является более эффективным криогеном, так как скорость охлаждения в нем выше. Для быстрого замораживания не применяется жидкий азот, поскольку при погружении в него объекта образуется газовая прослойка, обладающая термо­изолирующими свойствами. Однако жидкий азот в суперкри­тическом состоянии при температуре, близкой к точке плавления (t=-210®С), и при давлении, превышающем критическое 1(335 атм), иногда используют в качестве криогена. Для этих целей разработаны специальные установки [298].

0x01 graphic

   Рис. 2. Устройство для быстрого замораживания объектов. 1 - медный стержень, погруженный в жидкий азот; 2 - камера с криогеном; 3 - сжиженный криоген; 4 - объект; 5 - контейнер; 6 - жидкий азот; 7 - баллончик с криогеном.
  
   Обычно объекты замораживают во фреоне-12 (или во фреоне-22). Фреон-12 - это газ, становящийся жидким при t=-30®С при атмосферном давлении. Перед использованием его сжижают, пропуская через медную трубку, отрезок которой погружен в жидкий азот; конец трубки выведен в металлический контейнер, плавающий на поверхности жидкого азота в сосуде Дьюара [65]. При погружении объектов на металлическом блоке в криоген луч­ше пользоваться пластмассовым пинцетом. Перемешивание крио-генов значительно увеличивает скорость охлаждения [32, 300, 304].
  

2.2.2. Использование принципа пульверизатора

   В процессе исследования суспензий одиночных клеток и кле­точных органелл размеры объектов легко уменьшить до 10 мкм, при этом их можно быстро заморозить, разбрызгивая раствор пульверизатором на полированную поверхность охлажденного металлического блока [32].
  

2.2.3. Метод "сандвича"

   Разработана методика сверхбыстрого замораживания взвеси объектов в жидком пропане с помощью метода "сандвича": взвесь помещают в щель шириной не более 10-15 мкм между двумя мед­ными пластинками, толщина которых 50 мкм, и быстро погружа­ют в интенсивно перемешиваемый жидкий пропан. "Сандвич" можно также охлаждать струей охлажденного пропана. Наиболее эффективным оказался метод "сандвича" с двухсторонним охлаж­дением. В этом случае тонкий кусочек ткани или монослой клеток помещают между двумя полированными медными пластинками, которые с двух сторон охлаждаются струями пропана [32, 120, 300, 304].
  

2.2.4. Метод холодного блока

   На практике метод сверхбыстрого замораживания образца с применением металлического зеркала может быть реализован сле­дующим образом. Стержень с полированной поверхностью нахо­дится под жидким гелием. На короткое время стержень поднима­ют над поверхностью гелия и касаются его полированной поверх­ностью объекта. Затем стержень вместе со слоем примороженной ткани снова погружают в жидкий гелий (вместо гелия может быть использован азот), где объект хранится до последующего препари­рования. При таком охлаждении кристаллы льда в образце не обнаруживаются до глубины 5-12 мкм. В настоящее время суще­ствуют сравнительно недорогие и простые приборы для подобной криофиксации, где стержень охлаждается жидким азотом. Кристаллы льда при его использовании не обнаруживаются на глубине до 10 мкм [32, 84, 304].
   Хорошие результаты и воспроизводимость дает метод замора­живания с помощью полированного холодного медного блока с одновременным микроволновым облучением (в течение 50 мс). Такой подход позволил увеличить толщину аморфной зоны в объ­екте до 15 мкм [170, 370].
  

2.2.5. Замораживание под давлением

   Этот метод позволяет уменьшить критический уровень охлаж­дения в 100 раз и сохранить интактную структуру тканей в повер­хностном слое толщиной 150 мкм. Если охлаждение образца осу­ществляется между двумя металлическими поверхностями, то толщина слоя ткани, где происходит витрификация воды, может достигать 600 мкм. Использование замораживания под высоким давлением основано на принципе Ле Шателье. Как известно, замо­раживание приводит к увеличению объема воды, а высокое давле­ние мешает его возрастанию, тем самым предотвращая кристал­лизацию. Эффект реализуется путем снижения точки замерзания и уменьшения уровня нуклеации и роста кристаллов. В настоящее время серийно выпускаются коммерческие аппараты для замораживания под давлением [32, 132, 287, 300, 304].
  

2.3. КРИОПРОТЕКТОРЫ

   В большинстве исследований при замораживании тканевых образцов, обводненных более чем на 50-60 %, чаще всего исполь­зуют химический способ уменьшения количества свободной воды с помощью криопротекторов. В качестве последних обычно при­меняют глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), сахарозу и неко­торые другие вещества, молекулы которых, проникая в образец, активно структурируют воду. Для нефиксированных объектов этот метод не используется, так как в этом случае криопротекторы повреждают ткани и клетки. Криопротекторы бывают проникаю­щими (глицерин, ДМСО) и крупномолекулярными непроникаю­щими (поливинилпирролидон и др.). Непроникающие криопро­текторы в клетки не входят, однако за счет обезвоживания объек­тов их кристаллизация существенно уменьшается [32].
  

2.4. ЗАМОРАЖИВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ПРИ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

  
   При изготовлении крио-УС объекты также должны быть защи­щены от кристаллизационных повреждений. Это обычно достига­ется с помощью криопротекторов. Чаще всего образцы пропиты­ваются концентрированными растворами сахарозы. Для этого кусочки ткани толщиной не более 1 мм погружают в раствор сахарозы (1.6-2.3 М), а затем замораживают в жидком азоте. При низких концентрациях сахарозы (0.6-1.0 М) образцы лучше замораживать в жидком фреоне-12 при t=-158®С или в жидком фреоне-22 при t=-160®С. При использовании 1.6-2.3 М сахаро­зы объекты оказываются "мягкими" даже при t=-80®С. В этом случае резка осуществляется при температуре от -90 до -120®С [349]. Для получения относительно тонких срезов (20-30 нм) не­обходимо снижать концентрацию сахарозы, а следовательно, ис­пользовать более быстрое охлаждение [32]. Перед пропитыванием сахарозой (в ФБФР) или после нее (в сахарозе) ткань может хра­ниться в холодильнике в течение недели или больше с незначи­тельной потерей антигенности. В растворы желательно добавить 05 % ФА, чтобы не произошло снижения степени фиксации. Ес­ли использовался ГА, то ФА можно не добавлять.
   Итак, для того чтобы избежать повреждений тканей при замо­раживании, их обычно пропитывают в 2.3 М сахарозе и затем замораживают в жидком азоте, в шуге (тающем азоте) или в тающем фреоне-22, охлажденном с помощью жидкого азота. Укрепление объектов на блоке криоультратома перед заморажива­нием обычно длится несколько минут. Следует помнить, что маленькие образцы быстро дегидратируются во время этой проце­дуры, что может серьезно ухудшить условия резания заморожен­ных объектов [32].
   В ряде случаев для изготовления крио-УС используют 2.07-1.61 М сахарозу, содержащую 10-30 % поливинилпирролидона (ПВП). Замораживание и резание образцов при этом облегчается. С помощью углекислого натрия рН смеси должен быть доведен до 7.0. Данный криопротектор рекомендуется использовать при иммуно-ЭМ, он не вызывает осмотических повреждений клеток даже при продолжительной инкубации [350].
   Вместо сахарозы иногда используют 4.5-5 М фруктозу. Если же нельзя использовать сахара, то вместо них можно применять полиэтиленгликоль-300 или 500. Однако длительная обработка им объектов повреждает клеточные мембраны. Глицерин, применяе­мый в качестве криопротектора, существенно затрудняет проведе­ние электронно-гистохимических исследований, так как глицерин значительно снижает активность ряда биохимических процессов. Использование полиэтиленоксида облегчает процесс изготовления Крио-УС, которые в этом случае получают при температуре объекта от -120 до -150®С, температуре ножа -40®С и низкой скорости резания [32, 300, 304].
   Глава 3 ЗАЛИВКА
  
   Заливка представляет собой следующий важный этап препари­рования объектов для ЭМ-исследования (см. Приложение, 3.1). Использование термина "заливка" обусловлено тем обстоятельст­вом, что, во-первых, этот термин стал общепринятым в ЭМ и используется уже более 40 лет (см.: [16]), во-вторых, более адек­ватный с литературной точки зрения термин "заключение" в ЭМ может иметь два значения: заключение объектов в заливочные смолы и заключение срезов в прозрачные среды. Для того чтобы избежать путаницы, мы пользуемся при дальнейшем изложении первым термином.
   Цель заливки - равномерно пропитать ткань заливочным материалом и получить после отвердения блок, обладающий опти­мальным для ультратомии сочетанием твердости и эластичности [53, 76, 333]. Этот этап препарирования настолько важен, что обычно электронные микроскописты отказываются изучать мате­риал, неадекватно обработанный до поступления в их лабораторию [135].
  

3.1. ПРОМЫВАНИЕ

  
   Промывание объектов после фиксации в ЧО не является обя­зательным, можно заменить его несколькими споласкиваниями в этаноле при низких его концентрациях.
  

3.2. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

  
   Поскольку большинство заливочных сред нерастворимо в воде, то фиксированные объекты нуждаются в обезвоживании: необхо­димо заместить воду в образце промежуточным растворителем (дегидратантом), который хорошо смешивается с водой и с зали­вочной средой. При использовании водорастворимых заливочных сред можно обойтись без органических растворителей. Обезвоживание в этом случае осуществляется в ходе пропитывания. Перед пропитыванием эпоксидными смолами объекты иногда помеща­ют в окись пропилена, которая особенно хорошо смешивается со смолами. Обычно объекты постепенно "проводятся" через ряд вод­ных растворов дегидратанта с возрастающей концентрацией (50, 70, 90, 100 %). Время выдержки в каждом из растворов дегидра­танта может составлять от 5 до 15 мин (см. Приложение, 4.3). При малом времени дегидратации требуется интенсивное перемешива­ние жидкости (см. Приложение, 4.4).
   Если невозможно провести фиксацию, обезвоживание и залив­ку материала за один день, то фиксированный материал можно довести до 70%-ного этанола и оставить на ночь в холодильнике, однако слишком долгое хранение объектов в этих условиях вызы­вает экстракцию липидов. Сливать дегидратант следует так, чтобы не допустить подсыхания объектов. Для того чтобы объекты в про­цессе обезвоживания не прилипали ко дну, пользуются молеку­лярными ситами [72, 333].
  

3.2.1. Дегидратанты

  
   Наиболее часто в качестве дегидратантов применяют этанол, ацетон и метанол. Вместо этанола для обезвоживания иногда ис­пользуют ацетонитрил [137]. Объем обезвоживающей смеси дол­жен в 10 раз превосходить объем обрабатываемой ткани. Абсолют­ный этанол повышает хрупкость образцов. Кроме того, абсолют­ный этанол, приготовленный с помощью прокаленного медного купороса, может содержать незначительное количество солей ме­ди, которые являются ингибитором полимеризации.
   Большинство авторов в последние годы используют 100%-ный ацетон. Материал, который обезвоживался в ацетоне, обладает бо­лее равномерными механическими свойствами по сравнению с таковым, обработанным этанолом. Однако ацетон при дегидрата­ции в большей степени экстрагирует нуклеиновые кислоты. Аце­тон чувствителен к свету и должен храниться в темной посуде. Ацетон быстро поглощает влагу и становится непригодным для использования. При смешивании равных частей годного к ис­пользованию ацетона и петролейного эфира в жидкости не должно образовываться слоев.
   Обезвоживание должно быть полным - для этого необходимо, чтобы 100%-ные дегидратанты были абсолютными. Следует отме­тить, что абсолютные этанол и ацетон мгновенно поглощают воду из воздуха. Очень гигроскопичной является и окись пропилена. Сжатие тканей во время обезвоживания можно уменьшить при их дегидратации с помощью 2,2-диметоксипропана (ДМП) [333, 367], который быстро реагирует с водой в присутствии ионов водорода, распадаясь на метанол и ацетон. При использовании ДМП объек­ты надо тщательно отмыть от солей фосфорной кислоты, которые с ДМП образуют осадок. Время дегидратации кусочков объемом
  
   1 мм в подкисленном ДМП составляет 5 мин. После обезвожива­ния объекты для лучшего пропитывания смолой рекомендуется обработать в окиси пропилена.
  

3.3. ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ (ЗС)

  
   Для получения УС существует большой набор ЗС с различны­ми свойствами: эфиры акриловых кислот (метилметакрилат, бутилметакрилат, окиси гидрооксипропилметакрилата, гликольметакрилат, их смеси), полиэфирные смолы (Вестопал W, Риголак, Селектрон-5003 и 5214), эпоксидные смолы (Эпон 812, 826, 871, Эпилокс, Эпикон, Аралдит 502 и Аралдит М, Мараглас, Аквон, Дуркупан). Создано и уже применяется новое семейство заливоч­ных смол на основе меламина. Кроме того, используют альдегид-мочевину, желатину, агар-агар, смесь ГА-карбогидразид, которые, однако, в силу ряда причин (в основном из-за плохой воспроизво­димости и низкого качества УС) не нашли широкого применения [72, 105, 333, 367].
  

3.3.1. Сравнительная характеристика ЗС

   ЗС должна обладать следующими качествами: 1) иметь низ­кую вязкость; 2) хорошо проникать в ткани; 3) хорошо смеши­ваться с дегидратантами; 4) полимеризоваться с малой усадкой; 5) хорошо резаться; 6) минимально рассеивать электроны после полимеризации; 7) быть стабильной под электронным пучком; 8) обеспечивать хорошее и воспроизводимое контрастирование срезов и доступность реагентов для иммунных и гистохимических реакций. В наибольшей степени этим требованиям удовлетворяют эпоксидные и полиэфирные смолы, новое поколение смешиваю­щихся с водой акрилатов [72, 105, 333, 367].
   В настоящее время идеальной среды для заключения в ЭМ нет. Все они обладают теми или иными недостатками. Мономеры аралдита, эпона и метакрилатов растворяют жиры. В водо­растворимых ЗС могут экстрагировать гликоген и другие водора­створимые компоненты. Полиэфирные смолы трудно проникают в ткань, а некоторые компоненты смеси нестабильны при хране­нии. Метакрилаты неравномерно полимеризуются и менее стабильны под электронным пучком. Основной недостаток эпо­ксидных смол - большая вязкость, которая затрудняет пропитку тканей. Смешивающиеся с водой эпоксидные смолы реагируют с белками и нуклеиновыми кислотами. Акрилаты растворяют нейтральные липиды и фосфолипиды даже при низких температу­рах [105, 333, 367].
  

3.3.2. Эпоксидные смолы

  
   Из эпоксидных смол наиболее широко используются Эпон 812, Аралдит М, их смеси и смола Сперра (см. Приложение, 4.1- 4.7, 4.10 и 4.11). Последняя особенно хороша для тканей, плохо Пропитывающихся вязкими смолами. К сожалению, фирменные наименования веществ, составляющих аралдитовые и эпоновые смолы, не унифицированы, поэтому желательно использовать в работе компоненты одной марки, если это невозможно, то допустимо приготавливать смеси из реактивов разных фирм [70]. Внедряемая в последние годы мараглас-кардолитовая ЗС превос­ходит Эпон 812 скоростью пропитки и обладает более благоприят­ными механическими свойствами, обеспечивающими лучшее ка­чество УС [105, 333, 367].
   Вязкость эпоксидных смол существенно варьирует. Естествен­но, что большая вязкость требует более продолжительного пропи­тывания. Эпоксидные смолы довольно гигроскопичны, а попада­ние в них влаги плохо сказывается на полимеризации. При полимеризации степень сжатия эпоксидных ЗС не превышает 2 %. Эпоксидные УС под действием электронного пучка теряют не более 20 % массы. УС тканей, заключенных в эпоксидную смолу, достаточно прочны, и их можно монтировать на сеточках без опор-ной пленки [70, 72].
   Эпоксидная ЗС состоит из мономера (Эпон, Аралдит), отвердителя и ускорителя. Разные партии смол различаются по своим свойствам, поэтому лучше всего пользоваться наборами одной фирмы и одной партии. Можно добавлять также пластификатор, чаще всего дибутилфталат, который уменьшает вязкость смолы, улучшает качество резания. В качестве "отвердителей" (уплотнителей) - веществ, реагирующих с мономерами эпоксидных смол с образованием полимеров, используются ангидриды. Наиболее употребим додеценилсукциниловый ангидрид (ДДСА). Он имеет длинную молекулу и обеспечивает пластичность смолы после полимеризации. Для смол аралдитового ряда ДДСА является оптимальным отвердителем. Однако с Эпоном 812 ДДСА дает слишком мягкие блоки. Поэтому в данном случае используется другой отвердитель - метилэндометилентетрагидроофталевый ангидрид, который чаще называется метилнадикангидридом (methyl Nadic anhydride), или МНА (от торговой марки Надик). В США это ве­щество часто называется НМА. Реже используется ноненилсукцинангидрид (НСА).
   Реакция полимеризации между эпоксидной смолой и ангидри­дами требует очень высокой температуры. Для того чтобы реакция проходила в доступном температурном режиме, в смеси добавля­ют, инициаторы. Данная реакция не вызывает значительного уменьшения объема, не зависит от типа инициатора, на нее не влияют тканевые компоненты (в отличие от метакрилатов, кото­рые могут полимеризоваться под действием компонентов, содер­жащихся в объектах) [156].
   В качестве инициаторов полимеризации эпоксидных смол чаще всего используются третичные амины. Ранее в качестве ини­циатора широко использовался 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенол (ДМП-30, или DY064). Однако он имеет слишком вы­сокую вязкость, инактивируется водой и быстро портится. Из-за своей нестабильности он должен храниться сухим в эксикаторе и заменяться каждые 3-4 мес. Поэтому в настоящее время приме­нять его не рекомендуют. Лучше заменить его бензилдиметиламином (БДМА, или DY 062), увеличив концентрацию последнего до 3 % [156], а количество дибутилфталата можно слегка уменьшить (до 0.25 %) [154]. БДМА более стабилен и может использоваться вместе с большинством эпоксидных смол. Применяются также диметиламиноэтанол (ДМАЭ), который часто обозначают как Сl (или S1), и паратолуенсульфоновая кислота. Для удобства работы полезно знать, что в каждом миллилитре БДМА содержится около 80 капель (при раскапывании из пастеровской пипетки в верти­кальном положении). Из того же количества ДМАЭ и при тех же условиях можно получить 90 капель.
   В последние годы очень большое внимание стало уделяться так называемому коэффициенту "ангидрид/эпоксид" (А : Е), данное соотношение даже получило название "индекс качества резания". Эпоксидный эквивалент, или коэффициент ВПЕ (WPE), представ­ляет собой массу (М) эпоксидной смолы, приходящуюся на чис­тый эпоксид (число граммов смолы, содержащих 1 г эквивалента эпоксида). Коэффициент ВПЕ по размерности приравнивается к молекулярной массе (Mm) ангидрида, чтобы можно было исполь­зовать следующую формулу:
  

0x01 graphic

  
   К примеру, в оригинальной прописи Аралдита М был указан коэффициент 1 : 1, что предполагало использование приблизи­тельно равных объемов Аралдита М и ДДСА. Однако было уста­новлено, что при таком соотношении возникает высокая степень трения между ножом и блоком - появляются четтер и вибрация (см. гл. 5). Для уменьшения числа поперечных сшивок предложе­но уменьшить соотношение до 7 : 10 [156]. Если количество смо­лы и отвердителя измеряется по массе, то желательна точность до 0.1 г. Мнение о важности точного соотношения эпоксидной смолы и ангидрида привело к тому, что производители смол начали на каждой банке писать ВПЕ и рекомендации по изменению соотно­шений в прописи, для того чтобы получить требуемое отношение ангидрида к эпоксиду. Однако наблюдения показали, что это соот­ношение не имеет существенного значения, поскольку образова­ние поперечных сшивок в смоле при t=60®С идет не до конца, хотя в общем число поперечных сшивок увеличивается при увели­чении отношения ангидрида к эпоксиду [156].

3.3.2.1. Аралдит

   Диглициловый эфир бифенола А (4,4-изопропилиденедифе-нол) - ароматическая эпоксидная смола, известная под торговыми - марками Аралдит или Эпикот. Для ЭМ используют Аралдит М (или ЩСУ 212, реже он носит название Дуркупан ACM - Durcupan ACM), кооторый производится в основном в Европе и содержит 19 % дибутилфталата (ДБФ) Аралдит 502 и Аралдит MY 753, которые производятся главным образом в США, содержат только по 17 % дибутилфталата (ДБФ). Аралдит в большей степени, чем Эпон, устойчив к электронной бомбардировке, обеспечивает более гомогенную полимеризацию и минимальное сжатие. При использовании Аралдитов 502 и MY 753 нужно к смеси добавить ДБФ. Для того чтобы сделать более мягкими, лучше ввести специальные смягчители (flexibuizer), например 1,4-бутанеодилдиглицидиловый эфир (DY 026) или диглицидиловый эфир полипропиленгликоля (DER 736), которые имеют преимущество перед пластификаторами, поскольку реагируют с другими компонентами заливочной смолы, становятся частью поперечно сшитой структуры и в меньшей степени теряются при электронной бомбардировке.
   Большинство современных микроскопистов предпочитают , более твердые блоки и обычно к смеси Аралдита добавляют только 0.5 мл пластификатора - ДБФ. Если объекты твердые, то пластификатор или не добавляют, или вместе с ДДСА используют МНА. Предложена стандартная пропись заливочной смеси Аралдита (см. р Приложение, 4.2), в которой отношение ангидрида к эпоксиду варьирует от 0.79 до 0.87 в зависимости от ВПЕ Аралдита. Если - требуется получить более твердые блоки, то рекомендуется заменить часть ДДСА на МНА (чтобы получить то же самое отношение ангидрида к эпоксиду, каждый миллилитр ДДСА заменяется на 0,5 мл МНА, однако концентрация БДМА в полной смеси не должна превысить 3 %).
  

3.3.2.2. Эпон

   Эпоксидные смолы с более низкой устойчивостью к электрон­ному пучку, чем аралдиты, имеют торговую марку Эпон 812. Эта смола или ее аналоги часто продаются под другими названиями: Агар 100 (Agar 100), ЭМбед 812 (EMbed 812), Медкэст (Medcast), LX-112, Эпонет 12 (Eponate 12), Поларбед 812 (Polarbed 812), Полибед (Poly/Bed), Теэйб 812 (Taab 812). Эпон 812 - это триглицидиловый эфир глицерола.
   Для заливки в эпон рекомендовано несколько прописей. Наи­более широко используется пропись Люфта (см: [72, 156]), соглас­но которой рекомендуется вначале приготавливать две отдельные базовые смеси (А и Б), а уже при их смешивании в различных пропорциях получать блоки нужной твердости. Отношение ангид­рида к эпоксиду варьирует от 0.69 до 0.81 для первой смеси и от 0.70 до 0.82 для второй. Однако опыт показывает, что блоки удов­летворительного качества можно получить из любой марки ком­мерческого эпона. При соотношении смесей А и Б 7 : 3 получают­ся мягкие блоки, а при соотношении - 3:7 блоки будут тверды­ми. Рекомендуется добавлять 3 % БДМА. Однако гораздо удобнее готовить заливочную смесь в один этап (см. Приложение, 4.2).
  

3.3.2.3. Смеси Эпона и Аралдита

  
   В ряде случаев исследователи предпочитают использовать смесь эпона с аралдитом (см. Приложение, 4.2). Существует мне­ние, что. подобная смесь сочетает низкую вязкость эпона с боль­шей устойчивостью к электронному пучку аралдита. Однако дан­ное мнение не имеет экспериментального обоснования. Не ясно, имеет ли значение использование эпона и аралдита одной фирмы (как это рекомендуется во многих лабораториях), или это не суще­ственно.
  

3.3.2.4. Смола Сперра

   Смола Сперра - это диоксивинилциклогексан. Данная эпок­сидная смола с низкой вязкостью была предложена Сперром [336]. Однако она довольно канцерогенна и более токсична. Смола Спер­ра имеет преимущество при работе с плохо пропитывающимися объектами. Все этапы препарирования (в том числе и полимериза­цию) с данной смолой следует проводить в вытяжном шкафу. ЗС с инициатором должна быть хорошо перемешана и использована в день приготовления. Можно непродолжительное время хранить ее при t=-20®С, но при этом тщательно защищать от попадания влаги. Смола Сперра смешивается с ацетоном и этанолом, поэто­му окись пропилена использовать необязательно. Компонент, име­ющий фирменное название DER 736, снижает твердость блоков (см. Приложение, 4.6). Обычно ЗС затвердевает за 9 ч при t=70®С. Блоки можно резать через 3-4 сут. Для повышения ско­рости полимеризации (до 3 ч) количество компонента S1 надо увеличить до 1.0 части.
   В процессе приготовления ЗС компоненты добавляют строго по очереди, перемешивают аккуратно, избегая попадания пузырь­ков воздуха. Активатор можно добавлять только к последней смене ЗС. Капсулы должны быть хорошо просушены, поскольку смола очень гигроскопична, а в случае обводнения получаются очень хрупкие блоки. Обезвоживание и заливка стандартные. При попа­дании смолы Сперра на кожу ее смывать лучше водой с мылом. При изготовлении УС рекомендуется следующее: в ванночку нали­вать воду, использовать ножи с углом 50®, выставлять угол накло­на ножа 8®, применять скорость резания 1 мм/с и подачу 30 нм [105, 333].
  
  

3.3.3. Полиэфирные смолы

   Полиэфирные заливочные смолы полимеризуются при темпе­ратуре от 45 до 60®С или под воздействием ультрафиолетового облучения при комнатной температуре. При заливке не рекомен­дуется использовать полиэтиленовые капсулы. Наиболее широко применяется Вестопал W. Эти смолы не смешиваются с этанолом, поэтому обезвоживание обычно проводят в ацетоне. Затем объек­ты инкубируют в растворах при возрастающей концентрации вес-топала в ацетоне. Вестопаловые блоки относительно твердые [11, 333] (см. Приложение, 4.8).
  

3.3.4. Водорастворимые заливочные среды

  
   Водорастворимые заливочные среды (аквон, дуркупан, гликольметакрилат, оксипропилметакрилат и другие новые акрилаты; см. гл. 4) предназначены в основном для проведения иммуноци-тохимических и гистохимических реакций. Обезвоживание при их использовании может быть неполным или вообще не проводиться. Пропитывание может осуществляться водными растворами этих смол.
   Аквон - это водорастворимый экстракт эпона, который имеет низкую вязкость и смешивается с водой при t < 15®С. Он ис­пользуется с теми же отвердителями и ускорителями, что и эпон. Точный химический состав аквона неизвестен. Это водораствори­мая фракция, содержащаяся в коммерческом Эпоне 812. Аквон - бесцветная, гигроскопичная жидкость с низкой вязкостью. Фикси­рованные и промытые объекты проводят через ряд водных раство­ров аквона с повышающейся концентрацией постепенно достигая абсолютного аквона, который при добавлении уплотнителя и уско­рителя полимеризуется и дает такие же блоки, как Эпон 812 [105, 333].
   Смешивающаяся с водой эпоксидная ЗС Дуркупан дает худшие результаты, чем акрилаты. Водорастворимый Дуркупан не следует пу­тать с Дуркупаном АСМ. Дуркупан ACM (Fluka) - это то же самое, что и Аралдит CY 212. Дуркупан смешивается с водой. Поэтому залив­ка образцов может быть проведена без применения этанола [105].
  

3.3.5. Другие заливочные среды

  
   Заливочные смолы семейства Меламина смешиваются с во­дой, нетоксичны, при полимеризации выделяют пары ФА. Ком­мерчески доступными являются FB-101 (Nanoplast - температура инфильтрации 40®С, температура полимеризации 60®С), АМЕ-01 (-82®С и 60®С соответственно). Эти смолы часто используют для замещения в замороженном состоянии. По свойствам они сходны с поперечно сшитыми акриловыми смолами. Нанопласт FB-101 имеет вязкость 48 сП и усадку при полимеризации 2 % (см. При­ложение, 4.9). Он позволяет получать достаточно тонкие УС [301].
   ГА можно использовать не только в качестве фиксатора, но и как ЗС. Для сополимеризации применяют карбогидразид, гликольметакрилат, мочевину [165]).
  

3.3.5.1. Полиэтиленгликоль (ПЭГ)

   ПЭГ является хорошей заливочной средой для криостатных срезов при иммуноцитохимических исследованиях. Заливка в ПЭГ относительно проста и не требует специального оборудова­ния. В процессе пропитки блоки можно оставлять открытыми на ночь в 50%-ном растворе ПЭГ, приготовленном на 100%-ном эта­ноле, для того чтобы этанол улетучивался. Затем, осушив образцы от избытка ПЭГ, их переносят в капсулы для заливки. Кроме ПЭГ для этих же целей можно применять диэтиленгликоль дистеарат [301, 333] (см. Приложение, 4.12).
  

3.4. ПРОПИТЫВАНИЕ И ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ

  
   Цель этого этапа препарирования - равномерно пропитать образец заливочной средой и после отвердения получить блок, обладающий оптимальным для ультратомии сочетанием твердо­сти и эластичности. Поскольку отдельные дегидратанты не смешиваются с заливочными средами, то применяют промежуточные дегидратанты, например окись пропилена, которая существенно улучшает инфильтрацию образцов. Для замещения этанола следует сменить окись пропилена 2-3 раза. Однако этот прием не является обязательным. Так, Эпон 812 смешивается с этанолом, поэтому обработку окисью пропилена можно опустить. В повсед­невной практике используют более сложные и ускоренные методы заливки (см. Приложение, 4.4). Отметим, что ускоренная заливка может быть рекомендована только в том случае, если применяют­ся свежие смолы.
   Пропитывание объектов смолой можно производить прямо из абсолютного этанола, поскольку и эпон, и аралдит смешиваются с ним. Однако полностью удалить этанол из объектов очень трудно, что ухудшает качество блоков. Эту проблему прекрасно решает использование в качестве промежуточной жидкости окиси пропи­лена, которая быстро диффундирует в ткани и реагирует с ангид­ридом отвердителя, поэтому ее остатки в тканях не приносят вреда. Надо, однако, избегать высыхания объектов, поскольку окись пропилена очень летуча.
   Опытные электронные микроскописты рекомендуют исполь­зовать какую-нибудь одну стандартную пропись заливочной смеси и применять ее постоянно [156]. Добавление активаторов, как пра­вило, быстро повышает вязкость заливочных сред, что усложняет пропитку. Поэтому некоторые исследователи вначале пропитыва­ют объекты в заливочной смеси без активатора. В процессе пропи­тывания для лучшей инфильтрации объектов можно поднять тем­пературу до 37-50®С [72, 105, 333, 367].
  

3.4.1. Перемешивание ЗС

  
   Для работы со смолами лучше использовать посуду и шприцы из пластика, к которому она не прилипает. Чтобы получить равно­мерную полимеризацию, нужно тщательно перемешать все ком­поненты заливочной среды на магнитной мешалке или с по­мощью специальных винтовых вращающихся приспособлений. Плохое смешивание - одна из причин плохой резки. Чтобы улуч­шить смешивание, эпоксидную смолу обрабатывают ультразвуком в течение 10-15 мин. Во многих отечественных лабораториях пе­ремешивание ЗС осуществляется вращением стеклянной палочки. При этом образуется множество пузырьков воздуха. Применение магнитной мешалки вместе с нагреванием смеси до t=50®С су­щественно уменьшает образование воздушных пузырьков [333]. Образовавшиеся после перемешивания в заливочной смеси пузырьки воздуха надо обязательно удалить: дать смеси отстоять­ся, подогреть в термостате, поместить в ультразвуковую ванну (на 10-15 мин). Перед полимеризацией капсулы с объектами иногда выдерживают под низким вакуумом для удаления дегидратанта, воды и воздуха. Все этапы обезвоживания и инфильтрации образ­цов желательно проводить на медленно вращающемся держателе, наклоненном под некоторым углом к оси вращения. Для заливки объектов в последние годы используют автоматические процессо­ры [307]. Процедура заливки должна быть стандартной, влажность и температуру окружающей среды необходимо сохранять постоян­ными. Заливку желательно осуществлять в специализированном термостате [72, 105, 333, 367].
   Рекомендуемые в большинстве руководств механические спо­собы смешивания компонентов эпоксидных смол не обладают до­статочной эффективностью. Даже если смесь кажется полностью перемешанной, она, по существу, таковой не является. Отмерять нужные количества компонентов смолы лучше по объему после их разогрева. Если отмерять по массе, то разогретая смола быстро ос­тывает. Поэтому Глоуэрт и Холл [156] настоятельно рекомендуют следующий прием. Поместить банки с компонентами смолы в термостат при t=60®С на 10 мин (можно чуть больше): нагрева­ние до этой температуры резко уменьшает вязкость эпоксидных смол. Отлить нужный объем смолы и отвердителя в нагретый гра­дуированный цилиндр, сразу же слить их в предварительно нагре­тую коническую колбу и быстро смешать с помощью вращения и покачивания колбы до полного перемешивания (обычно в течение 3-5 мин). Палочку для перемешивания лучше не применять. Смесь должна быть прозрачной и неструктурированной. К ней добав­ляют точно отмеренное количество ускорителя, и смесь вновь вращают в течение 1-2 мин. После этого смесь готова для использования. Же­лательно каждый раз готовить свежую порцию полной заливочной смеси (обычно во время последних этапов дегидратации). Однако дан­ный способ не годится, если применяется взвешивание компонентов. Практика показала, что количество смолы и отвердителя не требует точных измерений, а вот инициатор должен быть отмерен предельно точно и его количество не должно превышать 3 %.
  

3.4.2. Хранение заливочных сред

   Все компоненты эпоксидных смол при комнатной температуре стабильны. Эпоксидные смолы могут храниться в закрытых сосудах при комнатной температуре продолжительное время. Ускорители ме­нее стабильны и инактивируются при обводнении быстрее. Их хранят при комнатной температуре в эксикаторе. Эпоксидные смолы не реко­мендуется хранить при низких температурах, поскольку возникает риск конденсации воды при открывании посуды. Это особенно опасно для БДМА, поскольку вода инактивирует его. Початые банки следует хранить при комнатной температуре в эксикаторе. Посуду с БДМА лучше открывать только на самое короткое время и менять банку на свежую каждые 6 мес. Если смола хранилась в холодильнике, то вна­чале она должна быть подогрета, и лишь потом ее можно открывать.
   Смесь смолы и уплотнителя стабильна при комнатной темпера­туре в течение нескольких недель. Однако ее лучше не хранить даже в холодильнике, поскольку у такой смеси постепенно увеличивается вязкость, что затрудняет дальнейшую работу с ней, кроме того, име­ется опасность попадания в смолу воды. Если есть необходимость ос­тавить приготовленную смесь, то хранить ее надо в плотно закрытом сосуде, чтобы смола не обводнялась, или в эксикаторе при t=-20®С. ЗС с активатором может храниться несколько дней при t=4®С и несколько недель при температуре от -20 до -30®С в плотно закупо­ренной банке, но в этом случае ее перед использованием нагревают до комнатной температуры. Большинство исследователей предпочи­тают смешивать отдельные компоненты непосредственно перед их применением [105, 301, 333].
  

3.5. РЕГУЛЯЦИЯ ТВЕРДОСТИ БЛОКОВ

   Твердость конечного блока из эпоксидных смол регулируется добавлением пластификатора, а также изменением соотношения или заменой ангидридных отвердителей. ДДСА обычно дает более мягкие блоки, а МНА - более твердые. Поэтому, если резание затруднено, надо изменить соотношение компонентов. Полная полимеризация эпоксидных смол - процесс довольно длительный (месяцы). Вследствие этого качество старых блоков иногда оказы­вается лучше, чем свежеполимеризованных.
   Как правило, чем выше температура, при которой происходит полимеризация, или чем выше концентрация активирующих ве­ществ, тем быстрее протекает полимеризация и быстрее завершается образование коротких мономерных цепей. Короткие цепи мономера не придают блоку достаточной эластичности, поэтому ультратомирование таких твердых и хрупких блоков значительно затруднено. Низ­кая степень активации мономера приводит к тому, что основным тормозом роста полимерных цепей становятся тканевые структуры. В этой ситуации возникают значительные деформации и разрывы ультраструктурных компонентов клеток и тканей [301, 333].
   Твердость и эластичность блока существенно влияют на каче­ство получаемых УС и сродство тканей к контрастирующим аген­там. Чтобы снизить твердость, можно добавить пластификатор. Увеличение количества ускорителя повышает твердость объекта, но делает его более хрупким. Природа самого отвердителя также влияет на твердость блока, поэтому можно использовать два раз­ных отвердителя, варьируя их концентрации, например смесь Эпона 812 с ДДСА и Эпона 812 с МНА в разных пропорциях. Мягкие блоки лучше режутся на холоде, твердые - в тепле. Если при резке обнаружится, что образцы мягче, чем ЗС, то это значит, что ткань плохо пропиталась ЗС. Для предупреждения такого явле­ния нужно, во-первых, увеличить время обработки в 100%-ном де-гидратанте, во-вторых, дольше выдерживать объекты в смесях, причем концентрация смолы должна повышаться более плавно, а смеси надо менять 2-3 раза в течение рабочего дня, в-третьих, уве­личить время пропитывания самой смолой [367]. Для улучшения ультратомирования в состав заливочной смеси вводят 1 % низко­вязкой силиконовой добавки (аддитива) [333].
  

3.6. ЕМКОСТИ ДЛЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

  
   Для заливки обычно используют полиэтиленовые, реже - жела­тиновые капсулы. Имеется множество конструкций полиэтиленовых и латексных капсул, форм из тефлона и силиконовой резины. Если капсулы не пронумерованы, то следует в капсулу или в форму поме­стить бумажку с карандашным обозначением [139]. Существуют осо­бые методы заключения мазков и изолированных клеток (рис. 3).
  

3.7. ОРИЕНТАЦИЯ ОБЪЕКТОВ

  
   Ориентация образцов относительно плоскости резания дости­гается плоскопараллельной заливкой в специальные формочки, а также переклеиванием готовых для ультратомирования объектов (см., например: [1, 16, 51, 79]). Весьма удобными являются фор­мочки из тефлона. Заполимеризованный блок из них легко выни­мается (подробнее см. гл. 17).
   0x01 graphic
   Рис. 3. Способ подготовки для ТЭМ мазков изолированных клеток. А - накалывание взвеси клеток (/) на стекло (2); Б - фиксация стекол с объектами в контейнере (3) с раствором ГА: В - накалывание на мазки (4) раствора ЧО; Г -инкубация во влажной камере (5), обезвоживание и пропитывание объекта смо­лой; Д - заполнение смолой капсул (б), в которые помещен бумажный маркер (7); Е -переворачивание заполненных капсул, накрывание ими мазков и полимеризация; Ж и З- локальный подогрев позволяет легко отделить капсулу с объектами от стекла.
  

3.8. РЕЖИМЫ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

  
   После пропитывания контейнеры с объектами помещают в тер­мостат при t=60®С на 24-48 ч. Время не является критическим фактором, поскольку свойства блоков меняются довольно медленно. Поэтому можно держать объекты в термостате в течение недели. Од­нако превышать температуру 60®С не рекомендуется. Используемые схемы быстрой проводки при t > 60®С обычно дают блоки плохого качества [156]. Поэтому мы их использовать для ТЭМ не рекоменду­ем, хотя для изготовления ПС их применять можно.
   Наиболее часто для полимеризации используется t=60®С. При этой температуре образуется ограниченное число поперечных сшивок и получаемые блоки хорошо режутся. Для оптимального ультратомирования гораздо важнее не твердость блока как таковая, а число образовавшихся поперечных сшивок. Если в блоке сформировать все возможные поперечные сшивки, то с такого блока будет очень трудно получить УС. При более низкой температуре возникают линейные t полимеры. Поэтому Люфт (см: [156]) предложил ступенчатое повы­шение температуры в процессе полимеризации: сначала 35®С, затем; 45®С и, наконец, 60®С. Однако опыт показал, что существенного i выигрыша в качестве получаемых блоков это не дает, поэтому боль­шинство электронных микроскопистов сейчас используют односту­пенчатую полимеризацию при 60®С. Если температуру поднять выше 60®С, то резко увеличивается число поперечных сшивок, что де­лает блок хрупким и значительно ухудшает качество получаемых УС и их тинкториальные свойства. При температуре 80®С и выше начи­нается процесс саморазогревания смолы [156].
  

3.8. ЗАМЕЩЕНИЕ В ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ

  
   При иммуно-ЭМ исследованиях часто используют метод замораживания-замещения. Замещение воды на органические рас­творители осуществляется при низких температурах (как правило, при t < -45®С) с последующей инфильтрацией смолой [304].
  

3.8.1. Принцип метода

  
   После замораживания объектов из них удаляют воду, погружая в дегидратант при температуре от -60 до -100®С. Во время заме­щения вода объекта переходит в дегидратант. Иногда в него вво­дятся поглотители воды (молекулярные сита).
   В процессе замещения возможна рекристаллизация воды. Вообще говоря, в каждом конкретном случае трудно установить температуру рекристаллизации. Общепринято, что температура рекристаллизации воды в биологических объектах выше, чем у чистой воды. Процесс ре­кристаллизации протекает довольно медленно. Продолжительность его сопоставима со временем, необходимым для замещения верифици­рованной юлы льда органическими растворителями.
   На практике при использовании метода замещения в заморо­женном состоянии объекты помещаются в пластиковые или метал­лические флаконы, заполненные жидким азотом, и переносятся в низкотемпературную камеру. Процесс обезвоживания занимает не­сколько суток. После этого в образцах сохраняется не более 30 % во­ды. Если не используется низкотемпературная заливка, то объекты можно медленно нагреть до комнатной температуры. Далее следует обычная заливка. Диффузия молекул воды в дегидратант - процесс относительно медленный. При этом не исключена возможность экс­тракции ряда компонентов ткани и перемещения ионов в пределах клетки и между клетками и внеклеточной средой. Сохранность струк­тур во многом зависит от предшествующей процедуры быстрого за­мораживания [254, 259] (см. Приложение, 4.13).
  

3.8.1.1. Замещающие жидкости

  
   В качестве замещающих жидкостей используют чаще всего эта­нол, ацетон, метанол, а также акролеин, пропиленоксид, диэтиловый эфир, диметоксипропан и др. Самое широкое применение нашел ацетон (иногда с добавками). Наиболее быстро замещение происхо­дит в метаноле, а наиболее медленно - в диэтиловом эфире. Приме­нение спиртов вызывает некоторое сжатие объектов и ряд структур­ных изменений, обусловленных частичной экстракцией цитоплазматического матрикса. Компоненты мембран в большей степени экстрагируются в более полярных растворителях [213, 259]. Сжатие проявляется в меньшей степени при использовании ацетона или тетрагидрофурана в смеси с некоторыми фиксаторами. Если замещение продолжается более 64 ч, то наблюдается экстракция компонентов клеточных мембран. Тот же эффект дает повышение температуры до -40®С в отсутствие 40. Способность ацетона поглощать воду не очень велика (2 % при t=-90®С и 3,5 % при t=-70®С), и состав­ляет 1/10 от таковой у метанола. Однако более мягкое удаление воды из клеточных структур в ряде случаев уменьшает повреждения. Для лучшего выявления мембран после замещения с помощью ацетона объекты в последующем инкубируют в парах ЧО.
   Добавление глицерина или этиленгликоля в дегидратант сни­жает скорость замещения и предупреждает сжатие, но не оказыва­ет влияния на сохранность мембран и экстракцию цитоплазматических компонентов. Лучшая сохранность ультраструктуры и ми­нимальная экстракция химических компонентов достигаются при использовании в последующем низкотемпературной заливки [72,259].
  

3.8.1.2. Применяемые фиксаторы и рекомендуемые схемы

  
   Для стабилизации клеточных ультраструктур к замещающей жидкости добавляют фиксирующие агенты. Различные фиксирую­щие вещества стабилизируют структуру при разных температурах. Так, образование поперечных сшивок (например, в ГА) происхо­дит при t > -10®С, а ЧО начинает реагировать с двойными связя­ми ненасыщенных жирных кислот только при t=-73®С.
   Акролеин при субнулевых температурах является наиболее эф­фективным фиксатором. Он обеспечивает удовлетворительную со­хранность цитоплазмы уже при t=-80®С, но плохо фиксирует мембраны. ЧО даже при концентрации 5 % не оказывает заметно-то эффекта в условиях фиксации при t=-80®С. Признаки суще­ственного фиксирующего действия ЧО - сохранение тонкой Структуры и окрашивание мембран - появляются лишь при по­вышении температуры до -40 или -50®С. В рутинной практике используется концентрация ЧО 0.2-0.4 % и t=-20®С. Время заме­щения при этом варьирует от 6 до 14 ч. Таким образом, ЧО может применяться как стабилизирующий агент, если температура заме­щения не ниже -30®С. При этом тканевые блоки остаются светло-коричневыми, что позволяет обеспечить полимеризацию акрило­вых ЗС в них с помощью УФО. При нагревании объекты обычно чернеют, так как осмиевая фиксация резко ускоряется. При использовании ацетона в него обычно добавляют ЧО (чаще всего 4 %). Отсутствие ЧО в дегидратанте ухудшает результаты [304].
   ГА при t < 0®С является малоэффективным фиксатором. ГА В метаноле начинает фиксировать белки при t=-50®С. В температурном интервале от -20 до 14®С воздействие ГА предупреждает сжатие объекта только в случае предварительного использова­ния акролеина и ЧО при более низкой температуре. О слабом вли­янии альдегидов на сохранность ультраструктур говорит тот факт, что как при добавлении альдегидов, так и без них не выявлено раз­ницы в сохранности ДНК бактерий [304].
   Добавление уранилацетата (УА) в дегидратанты увеличивает контрастность мембран и микрофиламентов при их фиксации альдегидами и ЧО. Окрашивающие свойства УА зависят не только от концентрации и температуры, но и от используемого раствори­теля. Например, 05%-ный раствор УА в ацетоне дает более интен­сивную контрастность, чем УА в метаноле. Кроме того, УА стаби­лизирует мембраны после фиксации альдегидами [259, 304].
   Окрашивание цитоскелетных компонентов может быть усиле­но хлоридом гафния. Раствор хлорида гафния в метаноле в комби­нации с УА увеличивает контрастность микротрубочек. Как и УА, он дает более интенсивное общее прокрашивание образца, если растворен в слабополярных растворителях (например, ацетоне). Таниновая кислота (ТК) при замораживании-замещении не только контрастирует, но и стабилизирует структуры. Добавление 0.2 % ТК к замещающей жидкости усиливает окрашивание мембран, матрикса и филаментов с помощью ЧО. В мембранах также обнаруживается меньше разрывов. В высоких концентрациях ТК является эффек­тивным контрастером для многих клеточных компонентов. Она используется вместе с ЧО [304]. В то же время смесь ЧО с ацето­ном оказалась малопригодной для препарирования в СЭМ из-за резкого сжатия клеток. Сморщивание образцов можно существенно уменьшить, если увеличить концентрацию ЧО до 3-5 % и по­высить температуру объектов до -20®С. При замораживании-за­мещении используют обычно минимальные концентрации фикса­торов. Оказалось, что в замещающий раствор достаточно ввести всего 0.1 % ЧО. При замораживании-замещении наилучшие ре­зультаты получаются при использовании определенной комбина­ции фиксаторов. Активность различных фиксаторов оказывает значительное влияние на процесс контрастирования. Наиболее распространенная схема фиксации включает комплекс фиксирую­щих агентов, растворенных в метаноле: 3 % ГА, 1 % ЧО, 0.5 % УА. Для их лучшего растворения иногда добавляют 3 % воды [284, 304].
  

3.9. АРТЕФАКТЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

3.9.1. Артефакты, возникающие при обезвоживании

  
   Неправильно проводимое обезвоживание способно повлиять на целостность клеточных мембран и вызвать их деформацию. Ти­пичными артефактами обезвоживания являются расслоение миелиновых ламелл и сморщивание клеток, что может быть следстви­ем слишком резкого увеличения концентрации обезвоживающих растворов. Избыточное пребывание материала в спирте или ацето­не способствует вымыванию липидов и гликогена из ткани. Недо­статочное обезвоживание может стать причиной плохой пропитки и возникновения артефактов заливки. В частности, при плохой дегидратации в срезах появляются дырки. Эта проблема в ряде слу­чаев решается путем использования гидрофильных смол более низкой вязкости (ЛР Вайт, ЛР Голд). В процессе препарирования для СЭМ тканей эмбриона сжатие может достигать 50 % [11, 121].
  

3.9.2. Артефакты, возникающие при заливке

  
   Эти дефекты выражаются в грубых нарушениях топографии тканевых элементов и в разрывах клеточных мембран. Их причи­нами являются неоднородное или недостаточное пропитывание объектов с помощью ЗС, неоднородная, неполная или слишком быстрая полимеризация, высокая степень усадки блока при поли­меризации. Неравномерность пропитки и полимеризации, а также другие недостатки заливки обычно выявляются при заточке блока, в ходе резания. Блок, который хорошо режется, редко дает арте­факты заливки, и наоборот. Возможна экстракция веществ из тка­ней во время пропитывания заливочным материалом. В част­ности, мономеры эпона и аралдита способны растворять липиды [11, 121].
   Глава 4 НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАЛИВКА
  
   Нарушения конформации белков оказываются минимальны­ми, если обезвоживание, инфильтрацию и полимеризацию прово­дить при низкой (-35®С и ниже) температуре. Подобная техника обеспечивает сохранность антигенных детерминант, ультраструк­туры, а также значительно уменьшает неспецифическое связыва­ние метки при иммуноцитохимических исследованиях.
   С другой стороны, эпоксидные и полиэфирные смолы очень трудно отделить от поверхности биологических структур и тем са­мым обнажить антигенные детерминанты. При использовании для иммунных методов УС из гидрофильных акриловых смол ан­тигены оказываются более доступными, чем в случае эпоксидных смол. Многие ферменты и антитела свободно реагируют с субстра­тами и антигенными детерминантами, заключенными в гидро­фильный акрилат, например в Ловикрил К4М [333].
   В отличие от эпоксидных смол акрилаты, в частности Ловик­рил, не образуют ковалентных химических связей с тканевыми компонентами. Поэтому в процессе резания идет раскалывание образца по линии наименьшего сопротивления - по поверхности соприкосновения смолы и тканевых компонентов. Это приводит к возникновению поверхностного рельефа глубиной 3-6 нм [82, 218].
   Подсчитано, что при одностороннем мечении антигенов на ак­риловых срезах толщиной 40 нм для антител доступна 1/8 часть всех антигенных детерминант, имеющихся в срезе. Преэмбеддинг (проведение иммунной реакции до заливки) обеспечивает увели­чение уровня мечения только в 2 раза. Теоретически число доступ­ных антигенных детерминант в крио-УС в 20-60 раз больше, чем в акриловых (Ловикрил К4М) УС, однако на практике это соотно­шение не превышает 10 [105].
   В процессе препарирования биологических объектов очень важно сохранить некоторое количество воды в образце, чтобы обеспечить структурную интегрированность. Вместе с тем следует удалить достаточно воды, чтобы получить хорошо режущиеся бло­ки. Эта цель также достигается при использовании низкотемпера­турных гидрофильных акриловых смол [133].
  

4.1. СМОЛЫ ДЛЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

  
   В настоящее время имеется целый набор акриловых заливоч­ных смол: ЛР Голд (LR Gold) для низкотемпературных заливок (-35®С), ЛР Вайт (LR White) для заливки при комнатной темпе­ратуре и Ловикрилы (Lowicryls) для низкотемпературной заливки (до -85®С) фиксированных объектов (см. Приложение, 5.1).
   Ловикрилы и ЛР-смолы являются поперечно сшитыми акри­ловыми пластмассами. Они гидрофильны и в основном предна­значены для иммуно-ЭМ и цитохимии. Ароматические полигидроксидиметакрилатные ЛР-смолы имеют повышенную по сравнению с ловикриловыми смолами устойчивость к электронному пучку [333].
   Применение новых акрилатов имеет ряд преимуществ: 1) воз­можность выявления как внутриклеточных, так и внеклеточных антигенных детерминант на УС без их травления; 2) относительно высокое разрешение антигенов; 3) возможность количественной оценки реакции; 4) возможность двойного и тройного мечения пу­тем одновременного использования частиц коллоидного золота (КЗ) различного диаметра; 4) относительно низкие вязкость и токсичность новых акриловых смол; 5) способность полимеризоваться при наличии в объектах воды (до 10 %); 6) хорошая окрашиваемость УС из новых акрилатов [105, 333, 367].
  

4.2. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С РАЗЛИЧНЫМИ АКРИЛОВЫМИ СМОЛАМИ

   При работе с акрилатами нельзя пользоваться ацетоном, поскольку он блокирует полимеризацию. По этой же причине не может использоваться диметоксипропан. Акрилаты менее ста­бильны под электронным пучком, чем эпоксидные ЗС, но более прочны, чем метакрилаты. УС лучше монтировать на подложку, так как при просмотре в ЭМ они теряют часть своей массы. УС из акрилатов рекомендуется держать под вакуумом, поскольку они быстро обводняются.
  

4.2.1. Сравнительный анализ

   Сравнительный анализ преимуществ и недостатков различных марок акрилатов еще не закончен и во многом базируется на личных пристрастиях. Разные белки (антигены и ферменты) по-разному сохраняются в полярных и неполярных ловикрилах. Поэтому в каждом случае приходится действовать методом проб и ошибок. Например, при исследовании нервной системы с по­мощью акриловых смол выявляются нарушения структуры кле­точных элементов из-за большого содержания в них липидов. Лучше всего сохраняет морфологию (и антигенность) нервной ткани смола ЛР Голд, а наиболее оптимальным режимом ее ис­пользования является контрастирование en blok с помощью УА с последующей дегидратацией в ацетоне и полимеризацией при низкой (-20®С) температуре [356].
  

4.2.1.1. Ловикрилы

   Состав и свойства различных смол ловикрилового ряда приве­дены в табл. 1 и 2.
  

Таблица 1. Состав смол ловикрилового ряда.

   Компонент

К4М

КИМ

НМ20

НМ23

   п -Бутилметакрилат

-

12.2

33.9

   1,3-Бутанедиолдиметакрилат

-

4.8

-

5.4

   2-Этоксиэтилметакрилат

-

11.2

-

-

   Этилметакрилат

-

-

68.5

60.7

   n-Гексилметакрилат

9.0

-

16.6

-

   2-Гидроксиэтилакрилат

23.7

20.6

-

-

   2-Гидроксипропилметакрилат

48.0

41.0

-

-

   2-Метоксиэтилметакрилат

-

10.2

-

-

   Триэтиленгликольдиметакрилат

13.9

-

14.9

-

  

Таблица 2. Свойства ловикрилов

   Марка

Свойства

Температура инфильтрации,®С

  
  

рекомендуемая

минимальная

   К4М

Полярная

-35

-43

   НМ20

Неполярная

-40

-53

   КИМ

Полярная

-60

-63

   НМ23

Неполярная

-80

-83

  
   Свойства смол в пределах групп также имеют отличия. Так, КИМ при t=-35®С имеет меньшую вязкость, чем К4М, и соот­ветственно лучше пропитывает объекты. НМ20 при низких темпе­ратурах менее вязкий, чем КИМ, но не смешивается с этиленгликолем и диметилформамидом. Недостатком ловикриловых смол является отсутствие возможности применения ЧО. Однако при хорошо подобранных условиях контрастирования-можно при этом выявлять нормальную структуру клеточных мембран. Позитивное окрашивание мембран можно получить также с помощью добавле­ния пикриновой кислоты в раствор ГА и заливки в ЛР Вайт [105, 333, 367].
  

4.2.1.1.1. Состав смол

  
   Ловикрил состоит из компонентов А, Б и В. Для низкотемпе­ратурной полимеризации в качестве компонента В (инициатора) используется метиловый эфир бензоина (см. Приложение, 5.1). Компонент В является фотоинициатором УФ-полимеризации. Компонент А осуществляет поперечное "сшивание" основных мономерных цепей компонента Б. Для К4М рекомендуется исполь­зовать 1.35 весовых частей компонента А (этот параметр может варьировать от 0.4 до 1.8); 8.6 - Б и 0.05 - В. Для НМ20 эти по­казатели составляют 1.5 (от 0.5 до 1.7), 85 и 0.05 соответственно. Соотношение компонентов А и Б определяет твердость блока. При добавлении большего количества отвердителя (А) твердость бло­ков возрастает. При использовании К4М концентрацию отверди­теля в некоторых случаях можно поднять до 20 %. Твердость смол КИМ и НМ23 также можно модифицировать [105, 333, 367] (см. Приложение, 5.2-5.4).
  

4.2.1.2. ЛР-смолы

   Семейство заливочных смол ЛР отличается, во-первых, значи­тельной стабильностью под пучком электронов, во-вторых, высо­кой гидрофильностью, в-третьих, возможностью полимеризации в присутствии воды (до 12 %).
  

4.2.1.2.1. ЛРВайт

   Смола ЛР Вайт выпускается трех видов: твердая, средняя и мягкая. Она полимеризуется под воздействием тепла, УФО, хими­ческих инициаторов. В первом случае смола полимеризуется при t=50®С за 24 ч (см. Приложение, 5.5). При этом режиме не про­исходит полного поперечного сшивания смолы, что важно для иммуномечения.
   При использовании химической полимеризации к свежей пор­ции отвердителя и мономера (не старше 3 мес) добавляется по 1.5 мкл ускорителя на 1 мл смеси и тщательно перемешивается в отсутствие кислорода, который ингибирует полимеризацию. Если добавить слишком много ускорителя, то происходит значительное нагревание объекта, что повреждает ультраструктуры и антигены.
   По этой же причине не рекомендуется использовать большие кап­сулы и крупные блоки.
   Уже через 7 мин после добавления ускорителя в смоле начина­ется гелеобразование. Поэтому переносить образцы в капсулы на­до очень быстро. Полимеризация заканчивается через 45 мин. Температура во время полимеризации может повышаться до 50-60®С. После полимеризации сверху должно остаться неболь­шое количество незаполимеризованной смолы. Если этого нет, то скорее всего мономер был частично заполимеризован. Если же большая часть смолы в капсуле или вся смола не заполимеризовалась и стала розовой, то это значит, что в смолу попал кислород.
   Если антигены повреждаются при обработке в этаноле, то его можно заменить на ацетон, но дегидратацию следует вести до 100%-ного ацетона, а затем пропитывать объекты по крайней мере в четырех сменах ЛР Вайт, чтобы удалить следы ацетона, посколь­ку он ингибирует полимеризацию.
   В случае заливки объектов быстрым методом при комнатной температуре возможны полимеризационные артефакты, поскольку в ткани остаются реактивные группировки (например, амины), которые независимо от добавленного ускорителя оказывают ката­литическое воздействие на полимеризацию смолы. Во время про­питки под влиянием тепла смола вокруг образца частично полимеризуется. Ускоритель в этом случае проникает только в наружную часть блока. Пропитывание осуществляется смесью этанола и г ЗС (1:2) при тщательном перемешивании в течение 30 мин. Для предупреждения ткань-индуцированной полимеризации пропиты­вание проводят при t < 22®С (4 смены по 30 мин) на вращаю­щемся столике.
   Заливку в ЛР Вайт рекомендуют проводить следующим образом. Вначале готовится навеска смолы, которая хранится при t=0®С. Затем точное количество ускорителя (15 мкл на 1 мл) добавляется к смеси, смола быстро перемешивается и разливается в капсулы. Для отвода тепла капсулы со смолой лучше поместить в алюминиевый блок с ячейками, плотно прилегающими к капсулам. Полимеризация продолжается 4 ч при t=0®С в холодиль­нике. Хранить же капсулы следует в морозильнике (t=-40®С).
   Однако при таком способе полимеризации образуется мало поперечных сшивок и УС не будут стабильными под электронным пучком. Требуется дополнительная полимеризация. ПС, получен­ные от только что заполимеризованных блоков, хорошо метятся с помощью антител и дают хорошее серебряное усиление.
   Полимеризация ЛР Вайт с помощью ускорителя легче контро­лируется, чем под действием УФО. При хранении блоков в течение 6-12 мес качество иммуномечения ухудшается. Блоки, извлечен­ные из капсул, лучше хранить при комнатной температуре, а бло­ки в капсулах - в холодильнике. Набухание УС, сопровождающе­еся образованием складок, усиливается в присутствии детергентов (Твин, Тритон Х-100), которые обычно добавляются к инкубаци­онным растворам [105, 333, 367].
  
  

4.2.1.2.2. ЛРГолд

   В эту смолу можно успешно заключать образцы больших раз­меров, чем в ЛР Вайт. Однако толщину кусочков не следует брать большой, если полимеризуются темноокрашенные ткани, такие как печень или селезенка, поскольку полная полимеризация зави­сит от голубого света, способного проникать только на определен­ную глубину. Заливать в ЛР Голд можно и нефиксированные тка­ни [252].
   Пропитывание лучше всего проводить в 10-миллилитровых пузырьках с плотно закрывающимися крышками на вращающей­ся мешалке при t < О®С. Конечная ЗС чувствительна к световому воздействию и должна постоянно находиться в темноте.
   Если заливается нефиксированная ткань, то для предупрежде­ния осмотических повреждений в дегидратант добавляют поливинилпирролидон (молекулярная масса 44000). Он растворим в ме­таноле, воде и в мономере смолы.
   Добавление светочувствительного инициатора необходимо для полимеризации заливочной смолы. Рекомендуется приме­нять бензил (альфа-дикетон) в концентрации 0.1 %. Для полимеризации применяют узкие желатиновые или специаль­ные пластмассовые капсулы. В качестве источника света исполь­зуют кварцевые галогеновые лампы (например, A l/209 FDX, 12 В, 100 Вт). Облучение при напряжении в сети 7-9 В (недонакал лампы) вызывает затвердение смолы в течение 24 ч. Кис­лород ингибирует полимеризацию, поэтому капсулы надо за­полнять (лучше в атмосфере азота) полностью и плотно закры­вать.
   Если верхняя поверхность после 24-часовой полимеризации остается мягкой, то надо ее срезать или, перед тем как будет уда­лена желатина облучить капсулы дневным светом в течение не­скольких часов. Хранить заполимеризованные блоки на холоде нет необходимости.
   Данная заливочная смола может быть заполимеризована и при комнатной температуре. Для этого надо добавить к мономе­ру 1 % перекиси бензоила (ПБ) или 1.5 % Люперко (60%-ный раствор ПЕ в дибутилфталате). Для ускорения процесса отверде­ния рекомендуется ввести 1 каплю ускорителя из набора ЛР Вайт на 20 мл смеси ЛР Голд и ПБ. Для отвердения с помощью УФО надо добавлять метиловый эфир бензоина. Точная его кон­центрация зависит от спектра и мощности УФ-лампы, однако обычная концентрация составляет 0.5 %. Очень важна плотность поперечных сшивок в полимере. Если используемый краситель плохо проникает в смолу, то необходимо уменьшить либо кон­центрацию ПБ, либо время экспозиции, либо интенсивность потока света (см. Приложение, 5.6) [105, 333, 367].
  

4.2.1.2.3. Гликольметакрилат (ГМА)

  
   Смешивающаяся с водой заливочная смола ГМА термоплас­тична: полимеризуется линейно без поперечных сшивок между цепочками, а затем расплавляется, если ее нагреть. С целью уменьшения сжатия и, других полимеризационных артефактов кусочки заливают в предполимер ГМА. Для улучшения ультратомирования к нему добавляется n-бутилметакрилат или стирён. Последний может использоваться в качестве дегидратанта [333] (см. Приложение, 5.7).
  

4.2.2. Активаторы

  
   ПБ является наиболее широко применяемым ускорителем для акриловых смол. Однако процесс полимеризации в этом случае идет медленно и требует повышения температуры. Кроме ПБ в ка­честве активаторов могут использоваться и другие вещества: неко­торые барбитураты, азопроизводные (например, азо-бис-бутиронитрилы).
   Для полимеризации ловикрилов при температурах от -35 до -10®С применяется метиловый эфир бензоина, а от -10 до 30®С - этиловый эфир бензоина. Вместо инициатора В исполь­зуется ПБ (0.5 % НМ20 и 0.3 % К4М) [333].
  

4.3. МЕТОДЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

   Низкотемпературная заливка используется при трех режимах препарирования объектов: 1) замораживание-замещение; 2) замо­раживание-высушивание; 3) обезвоживание фиксированных объ­ектов при низкой температуре. Каждая из этих процедур имеет преимущества и недостатки. В первом случае возможна рекристал­лизация льда. Во втором может возникать агрегация макромоле­кул, которые в вакууме осаждаются на ближайшую твердую поверх­ность: цитоскелет, рибосомы, мембраны. При этом особенно опа­сен момент проникновения жидкой смолы в сухой образец - капиллярные силы поверхностного натяжения могут повреждать ультраструктуру. Третий вариант предполагает химическую фик­сацию при комнатной температуре.
   При использовании метода замораживания-замещения пропи­тывание смолой осуществляется при температуре от -70 до 20®С, а полимеризация - от -70 до -25®С. После замораживания-заме­щения дегидратант постепенно замещается предварительно охлаж­денной смолой, которая полимеризуется при низкой температуре под действием УФО.
   В случае второго режима препарирования замороженные объ­екты переносятся в камеру установки для замораживания-высу­шивания. Этот процесс обычно начинается при t=-90®С и про­должается при t - -70®С в течение 10-12 ч. В последующие 48 ч температура медленно повышается до -40®С. Вакуум в камере поддерживается на уровне 10-3 Торр. После полного высушивания без нарушения вакуума и изменения температуры объекты пропи­тываются смолой в течение ночи и полимеризуются при низкой температуре с помощью УФО.
   Метод замораживания-высушивания с последующей инфильт­рацией в ряде случаев лучше сохраняет структуру тканей. Поддер­жание низкой температуры и вакуума во время большинства эта­пов препарирования обеспечивает свободную от кислорода атмо­сферу и гомогенную инфильтрацию и полимеризацию смолы.
   Наиболее широкое применение в настоящее время нашел метод, при котором понижение температуры объекта начинается во время обезвоживания и сохраняется вплоть до отвердения смо­лы - "низкотемпературная (крио)заливка". Он достаточно прост и обеспечивает сохранность многих антигенов [105, 333].
  

4.4. АППАРАТУРА ДЛЯ КРИОЗАЛИВКИ

   Имеются коммерческие аппараты для низкотемпературной за­ливки фирмы Бальцерс Юнион (Balzers Union) (Лихтенштейн) и фирмы Неслаб (Neslab) (рис. 4 и 5) Разработаны также упрощен­ные устройства для этих целей, например на базе ультракриостата МК-70. Крышка ультракриостата изготовлена в виде теплоизоли­рующего окна из двух слоев оргстекла толщиной 1 мм, разделен­ных воздушным пространством в 25 мм. Над окном, вне криостата, находится блок из четырех эритемных ламп ЛЭ-15, располо­женных в два ряда. Общая мощность источника УФ-излучения составляет 60 Вт при максимуме излучения с длиной волны 310 нм. Расстояние от поверхности стола до середины источника излу­чения составляет 200 мм. При этих параметрах установки поли­меризация блоков происходит в течение 2-3 сут [33, 105].

0x01 graphic

   Рис. 4. Приспособление для низкотемпературной полимеризации с помощью УФО. 1 - УФ-лампа; 2 - отражатель УФО; 3 - проволочный держатель для капсул; 4 - желатиновая капсула

0x01 graphic

   Рис. 5. Устройство для низкотемпературной полимеризации с помощью галогеновой лампы (для смолы ЛР Голд). 1 - галогеновая лампа; 2 - желатиновая капсула с объектами; 3 - объект; 4 - стекло; 5 - подставка для капсул; 6 - штатив для закрепления элементов системы (по: [105]).
  

4.5. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

   Процесс обезвоживания сопровождается градуированным сни­жением температуры. Объекты переносятся из одного раствора дегидратанта в другой с большей концентрацией. Обычно в каждом растворе объекты выдерживаются в течение 15-60 мин. Поскольку акриловые смолы толерантны к небольшим количествам воды, концентрация последнего раствора дегидратанта может быть ниже 100 %. Скорость проводки можно увеличить [105, 367].
  

4.6. ДЕГИДРАТАНТЫ

  
   Этанол, ацетон и метанол легко смешиваются с ловикрилами, а этиленгликоль и диметилформамид - только с полярными ло­викрилами. При использовании ацетона для низкотемпературной заливки следует знать, что при 70 % его точка замерзания соответ­ствует t=-27®С. Кроме того, ацетон поглощает свободные ради­калы и тем самым блокирует полимеризацию. Этиленгликоль мо­жет применяться в концентрациях менее 90 %, так как температу­ра замерзания его растворов ниже -27®С, 100%-ный этиленгликоль замерзает при t=-12®С. Поэтому чаще всего ис­пользуются этанол и метанол [105].
  

4.7. ПРОПИТЫВАНИЕ

  
   После обезвоживания объекты пропитываются растворами с последовательно возрастающими концентрациями заливочных смол в дегидратанте. Поскольку кислород блокирует реакцию пол­имеризации акрилатов, то перед инфильтрацией рекомендуется пропустить через жидкую смолу азот для удаления растворенного кислорода. При использовании химической полимеризации пере­мешивание рекомендуется осуществлять только с помощью про­пускания сухого азота [85, 333].
  

4.8. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ УФО

  
   Ловикриловые смолы полимеризуются под действием УФО с длиной волны 360 нм. Инициация фотополимеризации не зави­сит от температуры. Внутреннюю поверхность холодильника для полимеризации необходимо покрыть материалом, который отра­жает УФО, например алюминиевой фольгой. Облучение должно быть непрямым - между лампами и капсулами помещают отра­жатели, покрытые фольгой. Для лучшего отвода тепла от ламп их рекомендуется размещать снаружи, а в крышке вверху делать от­верстия для проникновения УФО. Обычно используются две лам­пы УФО по 15 Вт, например TDL15W/05 или им подобные. Они должны быть расположены на расстоянии 300-400 мм от капсул. Если источник УФО слабее, то расстояние должно быть уменьше­но [85, 105, 333].
   Для лучшего проникновения света рекомендуется брать как можно более мелкие объекты. Если применяли ЧО, то смола будет плохо полимеризоваться, поскольку содержащаяся в образце осмиевая чернь поглощает УФО, проникающее в образец. Тот же эффект дают некоторые пигменты. В подобных случаях нужно использовать химическую или тепловую полимеризацию.
   Полимеризацию объектов желательно осуществлять в желати­новых капсулах. Можно использовать также полиэтиленовые кап­сулы (ВЕЕМ-капсулы), прозрачные для УФО. Во время полиме­ризации капсулы рекомендуется укреплять в проволочном держателе, обеспечивающем равномерное их облучение со всех сторон. Для УФО-полимеризации к смоле добавляется 0.5 % метилового эфира бензоина.
   Время полимеризации обычно не превышает 24 ч. Полимери­зация К4М и ЛР Голд продолжается 24-36 ч при t=-20®С. ЛР Вайт полимеризуется при t=20®С (с добавлением ароматическо­го третичного ускорителя) или при t=50®С. Обычно после на­чального периода полимеризации при низкой температуре капсу­лы переносят для окончательного отвердения под действием УФО в комнатную температуру [85, 105, 155].
  

4.9. ХИМИЧЕСКАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ

  
   В случае химической полимеризации избыток ускорителя мо­жет нарушить антигенность и вызвать увеличение уровня образо­вания поперечных сшивок. Акриловые смолы могут подвергаться химической и тепловой полимеризации при t=60®С. Для хими­ческой полимеризации в качестве инициатора используется ПБ, а активатора - NN-диметиланилин (ДМА). Их количество зависит от температуры. Для К4М при t=-35®С берут 0.4 % ПБ и 0.25 % ДМА, при t=20®С - 0.05 % ПБ и 0.03 % ДМА. Для Н20М при t=-35®С берут 1 % ПБ и 0.6 % ДМА, при t=20®С - 0.08 % ПБ и 0.5 % ДМА. Для тепловой полимеризации (при температуре от 50 до 60®С) к смеси добавляется ПБ: 0.2 % для Ловикрила К4М и 0.5 % для Ловикрила Н20М.
   На практике после смешивания отвердителя и мономера смолу делят на две части: к первой из них добавляют ПБ, ко второй - ДМА. Перед самым использованием обе части смешивают - химичес­кая реакция начинается немедленно [105, 333].
  

4.10. КРИОЗАЛИВКА И ФИКСАЦИЯ

  
   При использовании ФА или смеси ФА и ГА при низких кон­центрациях (0.05-0.2 %) сохранность ультраструктур вполне удовлетворительна. Требования к условиям фиксации определяются в основном влиянием фиксатора на сохранность антигенов (см. гл. 2). После фиксации объект обезвоживается при низкой темпе­ратуре в этаноле при возрастающих его концентрациях.
  

4.11. КРИОЗАЛИВКА, ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И ИММУНО-ЭМ АНАЛИЗ

  
   В настоящее время широко используется низкотемпературная заливка (в Ловикрил К4М или НМ20, ЛР Голд) с последующей обработкой срезов протеазами или нуклеазами. Обработка УС ферментами (проназа, РНКаза, ДНКаза) при рН 6.8-7.0 и концен­трации 0.1-1 % при t=37®С в течение 4-24 ч обнаруживается эффективная, специфичная и градуированная экстракция. При этом желательно применять фиксацию ФА или смесью ФА-ГА [300, 333].
   После изготовления ПС толщиной 3 мкм и их светооптического анализа их можно перезалить для получения УС. Ловикриловые ПС монтируют на стекла, покрытые поли-Ь-лиэином (1 %-ный раствор полилизина с молекулярной массой 300000). Затем стекла промывают водой, высушивают и хранят до исполь­зования. ПС обрабатываются растворами антител, концентрация которых в 10 раз больше таковой для парафиновых срезов. Вы­бранные участки ПС маркируют. Капсулы заполняют смолой, накладывают на отмеченные участки ПС и полимеризуют. После полимеризации капсулы можно легко отделить от стекла путем быстрого их погружения в жидкий азот.
   ПС окрашивают 1%-ным метиленовым синим при комнатной температуре в течение 30-60 с и просматривают в световом мик­роскопе для определения степени расправления ПС. Если ПС пло­ский и окрашен однородно, то из него готовят УС. Обычно с каж­дого ПС можно получить 20-30 УС, которые помещают на нике­левые сетки с формваровыми подложками и обрабатывают иммунореагентами [105, 249, 333]. Резание следует лучше прово­дить с помощью стеклянного ножа.
  

4.12. АРТЕФАКТЫ, ВОЗМОЖНЫЕ НЕУДАЧИ И ИХ ПРИЧИНЫ

  
   Для низкотемпературной заливки нужно иметь специальное оборудование или низкотемпературную комнату. Осмирование и большие размеры образцов также мешают адекватной полимери­зации. Акриловые заливочные смолы в процессе полимеризации образуют двухмерные полимеры и дают большую усадку (часто до 20 %), а УС под влиянием электронного пучка в ТЭМ могут терять до 50 % своей массы. Сморщивание капсул после полимеризации обычно связано с большим количеством остаточной воды в смоле. Присутствие кислорода ухудшает полимеризацию. Использование ЧО при проводке часто повреждает антигены. Поэтому ЧО для фиксации лучше не использовать. Сильно пигментированные об­разцы абсорбируют ультрафиолет, что приводит к плохой полиме­ризации блоков. При полной дегидратации образцов антигены мо­гут повреждаться. Поэтому их не следует проводить через 100%-ный этанол, надо прямо инкубировать в 100%-ной моно­мерной смоле. Вместе с тем повышенное содержание воды нару­шает процесс полимеризации акрилата. Если антигены чувстви­тельны к этанолу, то последний можно заменить на ацетон, но де­гидратацию следует вести до 100 %-ного ацетона, а затем пропитывать по крайней мере в четырех сменах смолы, чтобы уда­лить следы этого дегидратанта [300, 333, 367].
   Глава 5 УЛЬТРАТОМИЯ
   Пучок электронов может проникать только сквозь объекты ог­раниченной толщины - не более 100-150 нм. При прочих равных условиях чем тоньше срез, тем выше достигаемое разрешение, ко­торое по грубым подсчетам составляет 1/10 толщины среза. Со­временные методы ультратомии в принципе позволяют получать срезы толщиной 5 нм и, следовательно, позволяют реализовать разрешение порядка OS нм [139, 329, 333, 359].
   В литературе имеется довольно много разноречивых терминов для срезов различной толщины. Мы используем следующую клас­сификацию: ультратонкие срезы (ультрасрезы) - УС (толщиной до 100 нм), толстые УС (до 500 нм), полутонкие срезы - ПС (до 2 мкм) и микросрезы (от 25 мкм и более).
   Необходимо, чтобы УС соответствовали следующим критери­ям: 1) содержали исследуемые структуры; 2) их толщина должна быть минимальной и однородной; 3) в УС не должно быть дефек­тов.

5.1. ЗАТАЧИВАНИЕ БЛОКОВ

  
   Перед началом резания блоки должны быть соответствующим образом заточены. Цель заточки - придать блоку такую форму, при которой кусочек ткани будет резаться наилучшим образом, что позволит получать УС оптимального качества. Наиболее часто блоки затачиваются в форме пирамиды. Оптимальной формой се­чения пирамиды является равнобедренная трапеция, реже - пря­моугольник или квадрат. Асимметрия приводит к искривлению ленты УС. Необходимо, чтобы основание трапеции было в 15 раза длиннее ее верхнего края, угол между основанием и боковой стороной составлял 85, площадь пирамидки была минимальной, грани - ровными и гладкими, а верхняя и нижняя грани - строго параллельными.
   Получение УС большой площади - довольно трудная задача. Лимитирующими факторами в этом случае являются опыт опера­тора, качество заливочных смол, природа заливаемого материала,
  
   качество ножей. В отдельных случаях можно получить хорошие УС площадью до 4 мм2 [105, 139, 333, 359].
   Затачивание блока может осуществляться вручную, на специ­альном приборе - пирамитоме или в самом ультратоме, если в данной модели есть соответствующие приспособления. Опытные ультратомисты предпочитают затачивать блоки вручную (см. Приложение, 6.1).
  

5.1.1. Ручное затачивание

   Для точного ручного затачивания пирамидки на выбранную структуру надо следовать следующим правилам: 1) просмотреть ПС под световым микроскопом (СМ) и зарисовать его с обозначе­нием следов от ножа; 2) блок с препаратом вынуть из ультратома и поместить под стереомикроскоп срезанной поверхностью вверх; 3) поворачивать осветитель и срез до тех пор, пока на срезанной поверхности блока не будут наиболее отчетливо видны детали объекта и следы ножа; 4) обрезать лезвием бритвы те участки препарата, которые не будут исследоваться.
   При затачивании вручную пользуются обычными или специ­альными бритвами и безопасными лезвиями. Перед заточкой со свежего лезвия бритвы желательно с помощью ксилола или ацето­на удалить смазку. Держа половинку безопасной бритвы под углом 60® к вертикальной оси, обтачивают одну из сторон блока, затем его поворачивают на 180® и повторяют операцию. В результате получаются две грани усеченной пирамидки. После этого блок поворачивают на 90® и затачивают третью сторону. Бритву держат под углом 60® к вертикальной и 60-70® к нижней грани пирамид­ки. Так же поступают и с четвертой стороной. Чтобы все грани были гладкими, окончательные срезы нужно делать новым ост­рым лезвием.
   Наиболее употребительный способ заточки пирамидок показан на рис. 6. Затачивание на призму производится тогда, когда нужно получить большие по площади срезы. Можно также использовать усеченные пирамидки или усеченные призмы. Для получения УС со многих участков объекта применяют заточку блока способом мезы (рис. 7) [70, 139, 333, 359, 367].
  

0x01 graphic

   Рис. 6. Способ заточки пирамидки при ультратомии, последовательность этапов. А - вид сверху, Б - вид сбоку. 1 - лезвие бритвы (по: [9]).
  

0x01 graphic

   Рис. 7. Заточка пирамидки способом мезы. А-Д этапы заточки; Е - общий вид заточенной пирамидки; Ж - последователь­ное (а-в) затачивание пирамидок (1) в разных участках объекта.
  

5.1.2. Механическое затачивание

   Механическое затачивание осуществляется на ультратомах или пирамитомах, для этого чаще всего пользуются выбракованными стеклянными ножами. В пирамитомах изображение ПС проециру­ется на срезанную поверхность блока и заточка ведется с помощью ориентируемого под нужными углами ножа, что дает возможность очень точно располагать блок и затачивать для резания нужный участок плато пирамиды (рис. 8). Полученные на таких аппаратах пирамидки позволяют получать срезы лучшего качества, чем при ручной заточке [70].
   После изготовления ПС платформу ножедержателя поворачи­вают по часовой стрелке на 30® и обтачивают одну из граней, за­тем платформу поворачивают против часовой стрелки на 30® и по­вторяют процедуру. Получают две параллельные грани - верхнюю и нижнюю. Нож возвращают в исходное положение, а головку блокодержателя поворачивают на 90® влево и производят обточку. Центральную грань затачивают, повернув головку на 90® вправо относительно центрального положения.
   Если нежелательно срезать весь материал образца, то применя­ют так называемую меза-пирамидку (рис. 7). Для получения серийных срезов через определенные интервалы также используют заточку пирамидки методом мезы. При получении лицевой грани, нож не поворачивают, а только отодвигают в сторону и при зата­чивании углубляются на 20-30 мкм. Потом поворачивают головку блокодержателя на 90® и повторяют процедуру, предварительно подвинув нож так, чтобы он коснулся будущей боковой грани. Последнюю грань обтачивают аналогичным образом [139, 333, 359].

0x01 graphic

   Рис. 8. Схема заточки пирамидки на пирамитоме с помощью проецирования ПС на плато пирамидки. Внизу представлена схема прохождения светового пучка в приборе. 1 - ПС; 2 - пирамидка; 3 - окуляр.
  

5.2. НОЖИ ДЛЯ УЛЬТРАТОМИИ

  
   Для изготовления УС используются алмазные, сапфировые и стеклянные ножи. Радиус режущего края равен 2 нм как у стеклян­ных, так и у алмазных ножей. Сапфир и алмаз - очень твердые ве­щества, однако ножи из них могут повреждаться при изготовлении толстых УС [70, 367].
  

5.2.1. Алмазные ножи

   Лучшие алмазные ножи получаются из ювелирных алмазов. Индустриальные алмазы также используются при изготовлении ножей для ультратомии, однако качество их ниже, так как на режу­щей кромке могут быть трещины. Алмазные ножи для ПС изго­тавливают из промышленных алмазов. Стоимость их соответст­венно в три раза ниже. Алмазное лезвие обычно вклеено в алюми­ниевую ванночку с помощью эпоксидной пластмассы.
  

0x01 graphic

   Рис. 9. Общий вид алмазного ножа. 1 - режущий край алмаза; 2 - эпок­сидное ложе для алмазного кристалла; 3 - ванночка для жидкости.
  
   Качество алмазных ножей, имеющихся в продаже, разное. Цена алмазного ножа составляет несколько тысяч долларов. При небольшой интенсивности рабо­ты алмазного ножа хватает на 5-6 лет, затем его нужно перетачи­вать. Лезвие алмазного ножа обычно можно затачивать не бо­лее трех раз. При повторном за­тачивании угол ножа немного увеличивается, а длина режущего края слегка возрастает. Алмаз­ные ножи являются достаточно тонкими инструментами, поэто­му пользоваться ими могут толь­ко опытные ультратомисты. При наличии алмазного ножа ультра-том должен быть оснащен хорошей осветительной системой и прецизионной системой подведения ножа [250].
   Угол режущего края алмазного ножа может колебаться от 40 до 60®. Обычно ножи с меньшим углом режущего края применяют для резания более мягких блоков. Такие ножи дают возможность получать более тонкие срезы. Ножи с большим углом употребляют для резания более твердых блоков. Оптимальные параметры ал­мазного ножа указаны в инструкции к нему (рис. 9).
   С помощью алмазных ножей можно получать УС из образцов, содержащих твердые включения (кристаллы или волокна асбеста). Алмазные ножи незаменимы при изготовлении серийных УС. Для предупреждения повреждений режущего края лучше использовать малую скорость резания. Край алмазного ножа надо периодически картировать и учитывать каждую новую зазубрину [70, 139, 333, 359].
  

5.2.1.1. Очистка алмазных ножей

   Прилипающие к лезвию алмазного ножа фрагменты тканей ухудшают качество ультратомирования, поэтому нож рекоменду­ется регулярно чистить. Если край ножа не смачивается водой, то нож выдерживают в течение ночи в 1%-ном растворе Твина-20 или мягкого детергента. Если это не помогает, то следует провести по режущему краю ресницей. Если не удается очистить лезвие с помощью ресницы, то надо применять специальные палочки из пенопласта или мягкого (апельсинового) дерева. Направление чистящих движений должно быть строго параллельным режущему краю (рис. 10). Деревянную или пенопластовую палочку перед этим желательно обмакнуть в 50%-ный этанол или раствор детер­гента. Поскольку из дерева могут выделяться масла, деревянные палочки, используемые для чистки алмазных ножей, рекоменду­ется как следует прокипятить или выдержать длительное время в органических растворителях, таких как этанол, ацетон, трихлорэтан и т.п. Перед чисткой лезвие алмазного ножа можно поместить в раствор детергента. Нельзя применять жесткие детергенты, кис­лоты, щелочи или сильные органические растворители. Надо стро­го следовать инструкции по чистке ножей. Нож после чистки по­мещают в специальный контейнер, не дожидаясь его высыхания [70, 139, 333, 359, 367].

0x01 graphic

   Рис. 10. Способ очистки режущего края алмазного ножа 1 - алмазное лезвие; 2 - палочка из мягкого дерева или пенопласта, стрелкой показано направление ее движения.
  

5.2.2. Сапфировые ножи

   Сапфировые ножи много тверже стеклянных и значительно де­шевле алмазных. Обычно они изготавливаются из синтетических сапфиров длиной 4-6 мм и имеют угол лезвия 45®. Монтируется нож в алюминиевую ванночку, сходную с таковой у алмазного но­жа. Сапфировые ножи обычно вновь не перетачиваются.
  
  

5.2.3. Стеклянные ножи

   Наиболее употребительны стеклянные ножи, которые чаще всего изготавливают с помощью особых устройств, называемых но-жеделателями (knifemaker). При пользовании стеклянными ножа­ми трудно получать УС большой площади. Зато применение стек­лянных ножей позволяет подби­рать нужный угол режущего края в зависимости от объекта. Мини­мальный угол ножа, который может быть получен при раскалы­вании стекла, составляет 45® (рис. 11) [70, 333, 367].

0x01 graphic

   Рис. 11. Общий вид стеклянного ножа а - угол режущей кромки ножа, 45®-55®; 1 - свиль; 2 - передняя грань; 3 - режущий край, 4 - луч­шая часть ножа.
  

5.2.3.1. Выбор стекла для ножей

  
   Стекло должно отвечать следующим требованиям: 1) толщи­на 4.5-6.0 мм (оптимум 5.0 мм); 2) отсутствие пузырьков и дру­гих включений; 3) содержание SiО2 не менее 72-75 % при мини­мальном содержании железа, полочка стекла шириной 7-10 см должна иметь светло-зеленый или желтоватый оттенок при рас­смотрении его с ребра. Лучше использовать "сырое" стекло с рав­номерным отжигом без значительных поверхностных натяже­ний.
   Для отжига "сухого стекла" его помещают в муфельную печь с терморегулятором. Стекло выдерживают при температуре, близкой к температуре плавления (от 800 до 1000®С) в течение 60 мин. Затем охлаждают со скоростью 1®С в 1 мин до t=250®С. Печь выключают, и стекло остывает вместе с печью до комнатной тем­пературы [70, 139].
  

5.2.3.2. Изготовление стеклянных ножей

  
   Полоску стекла тщательно моют в детергенте, а затем промы­вают в проточной воде и высушивают на воздухе. Протирать его лучше батистовой тряпочкой. Чистую и сухую полоску стекла помещают на платформу ножеделателя так, чтобы фабричные зазубрины оказались сверху (при изготовлении ножей с углом 50®) или внизу (для ножей с углом 45®). Одно ребро укладывают вдоль углообразующей пластины, а конец уравнивают по точке-отметке на столе ножеделателя. Опускают струбцину, не придерживая ру­кой стекло. Прочерчивают риску на стекле. Давление на резец нуж­но подобрать такое, чтобы риска была достаточно глубокой и в то же время не давала осколков. От правильного выбора давления зависит успех изготовления ножей. Риска должна начинаться от задней грани стекла и не доходить до передней на 1-15 мм. Ручку механизма разлома медленно поворачивают, и стекло раскалыва­ется, отделяя квадрат или ромб. Манипуляции с квадратами удоб­но осуществлять специальной вилкой, имеющейся в приборе. Квадрат помещают на нижние штырьки прибора и зажимают между двумя скользящими направляющими. В результате раска­лывания стекла на квадраты на одном ребре его образуются выщербленки. Для ножей с углом 50® выщербленки должны находиться сверху и слева, для изготовления ножей с углом 45® - сни­зу и слева. В первом случае поворот стеклянного квадрата осуществляют на 90® против часовой стрелки, во втором - на 180®, но во фронтальной плоскости: верхняя грань становится нижней (рис. 12).
   На ручке резака есть приспособление, которое позволяет выби­рать длину наносимой риски. Надо опустить струбцину и нанести риску соответствующей длины в зависимости от ширины стекла. Риска должна проходить как можно ближе к диагонали (макси­мально допустимое отклонение от нее 0.7 мм) и не доходить до одного угла на 1-1,5 мм.

0x01 graphic

   Рис. 12. Изготовление стеклянных ножей. А - нож с углом 45®; Б - нож с углом более 45®. 1 - стеклянный квадрат; 2 - ри­ска, нанесенная стеклорезом (2а - для получения квадрата, 26 - для изготовле­ния ножа); 3 - держатели стеклянного квадрата; 4 - стеклянная полоска. Пояснения см. в тексте, с. 77.
  
   Теперь нужно привести в соприкосновение с ближайшим уг­лом стекла специальную демпферную подушечку. Она нужна, что­бы погасить вибрацию двух половинок стекла во время разлома. Слишком прижимать ее не следует, так как она может повредить режущую поверхность ножа, которая располагается как раз в этом месте. В то же время, если давление демпфера было недостаточ­ным, ширина лезвия ножа, пригодного для резки, может оказаться очень короткой (рис. 13).
   Ручку разлома следует поворачивать медленно, наблюдая за квадратом стекла. Как только появится трещина вдоль насечки, поворот ручки прекращают. Этот прием обеспечивает нужную ско­рость разлома стекла. Качество режущих поверхностей ножа зави­сит во многом от степени прижатия подушечки (рис. 13, А-В) и от скорости разлома стекла, а о последней можно судить по звуку: ес­ли звук тихий и нерезкий, то скорость была маленькой, при этом, как правило, качество ножей хорошее, большая скорость разлома сопровождается резким треском. В последнем случае нужно увели­чить давление при нанесении риски. В результате разлома квадра­та получаются два ножа [70, 139, 333]. Угол стеклянного ножа бу­дет немного больше, чем угол, который имела первоначальная ри­ска. Нельзя получить стеклянные ножи с углом меньше 45®. Более того, в большинстве случаев угол режущего края ножа несколько больше, чем 45®.
   Для получения хороших стеклянных ножей необходимо со­блюдать следующие правила: нарезать точные квадраты из поло­сок и разламывать эти квадраты как можно ближе к диагонали.

0x01 graphic

   Рис. 13. Зависимость качества режущего края стеклянного ножа от величины прижатия (А-В; лучшее качество достигается в случае Б) стеклянного квадрата. 1 - стеклянный квадрат, 2 - демпферный валик; 3 - держатель.
  
   Чем ближе к углу квадрата проведен раскол, тем более острым и гладким будет край ножа. Чем меньше ширина тыльной (задней) поверхности каждого ножа (лучше менее 0.1-0.2 мм), тем лучше комплементарный нож. Кроме того, такой нож реже дает свили. Напыление вольфрама значительно улучшает качество стеклянно­го ножа и увеличивает срок его службы до 2-3 недель [162]. Напы­ляются передняя и верхняя грани Ножа. Данный прием увеличива­ет теплопроводность в процессе резания, позволяет получать более тонкие УС и в большем количестве, существенно увеличивает дли­тельность пользования ножом, особенно при криоультратомии. Рекомендуемая толщина слоя вольфрама 2 Нм. Направление на­пыления должно соответствовать биссектрисе угла ножа [70, 139, 333, 359, 367].
  

5.2.3.3. Оценка качества стеклянного ножа

   После того как ножи приготовлены, нужно проверить их каче­ство и выбрать те из них, которые пригодны для получения УС или для затачивания пирамидок. Для оценки ножа его надо поме­стить в ультратом, большинство которых оснащено специальными приспособлениями для оценки качества ножей. Нож вставляют в держатель ультратома. Включают фокусирующий свет, который, манипулируя световодом или патроном, наводят на режущую поверхность ножа. Обычно имеется специальный узкий переме­щаемый источник света. Двигая им, необходимо получить очень узкую полоску отраженного света вдоль режущего края ножа. Сфо­кусировав микроскоп на режущем крае ножа, начинают медленно вращать нож вперед и назад до тех пор, пока свет не отразится от его режущего края и не станут видны его дефекты. Край "идеаль­ного ножа" должен быть очень тонким, прямым и не иметь зазуб­рин или неровностей.
   При правильном изготовлении ножа от левого верхнего угла идет так называемая линия напряжения. Здесь располагается при­годный для резки участок, протяженность которого может быть различной. Дальше следует участок с зазубринами, что делает эту часть ножа непригодной для получения УС. Однако эту часть мож­но использовать для начального процесса резания. Обычно хоро­шая режущая часть лезвия начинается почти у самого левого кон­ца и имеет длину от 1/3 до 1/2 от всего режущего края. Самую большую рабочую поверхность имеют ножи с углом 45®. Замече­но, что образцы, залитые в Эпон 812, лучше резать ножом с углом 50®. Для криоультратомии используют ножи с углом 45®. Качест­во ножа определяется оптимальным углом ножа, правильным рас­положением риски при изготовлении ножа, оптимальной силой нанесения царапины, небольшим и медленным разломом [9, 70, 72, 139, 333].
  

5.2.3.4. Хранение стеклянных ножей

  
   С готовыми отобранными стеклянными ножами следует обра­щаться очень бережно и хранить острием вверх в специальном за­крытом контейнере, защищающем их от пыли и механических повреждений. Лучше использовать стеклянные ножи вскоре после их изготовления. На сохранность остроты ножа влияет влажность воздуха [160].
  

5.2.3.5. Ножи Ральфа

  
   Стеклянные ножи применяются и для изготовления больших по площади ПС и микросрезов. С этой целью используются так называемые стеклянные ножи Ральфа с широким лезвием (в честь Пауля Ральфа, который впервые описал новый метод изготовле­ния ножей, но не опубликовал его). Ножи Ральфа очень удобны, поскольку они острее, чем стальные, и проще в изготовлении. Для их получения насечка на верхней поверхности наносится не прямо над линией упора, а смещена от нее на несколько миллиметров. В этом случае поверхность разлома не перпендикулярна к плоскости стекла, а образует изгиб, направленный к линии упора. Лезвие но­жа формируется на линии пересечения изогнутой поверхности разлома и поверхности стекла, противоположной насечке. Длина лезвия ограничена в этом случае шириной стеклянной полоски (рис. 14) [70, 160].

0x01 graphic

   Рис. 14. Схематическое изображение метода изготовления гистологических ножей
   Ральфа.
   А - получение ножа с относительно тупым режущим краем; Б - с более острым режущим краем; В - обычный способ раскалывания стеклянной полоски. 1 - упор; 2 - положение риски.
  

5.3. ИЗГОТОВЛЕНИЕ ВАННОЧЕК

  
   УС собирают на поверхность жидкости, находящейся в специ­альной ванночке, прикрепленной к стеклянному ножу. Чтобы при­крепить стандартную ванночку, ее одевают на нож, а образовавшу­юся щель между ножом и ванночкой заливают расплавленным зу­боврачебным воском или парафином. Для этой цели могут быть использованы следующие приемы: 1) кусочек помещенного на дно парафина или воска расплавляют путем нагрева верхней задней стенки ванночки в пламени спиртовки, парафин хорошо заполняет щели между металлом и стеклом; 2) ванночку опускают в расплав­ленный воск и быстро одевают на нож; 3) кусочек воска или пара­фина наносят на металлический шпатель, расплавляют его над пламенем горелки и заливают щель с внешней стороны. Парафин и воск нельзя перегревать, поскольку их пары могут попасть на ре­жущую грань ножа. Очень удобно приклеивать ванночки лаком для ногтей. Однако сохнет он дольше.
   При повторном использовании готовых ванночек необходимо тщательно очистить их от воска или лака путем погружения в теп­лую воду или ацетон. Внутреннюю поверхность ванночки следует отмыть особенно тщательно.
   Если в распоряжении оператора нет готовых ванночек, то мож­но изготовить их из липкой ленты. К ленте предъявляются следу­ющие требования: 1) она не должна быть шире 10 мм; 2) ее лип­кий слой не должен растворяться в воде. Край ленты обрезают под углом 90® и прикрепляют к левой боковой грани ножа. Нож держат в левой руке так, чтобы его режущее ребро было сверху, а режущая грань повернута к оператору. Острый кончик ленты нуж­но совместить с верхним левым углом ножа. Обернуть нож лентой так, чтобы ее положение было перпендикулярно к передней грани ножа. Делать это нужно осторожно, не прикасаясь к грани (рис. 15) [70, 160].
   Плоскость верхнего контура ванночки должна составлять угол 90 0 с передней гранью ножа. Надо соблюдать особую осторож­ность при обрезании лишнего участка ленты. Необходимо, чтобы верхний угол ленты точно совпадал с уровнем лезвия ножа или был выше его на 05 мм. Ванночка нигде не должна выступать за плоскость ножа, но не может быть и ниже режущей грани. Боковые стенки ванночки должны быть параллельны друг другу, иначе бу­дет трудно получить "зеркальце" на поверхности жидкости. Ниж­няя кромка ленты на всем протяжении заливается парафином или воском с помощью разогретого скальпеля или шпателя, либо ла­ком для ногтей и хорошо подсушивается. Для того чтобы сделать очень маленькую ванночку (для 1-2 срезов), на верхнюю поверх­ность ножа, на 4-5 мм ниже режущего края, наносят 1-2 капли расплавленного воска или парафина [70].
   Приготовленный нож в случае его загрязнения при изготовлении ванночки промывают 1-2 раза рабочей жидкостью. Ванночку запол­няют до выпуклого мениска, а избыток жидкости осторожным страхиванием удаляют. Для работы с серийными УС разработана специ­альная приставка к алмазному ножу, которая значительно увеличи­вает площадь поверхности жидкости в ванночке и содержит специальные пазы-"заводи" для накопления в них лент УС [361].

0x01 graphic

   Рис. 15. Способ изготовления ванночки из липкой ленты. А - наклеивание кусочка ленты (1) на нож (2); Б - подрезание выступающих кон­цов ленты лезвием бритвы (3) и нанесение расплавленного воска (4) с целью герме­тизации ванночки; В - общий вид готового ножа с ванночкой.
  
   Для заполнения ванночки чаще всего используется бидистиллированная вода. Если жидкость не смачивает нож, то можно доба­вить 0.05 % Твина-20 или детергента Фото Фло (Photo Flo). Чтобы срезы не загрязнялись микроорганизмами или их остатками, желательно использовать только стерильную или свежепрокипяче­ную воду. Ванночку нельзя заполнять водой из системы ионообменников. В ряде случаев для улучшения смачиваемости исполь­зуют 1-10%-ные растворы этанола или ацетона. Превышение ука­занной концентрации может повредить эпоксидный клей, используемый для приклеивания алмазного ножа к держателю. Кроме того, эти растворы способны вымывать некоторые компо­ненты среза [70, 160].
  

5.4. УЛЬТРАТОМИЯ

  
   При ультратомии начинающему оператору следует обратить внимание на следующие детали: 1) правильное приготовление пи­рамидки; 2) надежное крепление ножа и пирамидки в держателях; 3) поддержание правильных взаимоотношений пирамидки и ре­жущей кромки ножа (параллельность нижней грани пирамидки и режущей кромки ножа и т.д.); 4) соблюдение формы мениска жид­кости. При изготовлении УС необходимо самое пристальное вни­мание уделять чистоте. Ножи легко повредить, поэтому манипу­лировать ими нужно очень осторожно. Загрязнить режущую хоро­шую часть можно даже дыханием.
   При ультратомировании могут иметь место три процесса (см. ниже, разд. 5.4.7, рис.18): 1) резание лезвием (если нож достаточно острый), 2) раскалывание (если угол ножа увеличивается), 3) со­скабливание (если угол ножа очень велик) [70, 328].
  

5.4.1. Ультратомы

  
   Основные черты всех современных ультратомов следующие: 1) сверхтонкая механическая, пьезоэлектрическая или тепловая подача; 2) прецизионная ориентация образца; 3) наличие грубой подачи для подведения образца и получения ПС или микросрезов; 4) возможность контроля за скоростью резания; 5) удаление ножа при обратном ходе объекта; 6) возможность прецизионного осве­щения и наблюдения за процессом резания. Ряд ультратомов име­ют приспособление для автоматического приближения и удаления образца от ножа [56].
  

5.4.2. Общие правила работы на ультратомах

  
   Работа ультратомов требует механической и термической ста­бильности. Воздух должен быть чистым и иметь постоянную влажность. Ультратомы лучше ставить далеко от входа в лаборато­рию в огороженном пространстве. Перед началом резания рабочее место надо протереть влажной тряпкой. Все типы ультратомов очень чувствительны к механическим сотрясениям и колебаниям температуры окружающей среды. Каждая модель ультратома имеет свои особенности управления, с которыми можно ознакомиться
в инструкции к прибору.
   Чтобы получить очень тонкие УС, надо соблюдать ряд правил: 1) режущий край ножа необходимо поддерживать высокого качества (проверяется при большом увеличении и хорошем освещении); 2) угол наклона - не более 3-4; 3) скорость резания - оптимальная; 4) пропитывание и полимеризация также должны быть оптималь­ными; 5) ультратом необходимо тщательно отладить и все возмож­ные источники вибраций устранить; 6) площадь пирамидки свести к минимуму - не более 0.1 мм ; 7) лезвие ножа и поверхность пира­мидки должны быть параллельны; 8) твердые блоки лучше резать ал­мазным ножом, мягкие - стеклянным; 9) верхняя и нижняя грань пирамидки выдерживаются строго параллельными.
   Подробная инструкция для работы на ультратоме прилагается фирмой-изготовителем, а представители фирмы демонстрируют приемы работы на этом приборе при его установке. Весь процесс изготовления УС может быть разбит на следующие этапы: уста­новка образца, установка ножа, подведение ножа, получение перво­го УС, резание, собирание УС [70, 160, 328].
  

5.4.3. Установка объекта

  
   После полимеризации надо дать блокам 2-3 сут полежать при комнатной температуре. Закреплять блок в держатель нужно глу­боко, чтобы из него выступало не более 2-3 мм. Метакрилатные блоки (да и остальные тоже) лучше закреплять в держателях за 2-3 сут до резания из-за возможной деформации.
  

5.4.4. Ориентация блоков

  
   Созданы различного типа держатели для точной ориентировки образцов во время заливки и ультратомии. Для проведения вто­ричной ориентации образца кусочек пластика с заключенным в нем объектом вырезается и, если расположение структур в объекте известно, кусочку придается нужное расположение, затем он при­клеивается к тому же блоку. Если расположение структур неизве­стно, то вначале с помощью ПС выясняют ориентацию объекта.
  

5.4.5. Установка и подведение ножа

  
   Нож устанавливается таким образом, чтобы его лезвие было параллельно плоскости пирамидки. Для того чтобы исключить трение блока по передней поверхности ножа, последний должен быть слегка наклонен, обычно под углом 4, при использовании ал­мазного ножа необходимый угол наклона указан в фирменной инструкции. Затем нужно подвести нож как можно ближе (менее 1 мм) к пирамидке, избегая, однако, контакта. Для этого используют как тонкую, так и среднюю подачу. Надо следить за тонкой
щелью между пирамидкой и ножом. Нож следует передвинуть
вбок так, чтобы блок был против хорошей части режущей кромки
ножа. Нижняя грань пирамидки должна быть параллельной режущему краю. Далее необходимо установить нож перпендикулярно к оси пирамидки и добиться (поворачивая блокодержатель вокруг своей оси и в головке ультратома, а если надо - и головку ультратома), чтобы нижняя грань пирамидки стала параллельна режущему краю ножа. Контроль следует осуществлять под стереомикроскопом. После этого надо закрепить блокодержатель и головку блока. На некоторых ультратомах при правильном положении источника света тень от ножа проецируется на поверхность блока,
что видно с помощью стереомикроскопа. При движении ножа вперед тень уменьшается [70, 139, 160, 328].
   Кроме того, пирамидку надо установить так, чтобы она была параллельна плоскости резания. Для этого необходимо проследить за щелью между поверхностью блока и ножом при движении пи­рамидки вниз - если ширина щели не изменяется, то нож установ­лен правильно, в противном случае следует переориентировать пи­рамидку по отношению к ножу в вертикальной плоскости. Во вре­мя процедуры переориентации объекта нож должен быть отведен от блока [70, 160].
   При помощи микроподачи надо приблизить нож к объекту как можно ближе. Осуществлять подачу следует под контролем свето­вого микроскопа и с хорошим освещением, до тех пор пока это расстояние не будет составлять около 1 мм или меньше. Необхо­димо зафиксировать кронштейн ультратома, затем следует под­нять (или опустить) всю головку с объектом таким образом, чтобы уровень ножа соответствовал примерно середине блока, и освобо­дить стержень. После этого надо поднять стереомикроскоп до удобного для оператора положения и, направляя луч света на нож и покачивая блок от руки с помощью механизма ручного резания, увидеть световой блик, отражающийся от блока (рис. 16). При по­степенном приближении ножа к блоку блик сужается и превраща­ется в неширокую линию. Затем производится совмещение по вертикали кончика пирамидки объекта и лезвия ножа (при совме­щении они фокусируются в одной плоскости) [70, 160].
   Теперь надо налить рабочую жидкость (воду) в ванночку (ме­ниск в это время должен быть вогнутый). Заполнение ванночки осуществляют с помощью специального устройства или шприца до образования выпуклого мениска. При этом жидкость смачивает лезвие ножа. Затем часть жидкости удаляется до появления на ее поверхности в районе лезвия ножа блика отраженного света от ос­ветителя, расположенного впереди ножа под углом приблизитель­но 45® к вертикали. Край ножа обязательно должен быть смочен. Если этого нет, то надо воспользоваться ресницей и покрыть его водой.

0x01 graphic

   Рис. 16. Установка светового блика по поверхности жидкости в ванночке (по: [9]). А - вид сбоку; Б - вид сверху. 1 - правильное положение осветителя;. 2 - непра­вильное его положение; 3 - правильная локализация блика для наблюдения УС; 4 - пирамидка; 5 - режущий край ножа; 6 - осветитель;
  
   Наливать воду в ванночку лучше при опущенном кронштейне с блоком. Свет, падающий на поверхность жидкости вблизи лезвия ножа, отражается, образуя белую дорожку отраженного света "зеркальце". Высоту уровня жидкости можно изменять. Однако уровень жидкости не должен быть слишком низким, поскольку в этом случае быстро высохнет лезвие ножа. Если нож плохо смачи­вается, то вместо воды можно применить 10%-ный этанол или ацетон. Однако в этом случае надо более внимательно следить за уровнем жидкости [70, 160]. Выпуклый мениск часто ведет к то­му, что жидкость начинает стекать по передней стороне ножа. Если это произойдет, то нужно остановить ультратом, немного отвести нож и кусочком фильтровальной бумаги с острым краем очень ос­торожно промокнуть каплю на передней поверхности ножа. Затем процесс получения первого среза повторяется. Слишком низкий (вогнутый) мениск может привести к ухудшению процесса реза­ния [70, 160].
  

5.4.6. Начало резания

  
   Механизм подачи объекта следует включать после того, как бу­дет сделан первый толстый срез. Если необходимо использовать первые срезы, то микроподачу надо включить за несколько микро­метров до контакта образца и ножа. После получения нескольких контрольных срезов толщиной 80-90 нм уменьшают подачу (обычно нагрев) до нужного (контролируя по цвету срезов), за­крывают нож и ванночку специальной прозрачной коробочкой и производят ультратомирование. В ультратомах, где используется тепловая подача образцов, толщина УС соответствует шкале в первые 15 мин, затем надо либо увеличить нагрев, либо остано­виться и, включив вентилятор, дать стержню остыть в течение 20-30 мин.

0x01 graphic

   Рис. 17. Способ резания объектов (1) с анизотропной (ориентированной) внутренней структурой, длинная ось которых должна располагаться пер­пендикулярно к режущему краю (2).
  
   Начинать резание надо средней третью ножа, а затем, когда пойдут хорошие УС, аккуратно передвинуть нож таким образом, чтобы продолжать резание самой лучшей частью его режущего края. Передвигать нож следует очень осторожно, чтобы не срезать толстого куска ткани. При резании волокнистых ориентированных структур их Длинная ось должна располагаться перпендикулярно к режущему краю ножа (рис. 17). При затачивании пирамидки для лучшей ориентации рядом с интересующей структурой можно на­нести тонкой иголкой точку на срезанной поверхности и в даль­нейшем использовать эту метку в качестве ориентира [70, 160]. При изготовлении УС с монослоя клеток часто требуется уже пер­вый срез изготовить нужной толщины, для этой цели существуют специальные методы. Вначале надо добиться, чтобы плоскость пирамидки была строго вертикальна и параллельна режущему краю. При этом дугообразный держатель головки с образцом устанавли­вают в вертикальном положении, и головку с образцом закрепля­ют в нем таким образом, чтобы длинная ось пирамидки была го­ризонтальной. Поворачивая держатель ножа, режущий край распо­лагают строго параллельно плоскости пирамидки, угол наклона ножа должен быть равен 0. Осве­титель закрепляют почти под прямым углом к верхней грани ножа с тем расчетом, чтобы в стереомикроскоп был виден яр­кий блик от передней грани но­жа. Пирамидку опускают несколько ниже режущего края, и нож медленно и очень осторож­но подводят к ней до касания пе­редней гранью. Если плоскость пирамидки расположена в вер­тикальном положении, то на блике появляется трапециевид­ной формы темное пятно, соответствующее полному контакту плоскости пирамидки с пере­дней гранью ножа. Напротив, ес­ли плоскость пирамидки не вер­тикальна, то на блике образуется тонкая полоска касания ее ребра с передней плоскостью ножа. В этом случае надо изменить угол закрепления головки с образцом в дугообразном держателе и по­вторить процедуру, последова­тельно добиваясь того, чтобы плоскость пирамидки и передняя грань ножа были параллельны друг другу.
   Более простой является оценка параллельности пирамидки и передней грани ножа по изменению толщины тени, отбрасывае­мой ножом на плоскость пирамидки. Для этого объект устанавли­вают таким образом, чтобы режущий край находился на уровне середины пирамидки. Затем нож подводят к пирамидке почти до касания. При определенном положении стереомикроскопа и осве­тителя видно, что режущий край отбрасывает тень на плоскость пирамидки. В этом положении очень осторожно и медленно опу­скают пирамидку, следя за толщиной тени. Если она уменьшается, то верхняя грань пирамидки расположена ближе к вертикальной плоскости, проходящей через режущий край, чем нижняя, а если увеличивается, то наоборот. Теперь точно так же надо соответству­ющим образом изменить угол закрепления головки с образцом в дугообразном держателе и всю процедуру повторить вновь [125].
   Наконец, можно дугообразный держатель вместе с блокодержателем и пирамидкой повернуть точно на 90®. Режущий край ножа установить строго перпендикулярно оси кронштейна (положение "0" на вращающемся столике). Перемещая дугообразный держатель в своем креплении, добиваются, чтобы край ножа и плоскость пирамидки были параллельны. После чего дугообразный держа­тель поворачивают на 90® в исходное положение и вновь, на этот раз путем поворота ножа, добиваются параллельности режущего края и плоскости пирамидки, а затем начинают резание.
   Для получения первого УС нужной толщины после ориента­ции пирамидки вначале нож подводят максимально близко к объ­екту, но касаться пирамидки ни в коем случае нельзя. Далее вклю­чается движение объекта и с помощью ручной ультраподачи начинается подведение ножа к объекту. При этом поворачивать ручку надо на величину, которая соответствует нужной толщине УС.
   При работе на ультратоме надо помнить: 1) закрепление и ориентировка объекта производятся только при закрытом положе­нии объектного стержня; 2) вертикальное совмещение объекта и ножа осуществляется после установки последнего на уровне планки ножевого столика (лезвие ножа должно совпадать с верхней го­ризонтальной плоскостью планки); 3) в случае несимметричного перемещения объектного стержня относительно лезвия ножа мо­жет происходить захват жидкости и срезов из ванночки ножа при обратном ходе объекта [70, 160].
  

5.4.7. Скорость резания

  
   Скорость резания имеет чрезвычайно важное значение для получения хороших УС. Обычно при использовании алмазных но­жей применяют скорость 1 мм/с, для стеклянных ножей более подходит скорость 2 мм/с. При этом надо учитывать твердость и ориентацию структур в блоке, угол и остроту ножа, его наклон, толщину срезов (рис. 17 и 18). Хотя обычно считается, что более твердые образцы лучше режутся при более низкой скорости (1 мм/с или ниже), однако некоторые образцы, такие как кость или зубы, лучше режутся при более высокой скорости (5-10 мм/с). В случае, если объект режется плохо, рекомендуют последователь­но изменять параметры резания и постепенно подобрать наиболее оптимальные, что позволит получить УС удовлетворительного ка­чества [70, 160].

0x01 graphic

   Рис. 18. Процессы, происходящие с объектом при резании ножами с различными углами лезвия ( а ) и резания (е ). А - ? < 45®, ? от 2 до 4®: происходит резание; Б - 45® < ? <50®, ? от 4 до 7®: скалывание; В - ? > 50®, ? > 10®: соскабливание. 1 - пирамидка, 2 - нож.
  
  

5.4.8. Способы расправления УС

  
   В процессе резания происходит сжатие УС. При высокой скорости этот эффект увеличивается. Даже в самых оптимальных условиях сжатие УС достигает 5-10 %. Его можно устранить, если над УС в течение 4-8 с подержать стеклянную палочку или кусочек фильтровальной бумаги, смоченные хлороформом или ксилолом, пары которых размягчают и расправляют срезы. Для расправле­ния срезов удобно пользоваться также петлей для вылавливания ПС. Петлю опускают в ксилол и быстро вынимают. Затем петлю подносят к срезам. Через прозрачную каплю ксилола прекрасно видно, как расправляются УС. Пары хлороформа могут повреж­дать УС. Нельзя допускать попадания растворителя в ванночку. Пользоваться этими приемами следует лишь в крайних случаях. Вместо органических растворителей можно воспользоваться нагретой стеклянной палочкой или раскаленной электрическим током петлей, которые подносят сверху к срезам. Процесс расправ­ления можно контролировать под стереомикроскопом. Однако нельзя допускать слишком сильного нагрева срезов. При расправ­лении срезы меняют окраску и увеличивают свою площадь. УС могут растянуться больше, чем необходимо, при этом повреждает­ся структура тканей [70, 160].
  

5.4.9. Определение толщины УС

  
   После расправления УС определяют их толщину, так как пока­зания шкалы ультратома "толщина срезов" достаточно грубые и, как правило, недостоверные. Более точная оценка толщины УС (в нанометрах) может быть сделана по цвету интерференции.
   Грубая шкала: серые - ниже 60, серебристые - 60-90, золо­тые - 90-150, пурпурные - 150-190, синие - 190-240 нм.
   Точная шкала: серые - 31-32, белые - 39-40, серебристые - 54, желтые - 70, золотые - 90-91, коричневые - 108-109, красно-коричневые - 128-129, фиолетовые - 148-149, голубые - 180-181, желто-зеленые - 215-216 нм.
   Чрезвычайно тонкие УС толщиной менее 30 нм часто рас­смотреть не удается - они названы "невидимыми". Существует много других способов более точного определения толщины УС [129, 359].
  

5.5. СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА БЛОКОВ

  
   Если УС получаются с трудом, то необходимо заточить пира­мидку до очень маленького плато треугольной формы, что сущест­венно облегчает получение УС. С маленькой трапециевидной пи­рамидки УС также получить легче, чем с большой. Для удлинен­ных структур лучше использовать пирамидки, вытянутые по направлению резания. Если образцы имеют зоны разной твердо­сти, то рекомендуется ориентироваться на более твердые участки. Во время затачивания пирамидки можно оценить качество самого блока. Даже мягкий блок следует попробовать резать, но если УС получаются плохие, то рекомендуется заточенный блок подержать при t=60®С ночь или дольше. Ловикриловые блоки можно под­вергнуть УФО, иногда это помогает. В некоторых случаях блок можно перезалить в другую порцию смолы.
  

5.6. СОБИРАНИЕ УС

  
   После получения достаточного количества срезов их собирают в группы, чтобы при монтировании они попали в центр сеточки. Плохие срезы удаляют с помощью ресницы. Если лента срезов прикреплена к ножу, то ее лучше отделить ресницей, дотронув­шись ею до поверхности среза. Сеточку осторожно захватывают пинцетом за край. Пинцет зажимают резинкой. Существует ряд методов взятия УС с поверхности жидкости в ванночке (рис. 19 и 20).

0x01 graphic

   Рис. 19. Способы взятия УС на сеточку. А - прикосновение сеточкой к УС сверху (А1 - неправильное положение сеточки, А2 - правильное положение); Б - подведение сеточки снизу. В - боковое прикос­новение к ленте УС вертикально погруженной в жидкость сеточкой (В1 и В2 -этапы взятия УС). 1 .- УС, 2 - сеточка, 3 - пинцет. Стрелка - направление дви­жения сеточки.
  
   1. Сеточка, установленная строго горизонтально точно над сре­зами, движется вниз до прикосновения к УС и затем поднимается вверх (рис. 19, А). Технически это осуществляют следующим об­разом. Мениск жидкости в ванночке делают горизонтальным или слегка выпуклым. Выбирают группы хорошо расправленных УС, которые с помощью ресницы собирают в центре отраженного бли­ка. Сеточку подложкой вниз закрепляют в пинцете и подносят к выбранной группе срезов параллельно последней. Затем быстро касаются сеточкой срезов (погружать сеточку в жидкость нельзя) и отрывают ее от поверхности воды. В результате УС оказываются покрытыми каплей жидкости, которую аккуратно удаляют фильт­ровальной бумагой путем прикосновения к краю сеточки. Этот способ не очень эффективен. Возможно наложение срезов, образо­вание нахлестов и складок.
   2. Сеточка погружается в жидкость, подводится под ленту УС в горизонтальном положении, и поднимается вверх (рис. 19, Б). В этом случае УС оказываются плавающими на капле жидкости, оставшейся на сеточке. Жидкость аккуратно отсасывается фильт­ровальной бумагой.
   3. Сеточка погружается в жидкость в вертикальном положении. Ее край находится рядом с краем ленты УС, который приводится в контакт с сеточкой, чему можно помочь, двигая УС с помощью ресницы (рис. 19, В). Вначале опускают сеточку на 2/3 в жидкость вертикально немного в стороне от ленты срезов. Придерживая ре­сницей край ленты сверху (если сбоку, то срезы прилипнут к ре­снице), подводят сеточку под срезы до тех пор, пока ближайший к пинцету слегка выступающий из воды край сеточки не коснется крайнего среза. Осторожно поднимают сеточку вертикально - за ней вытягиваются и срезы. При поднимании сеточки УС прикреп­ляются к ней [70, 160, 333].

0x01 graphic

   Рис. 20. Способ взятия УС (1) с помощью проволочной петли (2), и монтирова­ние УС на бленду (3) под стереомикроскопом (4).
  
   Можно УС, не образующие ленту, поместить на сеточку при помощи платиновой петли, которой вначале и захватывают срезы (рис. 20, 1 и 2). Для этой цели используются петли диаметром немного больше сеточки. Петлю ориентируют сверху над срезами, затем опускают на них и срезы оказываются заключенными внут­ри петли, после этого ее поднимают и капля воды со срезами от­рывается от жидкости. Петлю ориентируют над лежащей на филь­тровальной бумаге сеточкой и опускают до тех пор, пока срезы не покроют поверхность сеточки с подложкой.
   Наконец, для точного помещения УС на сеточку готовят металлическую петлю диаметром чуть больше сеточки, которую покрывают формваровой подложкой (см. гл. 7). Ленту срезов вы­лавливают на петлю, подводя ее под срезы. Затем под микроско­пом сеточку подводят под петлю и ориентируют так, чтобы срезы оказались над нужным участком сеточки, которая располагается на столбике. Петлю опускают, и сеточка как бы продавливается сквозь петлю. Срезы оказываются на сеточке. При работе с серий­ными УС вместо сеточки лучше использовать бленду - лента сре­зов точно помещается над ее отверстием (рис. 20, 3).
   В качестве рабочей жидкости для заполнения ванночки можно использовать слабый (0.2%-ный) раствор желатины. При его охлаждении срезы становятся неподвижными. На срезы помеща­ют сеточку, к которой они прилипают, а затем раствор желатины подогревают до t=60®С. Остатки желатины удаляют, помещая сеточки с УС в каплю 2%-ной уксусной кислоты на 30 мин. Потом срезы помещают на 30 мин в Трис-буфер (рН 7.1), далее промы­вают в воде. Все процедуры проводят при t=60®С.
   Формваровую подложку лучше помещать на гладкую сторону сеточки (подложка не будет коробиться). Однако в этом случае ма­нипулировать сеточкой сложнее, так как УС плохо видны в отра­женном свете. Напротив, если подложка и УС расположены на матовой стороне сеточки, то они хорошо видны в отраженном свете [70Т 139, 160].
  

5.7. ПРОБЛЕМЫ УЛЬТРАТОМИИ, ИХ ПРИЧИНЫ И СПОСОБЫ УСТРАНЕНИЯ

  
   УС не видны. Причины: 1) некорректный угол освещения; 2) неправильный уровень жидкости в ванночке; 3) несоответству­ющий угол наблюдения.
   УС не образуются. Причины: 1) ультратом исчерпал всю по­дачу; 2) тупой нож; 3) блок слишком мягкий; 4) нож или блок плохо закреплены в держателе или в головке; 5) отрицательный угол наклона ножа; 6) смачивание поверхности блока; 7) виб­рация; 8) температурные флюктуации; 9) инструментальные де­фекты.
   Нерегулярное резание - срезы образуются не при каждом ходе объекта или УС получаются регулярно, но толщина их варьирует. Причины: 1) слишком велик угол наклона ножа; 2) плохо закреп­лен нож или блок; 3) тупой нож; 4) блок плохо заполимеризован.
   Рекомендации: 1) вначале нужно увеличить подачу объекта, тогда срезы будут толще; 2) если толщина УС не удовлетворяет, то можно попытаться вновь заточить пирамидку, уменьшив площадь левой грани блока; 3) если и это не помогает, оставить блок на ночь при t=60®С.
   Искривленная полоска УС - в результате УС легко теряются во время монтирования и могут образовывать складки. Причины:
   1) плохо заточенная пирамидка (грани, полученные при заточке
блока старым лезвием, шероховатые; верхняя и нижняя грани не
параллельны или имеют зазубрины); 2) одна часть режущего края
алмазного ножа использовалась чаще, чем другие; 3) плохое вы-
равнивание стеклянного ножа по отношению к пирамидке; 4) ре-
зание дефектным ножом; 5) неодинаковая твердость разных участ-
ков блока; 6) сжатие одной из сторон среза.
   Рекомендации: 1) необходимо остановить резание; 2) если ме­ниск жидкости слишком высокий и УС отрываются от ножа, не успев соединится со следующим, то надо убрать немножко жидко­сти из ванночки.
   Разорванная лента УС - в результате некоторые УС могут быть потеряны, что нарушает последовательность серийных УС. Причи­ны: 1) плохо заточенная пирамидка (верхняя и нижняя грани не параллельны); 2) нож не параллелен нижнему краю пирамидки; 3) пирамидка слишком высокая; 4) уровень жидкости в ванночке слишком высок.
   УС не образуют ленту. Причины: 1) верхний и нижний края пирамидки не параллельны между собой и лезвием ножа; 2) не­правильный уровень жидкости; 3) скорость резания слишком ма­ла; 4) образование статического заряда на пирамидке; 5) шерохо­ватые грани пирамидки, полученные при заточке блока повреж­денным лезвием (если верхняя грань параллельна ножу, а нижняя нет, то ленточка УС может образоваться, но будет прикрепляться к какой-нибудь стороне ванночки и последующие УС будут смор­щиваться); 6) мениск жидкости слишком высокий (срез отрывает­ся от ножа, не успев соединится со следующим); 7) нож закреплен слишком низко; 8) угол наклона и угол ножа малы.
   УС не отрываются от кромки ножа и не попадают в ванночку, а увлекаются вслед за блоком. Причина - мягкий блок (УС не пол­ностью отрываются от блока).
   Рекомендации: 1) увеличить угол наклона ножа и(или) угол режущего края; 2) увеличить скорость резания; 3) понизить ме­ниск, удалив немного жидкости из ванночки.
   УС захватываются пирамидкой при обратном движении ножа. Причины: 1) уровень жидкости в ванночке слишком высок;
   2) угол резания мал; 3) недостаточная скорость резания; 4) мягкий образец; 5) поверхность блока грязная или влажная; 6) нож
грязный или ,его передняя поверхность влажная; 7) на поверхности блока образовался статический заряд.
   Рекомендации: в последнем случае надо увеличить влажность в комнате; кроме того, статическое электричество, накапливающееся на срезах в результате трения ножа о блок ткани, может быть уда­лено ионизацией воздуха при помощи радиоактивного источника или созданием вблизи ножа поля высокого напряжения, можно применять ртутно-кварцевую лампу, которой локально освещается режущийся участок блока, или ионизировать воздух ионизаторами Микулича либо бытовыми ионизаторами.
   Смачивание поверхности блока обусловлено тем, что поднима­ющийся во время резания блок, касаясь ножа, захватывает каплю жидкости из ванночки. При этом полученные срезы устремляются за каплей; в последующий цикл все повторяется. Иногда при этом вообще невозможно получить срез. Данный дефект возможен только при работе с ультратомами, у которых при обратном ходе блок пересекает кромку ножа (например, LKB). Подобное чаще на­блюдается при резании больших пирамидок (более 2 мм ).
   Причины: 1) смачивание поверхности пирамидки или пере­дней поверхности ножа; 2) уровень жидкости в ванночке слишком высок; 3) скорость резания низка; 4) угол резания мал; 5) не рабо­тает устройство отведения ножа при обратном ходе; 6) загрязнение пирамидки, 7) неправильная установка ножа по высоте.
   Рекомендации: из ванночки надо убрать лишнюю жидкость, фильтровальной бумагой осушить блок и переднюю грань ножа. Некоторые блоки никак не удается порезать при низких скоростях. Вода из ванночки все время попадает на лицевую поверхность бло­ка. Тогда нужно осушить поверхность блока, увеличить скорость резки, а затем, когда началась резка, снизить скорость.
   Очень толстые УС. Причины: 1) образец или нож плохо зажа­ты в держателе; 2) скорость ультратома слишком мала; 3) тупой нож; 4) неподходящий угол ножа (большой); 5) неправильно выбрана подача объекта; 6) сквозняк в комнате; 7) неудачная полимеризация.
   Рекомендации: надо изменить параметры резания, поставить блок в термостат на ночь при t=80®С, а затем (или сразу) поме­стить блок в холодильник и сделать несколько первых УС.
   Толщина УС варьирует. Причины: 1) тупой нож; 2) падение электрического напряжения в сети; 3) неисправность ультратома; 4) сквозняки и температурные флюктуации; 5) плохо закреплен нож и(или) объект; 6) блок слишком мягок или велик; 7) неподхо­дящая скорость резания; 8) неправильный угол ножа.
   УС идут через цикл, т.е. один ход блока вниз дает срез, а следу­ющий не дает или один срез слишком толстый, а следующий слишком тонкий, затем опять толстый и т.д. Это явление одного порядка. Причины: 1) плохо подобран угол резания; 2) неподходя­щая скорость резания; 3) неправильное соотношение угла и скоро­сти резания; 4) тупой нож; 5) излишне мягкая заливка; 6) слиш­ком маленькая подача.
   Рекомендации: иногда эту трудность можно ликвидировать, ес­ли увеличить микроподачу; в противном случае необходимо изме­нить угол ножа, скорость резания или и то и другое.
   Варьирование толщины в пределах одного УС. Участки разной толщины на УС в световом микроскопе (СМ) выглядят полосами разного цвета. Причины: 1) большой ободок чистой смолы вокруг образца - перезаточить блок; 2) если полосы перпендикулярны но­жу, то причина их появления в ноже; 3) если участки с разной тол­щиной не имеют определенной направленности, а располагаются хаотично, то в блоке остались участки плохо заполимеризовавшейся смолы - нужно перезаточить блок и уменьшить площадь срезаемой поверхности; 4) если утолщенные участки располагают­ся параллельно режущей кромке ножа, то они могут быть вызваны вибрацией.
   Спонтанная подача. Толщина получаемых УС превышает ве­личину, указанную на приборе, или происходит резание при вы­ключенной подаче. Причины: 1) выталкивание блока из блокодержателя в результате неправильного закрепления блока или несоответствия толщины блока и блокодержателя.
   Рекомендации: зажимать блок в блокодержателе за несколько часов до резания.
   Складчатость УС - УС складываются или морщатся на краю ножа. Причины: 1) уровень жидкости в ванночке слишком мал; 2) образец очень мягкий; 3) загрязнен край ножа; 4) скорость ре­зания велика; 5) поверхность пирамидки слишком большая; 6) ту­пой нож; 7) угол резания велик; 8) нож плохо закреплен; 9) непра­вильный угол ножа; 10) слишком большое скопление УС на по­верхности жидкости.
   Складки только в каком-то определенном участке среза. При­чины: 1) плохая пропитка тканей; 2) неравномерная полимериза­ция.
   Рекомендации: 1) заточить новую - меньшего размера пира­мидку из хорошо залитой части материала.
   "Раскалывание" УС ножом. Причина - слишком хрупкая и твердая заливка, резать такие блоки трудно. Рекомендации: 1) по­пытаться резать, изменив угол ножа или изготовив нож с углом 55®; 2) подобрать адекватную скорость резания.
   Смещение частиц ножом. Какие-либо плотные частицы (на­пример, ферритин) разносятся по срезу ножом и встречаются по­рой в самых неожиданных местах. Причина - сжатие плохо полимеризованного материала.
   Загрязнение УС. Причины: 1) нож не закрыт; 2) грязная ван­ночка.
   Рекомендации: при резании (особенно серий УС) нож и ван­ночку следует прикрывать специальной крышкой.
   Сжатие УС. Причины: 1) образец слишком мягкий; 2) неадек­ватное расправление; 3) скорость резания велика.
   Рекомендации: изменить скорость резания или расправить участки сжатия парами органического растворителя (хлороформ, ксилол).
   Следы от дефектов ножа. Зазубрины направлены перпендику­лярно к краю ножа и волнам так называемого четтера (chatter).
   Алмазный нож. Причины: 1) используется область ножа с де­фектом; 2) неосторожные манипуляции с ножом, например при чистке; 3) слишком толстый первый УС; 4) высокая скорость ре­зания (более 1 мм/с); 5) очень большой образец (более 1 мм ); 6) велик угол режущего края ножа; 7) появляющиеся внезапно зазубрины могут быть следствием твердой частицы, выпавшей из среза и оставшейся на лезвии ножа.
   Стеклянный нож. Причины: 1) плохое качество режущего края; 2) неправильное выравнивание ножа и пирамидки - одна часть ножа становится тупой и начинает оставлять след; 3) плохая подводка ножа, толстый первый срез; 4) образец слишком твердый, чтобы его резать стеклянным ножом; 5) режущий край по­врежден лезвием бритвы при изготовлении ванночки.
   Следует отметить, что совсем без царапин срезы получаются редко. Все дело в величине этих царапин. Царапины, идущие пер­пендикулярно к острию ножа и видимые на срезе при увеличении 5000, свидетельствуют о плохом качестве ножа. Однако даже хороший нож имеет некоторые неровности, но царапины, производи­мые им, видны лишь при больших увеличениях. Такие царапины в ЭМ представляют чередование светлых и более темных полос, идущих через весь срез и указывающих направление резания. Ес­ли таких полос немного, то они обычно не мешают исследованию.
   Волнистость УС (четтер). Это дефект ультратомии, который выражается в том, что на срезе чередуются более толстые и более тонкие участки, при этом полосы идут параллельно режущей кромке ножа. Четтер является результатом высокочастотной виб­рации края ножа, вызванной трением между образцом и ножом. Длина волны колебаний при этом составляет менее 1 мкм. Иногда звук слышен во время резки. Четтер распространяется на весь УС, либо на его отдельную область, отличающуюся по твердости от ок­ружающих участков, и не связан с дефектами ультратома. Разрабо­таны и продаются мониторы для детектирования четтера.
   Причины: 1) мягкая заливка; 2) неправильная установка сис­темы блок-нож; 3) плохо приготовленный или затупившийся нож; 4) слишком большая скорость резания; 5) слишком большой угол резания; 6) плохо закрепленный нож или объект; 7) неправильно заточенная пирамидка (например, слишком большая высота тра­пеции по сравнению с ее основанием); 8) вибрации ультратома или стола.
   Рекомендации: 1) уменьшить скорость - при этом четтер мо­жет исчезнуть, его амплитуда (но не частота) уменьшится, либо он приобретет локальный характер; 2) если четтер не исчезает при изменении скорости резания, то надо уменьшить размер среза, особенно ширину, или изменить угол режущего края ножа; 3) если требуются большие УС, то можно рекомендовать "методическое" резание. Начинать "методическое" резание надо с помощью ножа с углом в 50®. Этот угол наиболее оптимален для смол, используе­мых в ЭМ. При этом длина хорошего участка лезвия больше, чем у ножей с углом 45®.
   Вибрация. Напоминает четтер, но частота колебаний при этом меньше. Причина вибрации не связана с параметрами резания. Вибрация может быть отдифференцирована от четтера с помощью изменения скорости резания. При вибрации уменьшение скорости резания в 2 раза снижает число вибрационных линий также в 2 раза. Такая взаимосвязь между скоростью и частотой характери­зует параметры вибрации. Этот дефект встречается при резании очень больших по площади пирамид и очень твердых блоков.
   Причины: 1) плохо закрепленный нож или блок; 2) образец выступает из держателя на большую величину; 3) наружная вибра­ция (центрифуги, лифт, транспорт); 4) инструментальный дефект.
   Рекомендации: отключить подачу и внимательно посмотреть на поверхность жидкости. Заметное дрожание свидетельствует о том, что источник вибрации внешний. Если его устранить нельзя, то прекратить резание. Вибрация может быть вызвана самим опе­ратором, если он дотрагивается до прибора во время автоматиче­ской подачи. Нужно проверить, хорошо ли закреплены все винты. Иногда непрочная фиксация блока, ножа или блокодержателя мо­жет вызвать вибрацию. Она может возникнуть, если слишком твердый блок ударяется о нож на большой скорости или блок очень широкий и захватывает большую часть режущей поверхно­сти ножа. Наконец, источником вибрации может быть сам ультра-том и тогда ее должен устранить инженер.
   "Распыление" УС. После того как УС с кромки ножа сходит в ванночку, он распадается на мелкие фрагменты, расплывающиеся по поверхности воды. Причина - плохая заливка, нередко сочета­ющаяся с плохой фиксацией.
   Рекомендации: 1) изменить скорость резания и(или) угол ре­жущего края; 2) увеличить толщину срезов.
   Загрязнение УС. Грязь, бактерии, пыль, осадки краски могут попадать на УС из воздуха, жидкости в ванночке, окрашивающих растворов. Жидкость в ванночке должна быть свежей. Окрашиваю­щие растворы необходимо готовить и хранить правильно. Масля­ная и сальная пленки хорошо видны на поверхности рабочей жид­кости в ванночке. Их источником может быть липкий слой ленты, используемой для приготовления ванночки. Это происходит при старении ленты и при ее хранении в теплом помещении.
   Дырки на УС. Причины: 1) пузыри в смоле; 2) неполная ин­фильтрация из-за плохого обезвоживания; 3) твердый объект или незаполимеризовавшийся участок в образце.
   Рекомендации: во время резания этот дефект устранить нельзя. При подготовке объекта нужно варьировать составом заливочных смол и временем пропитывания. Иногда плохо пропитанные час­тицы ткани выкрашиваются, прилипают к ножу и вызывают царапины на срезе.
   Объект вываливается из УС. Причины: 1) плохая пропитка и полимеризация; 2) блок слишком мягкий.
   Рекомендации: предложено [236] "грунтовать" наружную по­верхность плохо адгезирующихся с ЗС объектов, например воско­вых или хитиновых структур, с помощью 1%-ного раствора гаммаглицидоксипропилтр-иметоксипропана (Z 6040), растворенно­го в 80%-ном этаноле.
   УС прилипают к реснице. Причины: 1) грязная ресница; 2) слишком сильное нажатие ресницей на срезы.
   УС плохо двигаются в ванночке. Причина - загрязнение рабо­чей жидкости; ее надо сменить и добавить следы детергента.
   УС разбегаются от сеточки. Причина - грязная сеточка; необ­ходимо очистить ее в кислом спирте или прокалить "голую" сеточ­ку в пламени спиртовки. Может помочь заземление держателя микротома с блоком.
   Проблемы при просмотре УС в ТЭМ. Нестабильность УС под пучком электронов обусловлена либо неполной полимеризацией, либо потерей летучих компонентов во время просмотра [70, 139, 160, 333, 359, 367]
  

5.8. ПОЛУЧЕНИЕ УС БЕЗ ЗАЛИВКИ

  
   Криостатный срез (5-20 мкм) свежей или фиксированной в альдегиде ткани помещают на закругленный конец эпоксидного блока, дают ему оттаять и фиксируют в альдегиде или ЧО. После ополаскивания срезу дают подсохнуть на воздухе, затем с него можно получить УС, которые снимают в ванночку с водой; УС можно контрастировать или подвергнуть гистохимической обра­ботке. При данной обработке, безусловно, вымывается ряд компо­нентов, в частности гликоген, однако активность некоторых ферментов сохраняется [160, 333].
  

5.9. ХРАНЕНИЕ УС

  
   Хранить сеточки с УС лучше всего в специальных контейне­рах, можно в чашках Петри на двойном слое фильтровальной бу­маги в чистом помещении.
  

5.10. ОСОБЕННОСТИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ УС ИЗ АКРИЛОВЫХ ЗС

  
   Изготавливают УС обычным способом. При работе с гидро­фильными блоками (из Ловикрилов К4М и КИМ, ЛР Байт и ЛР Голд) мениск жидкости в ванночке должен быть вогнутым и зна­чительно ниже, чем при использовании эпоксидных смол, а также НМ20 и НМ23. Это лучше достигается при использовании стек­лянных ножей. Обычно ванночка заполняется водой. Если мениск высокий, то вода очень быстро смачивает гидрофильный блок.
   Пирамидка обводняется немедленно после контакта с режу­щим краем. Поэтому рекомендуется применять большую скорость резания (2-5 мм/с) и больший угол наклона ножа (6). Чем круп­нее пирамидка, тем больше должна быть скорость резания. При работе с К4М и КИМ лучше начинать резание при большей ско­рости, а после достижения хороших срезов скорость рекомендуется снизить. УС быстро поглощают воду во время плавания на по­верхности жидкости в ванночке. Во избежание деформаций, свя­занных с поглощением воды, полученные УС необходимо сразу же монтировать на сеточки.
   Лкрилаты имеют несколько меньший показатель преломления, чем эпоксидные смолы. Поэтому УС, имеющие одинаковый цвет интерференции с эпоксидными, будут несколько тоньше. Бледно-серые акриловые УС не очень стабильны под электронным лучом. Поэтому рекомендуется изготавливать темно-золотистые или зо­лотистые УС, поскольку на поверхности воды через несколько се­кунд они расправляются до серебристо-золотых. УС монтируются обычно на сеточку с подложкой. Если эти срезы необходимо ис­пользовать без подложки, то лучше прикреплять их к полирован­ной (блестящей) поверхности сеточки. Для иммуномечения мож­но использовать как свежеизготовленные УС, так и после длитель­ного хранения в боксах [139, 333, 359, 367].
   С ловикриловых блоков при помощи криоультратома можно получать сухие УС толщиной 100-200 нм для изучения их посред­ством рентгеновского микроанализа (РМА). УС собирают на сухой нож, ресницей переносят на покрытую формваром ЭМ-сеточку и прижимают к сеточке полированной серебряной палочкой. Для то­го чтобы уменьшить сжатие во время сухого резания, температура в криокамере поддерживается на уровне от -30 до -60®С (ниже точки "стеклования" смолы). УС, полученные при низкой температуре, переносят в колонну ЭМ с помощью криопереносной сис­темы [333, 359, 367].
   Блоки из гидрофильных акрилатов, содержащие более 5 % во­ды, режутся с большим трудом, из-за того что они очень мягкие и склонны к быстрому поглощению воды. Сильная гидрофильность блоков приводит к быстрому смачиванию поверхности пирамид­ки. Простое убирание воды со смоченной поверхности фильтро­вальной бумагой не помогает. Получаемые УС расползаются и по­крываются трещинами. Для получения хороших УС необходимо срезать увлажненную смолу ножом (сделать один или два ПС), пе­ред тем как продолжить ультратомию.
   Если блоки хранились во влажной среде, то они также режутся плохо. И в этом случае перед получением УС вначале надо сделать несколько ПС. Рекомендуется хранить блоки в вакууме или в экс­икаторе с водопоглотителем.
   Акриловые УС, которые обычно используют для иммунной ЭМ, желательно монтировать на никелевые или золотые сеточки. В случае применения медных сеточек их рекомендуется покрыть целлоидином (или формваром): окунуть в 0.05%-ный раствор целлоидина в амилацетате и быстро промокнуть на фильтровальной бумаге. Обработанные таким образом сеточки покрывают колодиевой подложкой. Определенные сложности возникают при поме­щении УС, например из ЛР Байт, на углеродную гидрофобную подложку, последнюю в этом случае подложку подвергают катод­ному травлению.
   При исследовании акриловых УС в ТЭМ рекомендуется про­смотреть их при малой интенсивности пучка. Затем постепенно повысить яркость и увеличение. При этом происходит образова­ние добавочных поперечных сшивок и УС делаются более прочны­ми [139, 333, 359, 367].
  

5.11. УС ИЗ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ (ПЭГ)

  
   При изготовлении УС их толщина может быть определена только по показаниям прибора, но при одном и том же положении ручки толщина УС из ПЭГ примерно в 2 раза больше, чем эпок­сидных. УС из ПЭГ почти не уступают по качеству эпоксидным. Твердые блоки режутся лучше. Для резания блоков из ПЭГ нужны сухие ножи. УС удобно собирать с помощью платиновой петли, смоченной 25%-ным раствором сахарозы, и помещать на угольно-формваровую подложку, покрытую полилизином (0.1%-ный раствор, рН 8.0). После монтирования УС на сеточке с подложкой их переносят в 25%-ный этанол, затем в воду, контрастируют уранилацетатом (УА) и цитратом свинца (ЦС) (по 30 с). Нельзя до­пускать подсыхания УС. Контрастирование не является необходи­мым. Далее следуют промывание в воде, обезвоживание в этаноле и высушивание в критической точке (см. гл. 18). После высуши­вания срезы из ПЭГ нельзя подвергать действию атмосферного воздуха. Хранить высушенные УС лучше в вакууме или над силикагелем в эксикаторе. Удаление ПЭГ из срезов достигается посте­пенным его выплавлением при t=60®С [333, 359, 367].
  

5.12. ПОЛУТОНКИЕ СРЕЗЫ (ПС)

  
   Перед исследованием образцов в ТЭМ, как правило, необходи­мо иметь четкое представление о ткани на уровне СМ. Для этой цели вначале из блока готовят ПС толщиной 0.5-2 мкм. Для изго­товления ПС больших размеров применяются так называемые но­жи Ральфа. Чаще всего они используются для получения парафи­новых срезов, срезов из мягких акрилатов или эпоксидных смол. При резании более твердых эпоксидных смол такие ножи обычно тупятся после 20-50 срезов [11, 41, 73, 124].
  

5.12.1. Процедура получения ПС

  
   Процедура изготовления ПС во многом сходна с таковой для УС (см. Приложение, 6.2). Для изготовления ПС, после того как блок укреплен в блокодержателе ультратома, ручным (не автома­тическим) перемещением блока по вертикали получают срезы. ПС толщиной 2 мкм можно получить сухим способом - без исполь­зования ванночки с водой. Срезы при этом снимают с ножа тон­кой кисточкой, смоченной водой, или тонким пинцетом, что сложнее. Срез помещают в каплю воды на чистое предметное стек­ло или на стекло, смазанное улучшающим адгезию ПС веществом (см. Приложение, 6.3).
   При получении более тонких ПС применяют ванночку с водой. Плавающие на поверхности воды срезы вылавливают металличе­ской петлей. Размер петли 5 мм в диаметре, она располагается под углом 100 к держателю. Хранить ее надо в пробирке и промывать время от времени спиртом и ацетоном. Если ПС скручиваются, то рекомендуется уменьшить скорость резания. Очень часто процесс резания улучшается, если подышать на блок [11, 70, 160].
   ПС можно изготавливать на обычном ротационном микротоме типа МПС-2, состыкованном со стереомикроскопом, вместо стек­лянных ножей используют лезвия бритвы, закрепленные в специ­альном держателе. Щели между держателем и лезвием надо про­мазать спиртовым раствором клея, например БФ-6, чтобы предупредить забивание туда ПС [11, 36, 70].
  

5.12.2. Вылавливание ПС из ванночки

  
   ПС (лучше по одному) вылавливают следующими способами: 1) ПС накрывают сверху петлей, опускают ее в глубь ванночки и поднимают вверх - ПС будет плавать в капле воды, захваченной петлей; затем нужно коснуться предметного стекла всей плоско­стью петли, и капля воды стечет на стекло, увлекая за собой срез (рис. 21, А); 2) ПС монтируют на погружаемое в ванночку чистое покровное стекло или переносят на предметное стекло, обычно на каплю воды (рис. 21, Б); 3) для удобства работы с ПС предложено устройство в виде незамкнутого кольца из пластмассы, укреплен­ного на браншах микропинцета; при сжатии кольца полученная петля используется для захвата капли воды с ПС; размыкание кольца при соприкосновении с каплей воды на предметном стекле приводит к тому, что ПС оказывается на капле (рис. 21, В) [105, 160, 179].
  

5.12.3. Расправление ПС

  
   Перенос ПС прямо на каплю дистиллированной воды приво­дит к образованию множества складок, особенно если срез имеет большие размеры. Высушивание стекол с ПС лучше осуществлять при t=60®С. Для расправления складок на ПС их рекомендуется вначале перенести на каплю абсолютного этанола, а после насы­щения сразу же поместить на каплю воды. Быстрое разведение этанола приводит к увеличению поверхностного натяжения, что обусловливает расправление срезов.
   Если ПС имеют достаточную величину, то их можно сначала поместить в теплую воду, а затем с помощью ресницы выловить на предметное стекло, аккуратно расправляя. Для того чтобы меж­ду ПС и стеклом не образовывалось пузырьков воды, на стекло рекомендуется подышать [11, 36, 70].

0x01 graphic

   Рис. 21. Способы снятия ПС на стекло. 1 - ПС; 2 - стекло; 3 - проволочная петля; 4 - капля жидкости; 5 - спиртовка; 6 - ресница; 7 - размыкающаяся петля.
  

5.12.4. Высушивание ПС

  
   Предметное стекло с ПС необходимо положить на нагреватель­ный столик (t=60®С) минут на 30 или подогреть над пламенем спиртовки, строго следя за тем, чтобы вода не закипела и не обра­зовались пузырьки воздуха. Как только вода испарится, срез плот­но прикрепится к стеклу и его можно будет окрасить и просмот­реть в микроскопе.
  

5.12.5. Увеличение адгезии ПС к стеклу

   Для более прочного прикрепления ПС на поверхность пред­метного стекла рекомендуется предварительно нанести фгоридные производные металлов, например напылить в вакууме фторид магния до создания прозрачной пленки. При соприкосновении с ПС пленка образует прочное сцепление с его поверхностью за счет взаимодействия фторида магния с кальцием, находящимся в тка­ни, и образования нерастворимого фторида кальция. С этой же целью перед нанесением среза стекло можно протереть фтористой смесью (см. Приложение, 6.3.1). Методика позволяет использовать новые стекла без дополнительной очистки. Перед помещением срезов можно смочить стекло ацетоном или обработать смесью глицерина и яичного белка. Лучше всего стекло покрыть полили­зином [70, 139, 160]. Вместо полилизина для увеличения адгезивности стекла можно использовать раствор альцианового синего или прикрепить ПС на стекло, покрытое желатиной. ПС также надежно фиксируются на стекле с помощью разведенного спирто­вого раствора клея БФ-6 [27].
  

5.12.6. Окрашивание ПС

  
   Критическими факторами, влияющими на окраску ПС, явля­ются условия препарирования (в особенности режим полимериза­ции) температура окрашивающего раствора, длительность окра­шивания, рН окрашивающего раствора. При изготовлении ПС пе­ред их окрашиванием иногда проводят постполимеризацию для стабилизации полимера. ПС на капле воды нагревают до t=100®С. При плохом проникновении красителя рекомендуют предварительно обработать ПС подкисленной перекисью водорода (см. Приложение, 6.6).
   Очень часто при фиксации в ЧО блокируются химические связи, способствующие полноценному окрашиванию. В этом случае срезы предварительно обрабатывают раствором йодной кислоты, вымывающей ЧО, удалив перед этим из ПС эпоксид­ную смолу путем обработки насыщенным этаноловым или Метаноловым раствором КОН или NaOH. Однако такая обработка может повредить структуру тканей. Поэтому вначале рекоменду­ется размягчить срезы в дибутилфталате или диоксилфталате. Это сокращает щелочную обработку. Ранее считалось, что раствор этоксида должен созревать в течение 3-4 суток, однако специальные исследования не обнаружили изменения экстраги­рующей силы раствора в процессе созревания - он уже через 4 ч готов для использования [108]. Из ПС толщиной 2 мкм Эпон 812 удаляется раствором NaOH в этаноле в течение 15-20 мин, Аралдит М - 35-40 мин. Для удаления смолы можно ПС обработать этиленгликолем или диметилформамидом в течение 30-60 мин. После удаления смолы и промы­вания водой ПС можно окрашивать большинством гистологиче­ских красителей [11, 70, 72, 160] (см. Приложение 6.4 и 6.5). ПС можно не окрашивать, а обугливать. Для изучения ПС в фа­зовом контрасте проводят окисление ПС йодной кислотой [70, 160].
   Сложные методы полихромного окрашивания ПС в большин­стве случаев требуют удаления из срезов смолы [11, 70, 74, 267], однако в этом случае для предупреждения потери срезов следует пользоваться адгезивными смесями (см. Приложение, 6.3.1). ПС, полученные из залитых в эпоксидные смолы объектов, как прави­ло, не дают такого яркого окрашивания, как парафиновые срезы. Некоторые гистологические методики, предполагающие полихро­матические реакции, требуют фиксации без ЧО, так как она блокирует вещества, дающие реакции с кислыми красителями [36].
  

5.12.7. Заключение ПС

  
  
   Окрашенные ПС довольно долго (в течение многих месяцев и даже лет) хранятся в защищенном от света месте. Их можно не за­ключать в бальзам. Срезы, заключенные в бальзам, быстро выцве­тают, кроме того, их трудно повторно окрашивать. Однако для кратковременного использования в качестве среды для заключе­ния можно использовать канадский бальзам и другие подобные среды. Герметизацию объекта при этом удобно осуществлять ма­никюрным лаком (рис. 22). Применение эпоксидных смол в каче­стве среды для заключения препаратов замедляет их выцветание. Заключать ПС удобно в эпоксидную смолу, разбавленную до нуж­ной консистенции ацетоном.

0x01 graphic

   Рис. 22. Способ заключения ПС (1) пу­тем нанесения на стекло (2) окантовки (3) из лака для ногтей и покрытия по­кровным стеклом (4).
  
   Для заключения ПС рекомендуют использовать ту же ЗС, в ко­торую заключен объект. Для этого во время препарирования от полной заливочной смолы в пластмассовую пробирку отливают небольшую ее часть (около 1 мл), которая может длительно хра­ниться в морозильной камере. После изготовления и окрашива­ния ПС тщательно просушивают на термоплите при t=90®С. Прямо на плите на ПС наносят каплю смолы (предварительно нагретой до комнатной темпе­ратуры), на которую аккуратно помещают покровное стекло. После того как капля растечет­ся, предметное стекло с ПС убирают с плиты и выдержива­ют при комнатной температуре (можно при t=37®С), защи­щая от пыли, 4 сут - до затвердевания смолы (если смолу полимеризовать при слишком высокой температу­ре, то может происходить выцветание красителя на ПС). Описанная методика обеспечи­вает сохранность ПС в течение многих лет [346].
  

5.12.8. Исследование ПС в ТЭМ

  
   Для изучения ПС в ТЭМ их контрастируют в 2%-ном УА (5 мин), а затем в 0.2%-ном ЦС (2 мин). Исследования проводят при напряжении 120 кВ и выше (объектная апертура 60 мкм, конденсорная апертура 300 мкм).
  

5.12.9. Изготовление УС из ПС

  
   ПС можно перезалить и изготовить из него УС. Из ПС толщи­ной 2 мкм можно получить 50 УС по 40 нм. При перезаливке ПС монтируют на тефлоновую пластинку или стекло, напыленное тефлоном. После высушивания ПС покрывают капсулой, запол­ненной заливочной смесью, и полимеризуют (рис. 23). Если ис­пользована тефлоновая пластинка, то капсула вместе с ПС легко отделяется, а если обычное предметное стекло, то для отделения капсулы его необходимо погрузить сначала в горячую воду, а за­тем в сухой лед (или просто нагреть это место на спиртовке), тогда капсула с ПС отделится.
   Для лучшего отделения образцов от предметных стекол перед монтированием ПС стекла иногда покрывают силиконовым мас­лом: На стекло наносят каплю масла, затем стекло вытирают и тщательно полируют сухой тканью. Можно погрузить очищенное предметное стекло в 0.05%-ный раствор силиконовой смазки в хлороформе, вынуть и высушить [70, 160, 333].
   Если необходимо быстро получить УС с исследованного ПС, то последний помещают на каплю жидкости, расположенную на по­верхности заточенной пирамидки, после оттягивания жидкости ПС прочно прикрепляется к пирамидке и готов к ультратомированию. Вместо воды можно использовать каплю заливочной смеси. При этом, для того чтобы поверхности пирамидки и ПС были па­раллельны, ПС прижимают к пирамидке с помощью покрытого алюминием предметного стекла [70, 160].

0x01 graphic

Рис. 23. Схема перезаливки ПС (1) со стекла (2) в блоки (3).


5.12.10. ПС из акрилатов

  
   ПС из блоков, полученных из акрилатов, изготовить довольно легко. Однако для их расправления нельзя применять органиче­ские растворители. Расправлять их следует на капле воды, которую можно нагреть до t=60®С.
   Прекрасной средой для изготовления ПС является гликольметакрилат (ГМА). При этом с целью уменьшения сжатия и других полимеризационных дефектов кусочки заливают в предполимер ГМА. Если при получении ПС из ГМА-блоков срезы увеличивают свои размеры, то к заливочной смеси желательно добавить метил-метакрилат или дивинилбензен для уменьшения гидрофильное?. Добавление пластификатора, ПЭГ-400, улучшает качество резания и дает возможность получать серийные ПС. Чем толще ПС, тем легче они отстают от стекла. Для предотвращения такого отстава­ния рекомендуют при чистке стекол обрабатывать их хромпиком, а приклеенные ПС перед окрашиванием просушивать при t=76®С в течение ночи [70, 160, 333].
   Глава 6 КРИОУЛЬТРАСРЕЗЫ
  
   К настоящему времени процедура изготовления замороженных ультратонких срезов (крио-УС) достаточно хорошо отработана. При заливке осмированных и позитивно контрастированных крио-УС в тонкий слой акриловой смолы было продемонстриро­вано, что крио-УС, залитые таким образом, имеют сходный вид с обычными УС. Использование негативного контрастирования позволяет четко и с высоким разрешением визуализировать мем­браны [163, 348]. Крио-УС широко применяются для иммуно-ЭМ и РМА. Гидратированные крио-УС в витрифицированном состоя­нии могут изучаться в специальных крио-ТЭМ в условиях низких температур. Недостатком метода крио-УС является его сложность и потребность в дорогостоящем оборудовании. Криоультратомия не пригодна для изучения легочной и жировой ткани - в этом случае используют метод замораживания-замещения с последую­щим иммуномечением в режиме постэмбеддинга (см. гл. 12) [40, 134].
  

6.1. АППАРАТУРА ДЛЯ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

   Можно выделить три основных подхода в конструировании ус­тройств для криоультратомии: 1) весь ультратом находится в за­крытой охлаждаемой камере; 2) в охлаждаемую камеру помещают только объект и нож ультратома; 3) пользуются открытой охлаж­даемой камерой, окружающей объект и нож ультратома, что облег­чает манипуляции с крио-УС. Обычно в камерах для получения крио-УС нужная температура поддерживается за счет постоянного потока сухого азота, образующегося за счет регулируемого кипе­ния жидкого азота [162].
   Возможно резание как на сухой нож, так в ванночку с жидко­стью. В свою очередь перенос сухих крио-УС на опорную сеточку может быть осуществлен, во-первых, с помощью петли с каплей раствора сахарозы (УС переносят на сеточку с подложкой, где они оттаивают при комнатной температуре, раствор сахарозы удаляют, крио-УС промывают, затем производят иммуномечение); во-вто­рых, посредством ресницы (УС прижимают к сеточке с помощью двух охлажденных металлических блоков, подвергают сублимации или переносят охлажденными в крио-ТЭМ и исследуют в заморо­женном состоянии при t=-160®С с минимальной лучевой на­грузкой) [40, 162].
  

6.2. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

   В иммуно-ЭМ наибольшее распространение получила следую­щая процедура изготовления крио-УС: альдегидная фиксация (реже без нее), обработка в 0.6-2.3 М сахарозе (криопротектор), замораживание, криоультратомия, перенос на сеточку с помощью петли с каплей 2.1-2.3 М сахарозы, иммуномечение, контрастиро­вание с заливкой в метилцеллюлозу или метилцеллюлозу с ПЭГ, высушивание на воздухе.
   При работе с клеточными суспензиями рекомендуется после фиксации предварительно залить их в желатину или другой скреп­ляющий агент (альбумин, агар и др.) и снова обработать тем же фиксатором. Это облегчает манипуляции с крио-УС и улучшает их адгезию к подложке [40, 117, 162].
  

6.2.1. Фиксация и обработка криопротекторами

  
   Фиксация образцов при изготовлении крио-УС ставит следую­щие задачи: 1) сохранение ультраструктуры; 2) иммобилизация антигенов; 3) сохранение структурной интегрированное? препа­ратов после оттаивания. Образцы перед замораживанием обычно фиксируют в ФА при низких его концентрациях. Целые органы желательно фиксировать с помощью сосудистой перфузии. Опти­мальная степень фиксации определяется толщиной крио-УС - чем толще должен быть крио-УС, тем меньшая степень фиксации может быть использована. При работе с высокогидратированными объектами, такими как эмбриональные ткани, после химичес­кой фиксации желательно залить кусочек в смолу, например в 3-15%-ный полиакриламид. В случае суспензий в качестве зали­вочного материала можно пользоваться растворами желатины или агарозы. Для криоультратомии объект чаще всего пропитывают в смесях 2.3 М сахарозы с ФБФР (1 : 2, 1 : 1, 2 : 1), а затем в 2.3 М сахарозе (по 30 мин в каждой). После фиксации и обработки криопротектором объекты замораживают (см. гл. 2) [40, 117, 162].
  

6.2.2. Механизмы криоультратомии

  
   При изготовлении крио-УС может происходить либо скол, ли­бо пластическая деформация. Если имеет место пластическая де­формация, то срезы образуют непрерывную полоску, если скалывание, то прерывистую стружку. Последняя обычно формируется при t=-80®С, а непрерывная полоска - при t=-50®С.
   Энергия резания в определенной степени превращается в теп­ло. Это вызвано главным образом силами сдвига непосредственно у острия ножа. Часть тепла образуется за счет трения образца о грань ножа. При этом происходит мгновенное повышение температуры вершины пирамидки и среза. Тепло по мере выделения распространяется вдоль среза со скоростью резания.
   Качество криоультратомии зависит, во-первых, от температу­ры блока и ножа, во-вторых, от количества выделяющегося во вре­мя резания тепла. Толстые УС нагреваются в меньшей степени, чем тонкие. При изготовлении крио-УС таяние происходит только в поверхностном слое среза, контактирующем с ножом [221]. Выраженность повреждений ткани кристаллами льда больше в цент­ральных участках образца и меньше по периферии. Во время крио­ультратомии объект часто раскалывается, что приводит к образо­ванию поперечных трещин на крио-УС [162].
   При изготовлении крио-УС сухим способом они часто слипа­ются друг с другом в цепочки. Такое слипание обусловлено тем, что часть среза мгновенно расправляется и тут же замерзает, обра­зуя непрерывный слой. Возможно, что при мгновенном нагрева­нии вершины пирамидки или среза достигается критическая тем­пература, тут же снижающаяся без признаков очевидных механи­ческих дефектов. Это явление приводит к термическим дефектам, таким как денатурация, перераспределение водорастворимых компонентов и тд.
   В процессе резания образец подвергается сильному сжатию в направлении движения ножа, кроме того, иногда возникают тре­щины. При расправлении крио-УС на жидкости некоторые дефек­ты можно исправить [40, 117, 162].

6.2.3. Параметры резания

  
   Во время криоультратомии необходимо, во-первых, постоянно контролировать процесс резания и уметь вручную чистить нож от загрязнений, накапливающихся на режущей кромке ножа, и тем самым поддерживать непрерывность при изготовлении и сборе се­рийных срезов, во-вторых, иметь легкий доступ к объекту, ножу и срезу в ходе всего процесса, в-третьих, тщательно контролировать температуру криокамеры.
   При изготовлении крио-УС для каждого рода материалов су­ществует свой оптимальный температурный интервал. Этот интер­вал должен лежать в области достаточно низких температур. Многие считают, что оптимальная температура для получения крио-УС лежит в интервале от -70 до -80®С, а скорость резания составляет 2 мм/с. Увеличение скорости не влияет существенно на качество крио-УС [376]. В последнее время довольно часто исполь­зуется температура от -90 до -120®С. Чем ниже температура, тем более твердым становится блок. При температуре от -60 до -70®С из образцов, обработанных 23 М сахарозой; легко изготавливают­ся ПС. Если крио-УС сильно сжимаются, то это значит, что тем­пературу резания надо чуть уменьшить. Напротив, если крио-УС имеют вид маленьких ледяных стружек, то надо слегка повысить температуру.
   Крио-УС имеют обыкновение скручиваться и соскакивать с ножа из-за накопления электростатического заряда. Они очень хрупкие, с ними весьма сложно манипулировать. Для расправле­ния срезов используют охлажденный до t=-75®С полированный медный стержень. Чтобы предупредить скручивание, применяют ресницу, тонкую металлическую иглу и противоскручивающую пластинку. Последняя представляет собой кусочек покровного стекла, прикрепленного к верхней части ножа рядом с режущим краем. Для создания зазора, куда будет поступать крио-УС, между ножом и покровным стеклом прокладывают тонкую бумагу.
   Для этих же целей можно использовать другой треугольный нож, закрепленный над первым с образованием очень тонкой щели. При оптимальной температуре возможно получение ленты из 3-4 крио-УС. Однако чаще приходится иметь дело с единствен­ным крио-УС. После получения каждого крио-УС его надо убрать с лезвия ножа, чтобы на него не наслаивался следующий. При этом автоматическая подача обычно выключается [40, 117, 162].
   Объект, содержащий много кристаллов льда, режется плохо. При высокой концентрации сахарозы в образце качество крио-УС выше. Блоки, замороженные в 2.3 М сахарозе, обычно более мяг­кие, чем залитые в смолу [221].
  

6.3. ПРОЦЕДУРА ПОЛУЧЕНИЯ КРИО-УС

  
   Некоторые криоультратомы допускают регулирование темпе­ратуры ножа и образца независимо друг от друга. Однако начинать резание надо при одной и той же температуре ножа и объекта. Стеклянные ножи для крио-УС следует напылить тонким вольф­рамом, что улучшает криоультратомирование. Толщина слоя воль­фрама подбирается эмпирически. Хорошие результаты получают­ся также при использовании алмазных ножей. Для уменьшения термических изменений рекомендуется применять быстрый обратный ход штанги с объектом.
   При криоультратомии часто бывает довольно сложно подвести объект к ножу, поскольку в низкотемпературной камере трудно обеспечить достаточную подсветку. Поэтому вначале нож подводят с помощью грубой подачи, после чего включают медленное (1 мм/с) движение блока и нож приближается к образцу с по­мощью средней и тонкой подачи и лишь затем используют авто­матическую подачу. Оценить толщину крио-УС с помощью ин­терференционного цвета невозможно, поскольку УС не плавают на поверхности жидкости. Хорошие крио-УС прозрачны и похожи на целлофановые полоски. Если препараты фиксированы и обработа­ны криопротекторами, то крио-УС имеют слегка голубоватый или золотой цвет. Крио-УС, имеющие другой цвет, слишком толстые [350].
   Для резки надо поместить объект на медный блок, убрать из­быток жидкости, для лучшего прикрепления его можно приклеить заливочной средой. Затем опустить блок в жидкий азот, если ис­пользуется концентрированная (2.3 М) сахароза, или в охлажден­ную промежуточную жидкость. Замороженные блоки можно дли­тельное время хранить под жидким азотом.
   Рекомендуется установить подачу 50-100 нм и небольшую скорость резания. Затем подвести нож и начать резание. Крио УС собирают на поверхности ножа. С помощью ресницы можно предупредить обратное захватывание срезов и переме­стить их на лучшую позицию на ноже. Если ванночка ножа за­полнена жидкостью, то следует начинать резание с довольно высо­ких скоростей (10-60 мм/с). После завершения первичной стадии применяются обычные для ультратомии скорости резания. Угол стеклянного ножа изменяется в зависимости от свойств тканей, из которых изготавливают срезы.
   При влажной криоультратомии для заполнения ванночки можно пользоваться смесью воды с диметилсульфоксидом (ДМСО). Применение 40%-ного ДМСО для собирания крио-УС в ванночке ножа позволяет производить резку при температуре от -40 до -50®С. В качестве жидкости для собирания крио-УС ис­пользуют также 60%-ный раствор ПЭГ-100.
   Борьба со статическим электричеством может вестись разны­ми путями: 1) уменьшением площади контакта объекта с ножом; 2) повышением электропроводности ножа, например путем напы­ления слоя вольфрама (см. Приложение, 7.1); 3) ионизацией окру­жающего пространства, например с помощью антистатической пушки.
   Введение в криокамеру неохлажденных инструментов, так же как и теплого воздуха, вызывает повышение в ней температуры и соответственно запотевание поверхностей камеры и кристаллооб­разование в объекте и крио-УС [40, 117, 162].
  

6.3.1. "Сухой" способ сбора крио-УС

  
   Крио-УС собирают обычно на сеточки с подложкой, которые перед применением выдерживают в течение 1 мин при низкой температуре. Затем охлажденная сеточка помещается рядом с но­жом и крио-УС с помощью тонкой металлической иглы или ресницы переносят на сеточку. Крио-УС прижимают к подложке с помощью охлажденной медной палочки с полированным концом (рис. 24). К современным криоультратомам придаются готовые прессы для сеточек. Сеточку часто просто прижимают к расправленным срезам, находящимся на ноже, либо к кромке ножа при­крепляют сеточку, на которую поступают срезы. Предложен специальный вакуум-провод, поддерживающий горизонтальную поло­ску срезов с помощью электростатического поля. В ряде случаев применяют "раздавливание" крио-УС между двумя стеками с под­ложками [40, 117, 162] (см. Приложение, 7.2).

0x01 graphic

   Рис. 24. Этапы изготовления и переноса крио-УС с лезвия ножа на сеточку "сухим способом".
   А - помещение объекта на держатель; Б - замораживание объекта; В - изготовление крио-УС (1); Г - взятие крио-УС с лезвия ножа (2) с помощью ресницы (3); Д - перенос крио-УС на поверхность охлажденной сеточки (4); Е - придавливание крио-УС к сеточке с помощью охлажденного полированного металлического стержня (5) и холодного основания (б).

6.3.2. "Влажный" способ сбора крио-УС

  
   Каплю 2.3 М сахарозы подцепляют на проволочную петлю ди­аметром 15-2 мм, быстро вводят в криокамеру и касаются срезов, которые прилипают к капле снизу, до того как она замерзнет (нельзя допускать замерзания капли в криокамере и контактиро­вания ее с ножом, поскольку она мгновенно примерзнет к нему). Затем петлю выносят из криокамеры и дают возможность срезам расправиться на тающей капле сахарозы. Для расправления очень хрупких срезов можно использовать 2 М раствор сахарозы, содержащий 0.75 % желатины. Иногда добавляют к сахарозе 1-2 % ФА. Капля такой смеси остается в криокамере в жидком состоянии не­сколько дольше, чем капля 2.3 М сахарозы. Для увеличения вре­мени, в течение которого капля сахарозы остается жидкой, петлю нагревают. Можно для этих целей применять петлю с большим диаметром - до 3 мм. Затем каплей с плавающими в нижней ее части крио-УС касаются сеточки. Крио-УС прилипают к подлож­ке, а сахароза растекается по всей ее поверхности. Сеточку переворачивают и помещают на слой застывшего 2%-ного раствора желатины (или агарозы). Желати­ну нагревают (t=37®С) до жидкого состояния и разводят с помощью ФБФР (1 : 1). После этого под сеточку подводят про­волочную петлю диаметром 3 мм, с помощью которой сеточку переносят на каплю ФБФР для удаления желатины. Затем крио-УС заключают в метил-целлюлозу, избыток которой удаляют фильтровальной бума­гой (рис. 25). Никелевые или медные сеточки должны быть предварительно покрыты формваровой подложкой, стабилизи­рованной углеродом. Лучше пользоваться сеточками с более мелкими ячейками. Крио-УС очень чувствительны к атмос­ферным влияниям и перед ана­лизом в ТЭМ нуждаются в ста­билизации, например парами 40 или путем напыления слоя углерода [40, 117, 162, 350].

0x01 graphic

   Рис. 25. Этапы (А-Д) переноса крио-УС с лезвия ножа на сеточку "влажным способом". 1 - крио-УС; 2 - лезвие ножа; 3 - се­точка; 4 - капля концентрированного раствора сахарозы; 5 - проволочная петля; 6 - капля буферного раствора.
  
  

6.4. ИЗГОТОВЛЕНИЕ КРИО-ПС

   В ряде случаев требуется выбрать для криоультратомии нужный участок образца. Для этого с помощью ручной подачи готовят не­сколько ПС толщиной 500 нм. Их собирают с помощью капли рас­твора сахарозы и помещают на предметное стекло. ПС промывают водой и в течение 1 мин окрашивают толуидиновым синим. Если при исследовании под СМ окажется, что избран нужный участок, то готовят следующий срез толщиной 200 нм - крио-УС. Его промы­вают водой, окрашивают 1%-ным молибдатом аммония (рН 6.8) и просматривают в ТЭМ. Только после этого начинают изготавливать серийные крио-УС. Если необходимо получить УС и ПС с одного образца, то лучше сначала изготовить УС, затем поднять температу­ру и сделать ПС, чтобы кристаллизация не испортила крио-УС.
   Для повышения проницаемости нефиксированных ПС их об­рабатывают с помощью глицерина или слабого детергента, такого как Тритон Х-100, и помещают в раствор сахарозы. Стекла для ПС надо обработать 0.01%-ным полилизином в течение 1 ч, а за­тем высушить. Петлю вынимают из криокамеры и через несколь­ко секунд после оттаивания капли сахарозы со срезами ею надо коснуться стекла с полилизиновым покрытием - ПС прилипают к стеклу [40, 117, 162].
   Глава 7 СЕТОЧКИ И ПОДЛОЖКИ
  
   УС, а также суспензии бактерий, фагов, вирусов, изолирован­ных клеточных фракций, другие аналогичные объекты для их про­смотра в ТЭМ наносят на специальные сеточки или бленды, по­крытые в ряде случаев очень тонкими пленками (подложками). Бленды применяются при необходимости просмотра больших по­лей зрения.
  

7.1. ОПОРНЫЕ СЕТОЧКИ

  
   Стандартный диаметр поддерживающей сеточки (и бленды) для ЭМ составляет 3.05 мм. Кроме наиболее широко используе­мых медных сеточек применяют золотые, платиновые, родиевые, палладиевые и палладированные, никелевые, молибденовые, из нержавеющей стали.
   Если УС при проведении цитохимических процедур подверга­ются окислению, то обычные медные сеточки заменяют сеточка­ми "из инертных металлов. Так, для иммуно-ЭМ используют обычно никелевые или золотые сеточки. В случае применения ана­литических методов исследования применяют нейлоновые сеточки.
   Сеточки изготавливают электролитическими методами. Их поверхность обычно ровная. Некоторые фирмы производят сеточ­ки, у которых одна поверхность блестящая, а другая матовая. По­следняя используется для прикрепления подложек и УС.
   Номера, или размеры, сеточек (количество полос на один дюйм) варьируют от 50 до 1000. Более крупные ячейки дают воз­можность просматривать большие участки УС, более мелкие обес­печивают их лучшую стабильность и сохранность.
   Взятие и перенос сеточек осуществляют с помощью специаль­ных ювелирных пинцетов. Для удобства работы один из краешков сеточки рекомендуется немного отогнуть. Выпускают специальные сеточки с держателями, которые перед введением сеточек в ТЭМ отрезают. При перенесении сеточек из капли в каплю (или из од­ной посуды в другую) брать их следует очень осторожно. При ма­нипуляциях с сеточками в растворах очень важно с помощью фильтровальной бумаги удалять жидкость, остающуюся между браншами пинцета. Для этой цели рекомендуется использовать специальные противокапиллярные пинцеты, у которых одна из бранш у самого конца изогнута почти под прямым углом у самого конца [11, 26, 70, 72, 105].
  

7.1.1. Очистка сеточек

   Опорные сеточки перед нанесением подложек или УС следует прокатать с помощью полированного ролика или гладкой стеклян­ной палочки. Это не касается сеточек, специально выпускаемых для ЭМ. Чистят сеточки с помощью ультразвука или промывают в ацетоне и этаноле. Если используют детергент, то он не должен содержать фосфатов, которые могут впоследствии давать осадки на препаратах. Сильно загрязненные сеточки перед употреблением 1-3 мин моют в растворах концентрированной соляной кислоты или хромпика. Можно обрабатывать их кипячением в концентрированном растворе аммиака или просто встряхивать в растворе де­тергента.
   После такой обработки сеточки тщательно споласкивают в во­де, а затем в этаноле или ацетоне. Вслед за этим сеточки помеща­ют на фильтровальную бумагу в термостат в защищенное от пыли место при t=60®С до высыхания. Хранят сеточки сухими в закрытом стеклянном бюксе либо в этаноле или ацетоне.
   Пластиковая посуда для хранения сеточек непригодна, по­скольку из-за электростатических взаимодействий сеточки могут "выпрыгивать" из нее [11, 70].
  

7.1.2. Повторное использование сеточек

  
   Если сеточки применяют повторно, то надо удалить с них ста­рую подложку и УС. Это можно сделать механическим способом - с помощью ультразвука, а затем выдержать их по 1-2 ч в двух пор­циях растворителя (амилацетат, ацетон, хлороформ, дихлорэтан - в зависимости от того, на каком растворителе были приготовлены подложки). Если сеточки не очень загрязнены, то они могут быть погружены на 1-2 мин в концентрированную соляную кислоту, после чего их последовательно промывают в воде, этаноле, ацетоне и хранят в дихлорэтане. Очистить сеточки можно и кипячением в концентрированном растворе аммиака (с последующим тща­тельным промыванием в воде) или путем нагревания в вакууме [78].
   После очистки каждую сеточку желательно просмотреть под большим увеличением в СМ. Деформированные сеточки надо раз­ложить на фильтровальную бумагу и прокатать с помощью стек­лянной палочки или валика.
  

7.2. ПРИМЕНЕНИЕ СЕТОЧЕК БЕЗ ПОДЛОЖКИ

  
   Сеточки могут использоваться без подложки, если УС доста­точно устойчивы к электронному пучку. При обычной работе с ма­териалом, залитым в эпоксидную смолу, употребление подложки не является обязательным, если сеточки достаточно мелкоячеистые. В этом случае применяют сеточки больших номеров (200 и более). Однако переплеты сеточек могут закрывать до 30 % площа­ди УС. Обращаться с сеточками без подложек следует весьма осто­рожно, так как УС могут слететь с сеточки во время различных процедур. Для улучшения прикрепления УС и подложек к сеточ­кам последние рекомендуется обрабатывать 0.2%-ным раствором неопрена в толуоле. Очень тонкие УС, а также срезы из акриловых смол нестабильны под электронным пучком и повреждаются, если нет поддерживающей пленки [11, 26, 72, 105].
  

7.3. ПЛЕНКИ-ПОДЛОЖКИ

  
   Для стабилизации УС применяют пленки-подложки. Они так­же необходимы при исследовании изолированных клеток, бакте­рий, вирусов и различных других объектов сверхмалого размера. Обычно используются пластиковые или углеродные подложки толщиной 20-40 нм. Подложка должна быть тонкой, прочной, прозрачной для электронов. Пластмассовые подложки подвержены термическому дрейфу и не могут использоваться на предельных разрешениях ЭМ [139].
   Подложки приготавливают из нитроцеллюлозы, этиленцеллголозы, поливинилформальдегида, поливинилбутираля, углерода, бериллия, окиси алюминия, кварца, окиси кварца и др. Наиболее часто подложки готовят из коллодия (нитроцеллюлозы), формвара, пиелоформа и углерода. Свойства различных подложек приве­дены в табл. 3. В случае применения негативного контрастирова­ния используют коллодиевые пленки, так как они в отличие от формваровых и углеродных лучше смачиваются. Толщина пласт­массовых подложек зависит от концентрации исходного раствора пластмассы. Меняя его концентрацию можно добиться получения очень тонких пленок, как например при использовании 0.5%-ного раствора пиелоформа в дихлорэтане [11, 70, 105].

Таблица 3. Свойства подложек.

Тип подложки

Прозрачность

Прочность

Устойчивость

к электронам

химическая

Коллодиевая

Большая

Низкая

Низкая

Низкая

Формваровая

"

"

"

"

Углеродная

Средняя

Высокая

Очень высокая

Очень высокая

Кварцевая

Малая

Средняя

Средняя

Высокая

  

7.3.1. Методы изготовления подложек 7.3.1.1. Коллодиевые подложки

  
   Для изготовления подложек используют 0.5-2%-ные растворы чистого коллодия (нитроцеллюлоза, целлоидин) в амилацетате, чаще всего 1.5%-ном. Растворы относительно быстро стареют. Хранить их надо в темноте, так как на свету образуются нерастворимые про­дукты и пленка получается непрочной. Процесс приготовления подложек включает следующие процедуры. Вначале чистый кристалли­затор наполняют водой, берут небольшое количество раствора колло­дия (целлоидина) пастеровской пипеткой и с высоты 1 см наносят одну каплю раствора на поверхность воды. После испарения рас­творителя образуется тонкая коллодиевая пленка. Образовавшуюся пленку лучше снять, чтобы вместе с ней удалить пыль с поверхно­сти воды, снова капнуть раствор коллодия и подождать 1-2 мин. Обычно используют пленку из второй или третьей капли. С по­мощью флюоресцирующего источника света, расположенного над пленкой, надо ее исследовать на предмет целостности. Она должна иметь равномерный серебряный цвет. Лучше наносить кайлю на " поверхность выпуклого мениска воды, налитой до краев в чашку ди­аметром 20 см. Для получения более прочной и однородной пленки можно пользоваться водой, насыщенной парами амилацетата, для чего за 24 ч до изготовления пленок в воду добавляют несколько капель амилацетата. Раствор энергично встряхивают и отстаивают.
   Для прикрепления подложки к сеточкам можно использовать сосуд типа делительной воронки, в дне которого имеется выпуск­ной кран. В нижнюю часть сосуда помещают стекло или подставку с сеточками. Воду осторожно выпускают, и пленка покрывает сеточки. Затем сеточки с подложками надо высушить. Полученные таким путем подложки обычно требуют укрепления. Для этого на них наносят тонкий слой углерода. Если после напыления органи­ческую пленку растворить, то на сеточке останется только углерод­ная пленка. Перед помещением УС желательно просмотреть сеточ­ки с подложками в ЭМ. Если пленка в микроскопе разрушается, то надо изменить концентрацию коллодия [11, 26, 70, 72].
  

7.3.1.2. Формваровые подложки

  
   Пленки из бутвара (лоливинилбутилата) и формвара (поливинилформаля) прочнее, чем коллодиевые. Поэтому они нашли ши­рокое применение в ЭМ. Концентрация используемых растворов формвара колеблется от 0.1 до OS %. Коммерческие растворы обычно содержат 0.5 % формвара. Раствор формвара хранится в темной герметически закрытой посуде до 10 сут. При частом употреблении его концентрация быстро увеличивается вследствие испарения растворителя. Перед употреблением раствор формвара желательно профильтровать через стеклянный фильтр.
   Необходимо подготовить хорошо очищенное стекло. Для этого вначале отшлифованное стекло тщательно промывают мыльным раствором, затем ватными тампонами, смоченными водой, ацето­ном и снова водой, после чего протирают сухим ватнмм тампо­ном. Для удаления пылинок с поверхности стекла его можно про­дуть струей сухого воздуха. Иногда достаточно просто вымыть стекло водой и вытереть. Не все стекла подходят для этой цели. Следует выбрать наиболее подходящее.
   Сухое стекло опекают в раствор формвара, находящийся в высоком стеклянном цилиндре, и быстро извлекают. Более однород­ные и тонкие (200 нм) пленки можно получить при выдержива­ний (10 мин) их во время высушивания в парах растворителя. Поэтому рекомендуется поднять стекло и подержать около самой поверхности раствора в течение 30 с, а затем убрать лишний рас­твор, коснувшись стеклом фильтровальной бумаги. Это должно производиться в сухом помещении. После высушивания следует обрезать пленку лезвием бритвы (или иголкой) на расстоянии 3-4 мм от края и медленно опустить стекло под углом (приблизи­тельно 30) в ванночку с водой. Пленка при этом отделяется от стекла и остается на поверхности.
   Если пленка образовалась на обеих сторонах стекла, то она подрезается по всему периметру с обеих сторон, затем стекло вер­тикально опускают в воду. Делать это следует медленно и плавно. Пленка с двух сторон отслаивается от стекла. Тонкие пленки, плавающие на поверхности воды, видны только в отраженном свете и кажутся равномерно серебристо-серыми. Пленка, имеющая золо­тистый оттенок, слишком толста, а пленка с радужными цветны­ми полосами имеет неравномерную толщину. Если в пленке вид­ны отверстия, то это значит, что в исходный раствор попала вода - следует заменить раствор и приготовить новую пленку. Обычно в качестве подложки используют только верхний участок формваровой пленки (1/3 поверхности). Для снятия ее со стекла лучше применять кристаллизаторы или ванночки, обклеенные черной бумагой. Это делает плавающую на поверхности воды формваровую пленку более заметной.
   Главный недостаток описанного метода - плохое отделение пленки от поверхности стекла. Иногда стекло обрабатывают перед нанесением пленки детергентом. Можно нанести на стекла слой увлажняющего вещества - Виктавета (Victawet).
   На пленку удовлетворительного качества, плавающую в воде, осторожно помещают высушенные чистые сеточки и бленды. Затем пленку с прикрепленными к ней сеточками накрывают полоской фильтровальной бумаги (не допускать образования пузырей воздуха между бумагой и пленкой!). Как только бумага намокнет, нужно подхватить ее край пинцетом и плавным скользящим движением поднять вместе с прилипшей в ней плен­кой. Бумагу с сеточками следует разместить на дне чашки Петри и высушить. Вместо бумаги можно пленку с сеточками накрыть чистым стеклом и погрузить в воду, а затем, повернув стекло сеточкой вверх, вынуть из жидкости и высушить [26, 70, 72, 367].
   Обычно формваровую подложку помещают на матовую повер­хность сеточки (для лучшей адгезии). Если ее поместить на глад­кую сторону, то пленка будет меньше коробиться. Однако в этом случае манипулировать с сеточкой будет сложнее, так как УС не будут видны в отраженном свете. Для того чтобы формваровая пленка прилипла плотнее, все сеточки и бленды перед нанесением на них подложки рекомендуется погрузить в исходный раствор формвара, разбавленный растворителем в отношений 1:1. Затем их немедленно высушивают на фильтровальной бумаге. Перепле­ты сеточек при этом обволакиваются тонкой формваровой плен­кой, что улучшает их адгезивные свойства. Иногда подложки по­мещают на опорные сеточки, предварительно покрытые раствором клеящего вещества от скотча - готовят 1%-ный раствор и погружа­ют туда сеточки с последующим высушиванием. Для уменьшения теплового дрейфа УС, нанесенные на сеточки с пленками, покры­вают тонким слоем углерода [11, 26, 105].
  

7.3.1.3. Дырчатые подложки

  
   Для ЭМ высокого разрешения могут использоваться "микросе­точки", т. е. подложки с отверстиями от 0.1 до 15 мкм в диаметре. Подобные сеточки могут быть получены при выборе соответству­ющих растворителя и режима высушивания. Например, 3%-ный раствор коллодия наносят на поверхность охлажденной льдом во­ды. При легком дыхании на еще не сформировавшуюся пленку на ее поверхности конденсируются капли влаги, образующие вмяти­ны. Пленку затем наносят на сеточки. Тончайшие перетяжки уда­ляют в пламени горелки. Более однородные ячейки образуются, если через 5-7 с после нанесения раствора чашку с еще не вполне сформировавшейся пленкой накрыть стеклянным колпаком, разо­гретым над сосудом с кипящей водой. Когда пленка становится мутной, колпак удаляют для окончательного испарения амилаце­тата (1-2 мин). Пленка с красно-зеленым отливом имеет ячейки 4-7 мкм, синеватая - порядка 25-40 мкм.
   Можно изготовить дырчатую подложку и из формвара. Для этого, после того как стекло вынуто из раствора, на него надо подышать. Более воспроизводимые результаты получаются, если добавить в раствор формвара глицерин. Для образования пор диа­метров 25, 15, 7 или 5 мкм надо 1 мл глицерина добавить к 8, 16, 32 или 120 мл раствора формвара соответственно. Затем надо опу­стить покрытое виктаветом стекло в смесь формвара и глицерина, которую перед использованием следует интенсивно перемешать. После этого стекло вынуть и после 10-15-минутного высушива­ния при комнатной температуре подышать на него или подержать над кипящей водой. Полученную таким способом пленку покры­вают обычно тонким слоем углерода [11, 26, 70].
  

7.3.1.4. Углеродные подложки

  
   Углеродные пленки получают распылением угля в вакуумном посте (см. гл. 16). Отделить углеродную пленку от чистого стеклу очень трудно. Для облегчения снятия пленки предметное стекло предварительно опускают в глицерин, высушивают в вакууме, а затем напыляют углеродом. Надрезанная по краям пленка легко сходит с такого стекла на поверхность воды. Можно напылить уг­лерод на стекло, обработанное виктаветом или покрытое пленкой поливинилового спирта. Поливиниловый спирт при этом быстро растворяется в горячей воде.
   Очень хорошие углеродные пленки получаются при напыле­нии углерода на свежерасщепленную слюду. От слюды пленка от­деляется на поверхности чистой воды, к которой можно добавлять 10 % ацетона - он способствует более плавному снятию пленки и препятствует ее разрыву. Следует учитывать, что углеродные плен­ки хрупки и в обращении с ними надо соблюдать осторожность. Углеродная пленка не очень хорошо прикрепляется к сеточкам. Это следует учитывать при дальнейших манипуляциях со срезами (отмывание, контрастирование). Для лучшей адгезии углеродных подложек к сеточкам можно использовать те же приемы, которые были описаны для коллодиевых пленок [26, 72, 105].
   Разработан метод получения углеродных пленок с помощью плазменного разложения паров нафталина в вакууме [373]. Пол­учаемая подложка имеет небольшую толщину, аморфную тексту­ру, высокую прозрачность для электронов и более гидрофильна, чем обычная угольная подложка. Описаны также способы получе­ния угольных пленок толщиной 1 нм [311].
  

7.3.2. Повышение адгезивности поверхности подложек

  
   Углеродную подложку желательно сделать более гидрофиль­ной. Адгезивность пленки повышается после ее нагревания, 2-3-часового облучения УФО, обработки 0.1%-ным раствором поли-L-лизина (рН 9.5) либо быстрого промывания 20%-ной уксусной кислотой или 90%-ным этанолом. Для этой же цели можно обработать сеточки с подложками в течение 20 с в установ­ке для катодного распыления при напряжении 250 В и давлении 200 мкм рт.ст. в присутствии паров пентиламина. Добавление сле­дов детергента в жидкость в ванночке также улучшает смачивае­мость подложек [11, 26, 105, 139].
   Глава 8 КОНТРАСТИРОВАНИЕ
  
   Биологические структуры в большинстве своем электроннооптически прозрачны. Контрастность изображения в ТЭМ можно повысить путем снижения ускоряющего напряжения, уменьшения апертурной диафрагмы, увеличения фокусного расстояния объек­тивной линзы. Наиболее эффективным подходом является хими­ческое контрастирование - искусственное увеличение электронной плотности ультраструктур. За счет осаждения электронно-плотных веществ контрастирование может быть позитивным - усиление электронной плотности исследуемых структур по сравнению с фоном, окружающим объект, и негативным - увеличение электрон­ной плотности фона. В первом случае электронно-плотные веще­ства осаждаются на клеточных структурах, во втором они вводятся в среду, окружающую исследуемые структуры.
  

8.1. ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПОЗИТИВНОГО КОНТРАСТИРОВАНИЯ

   ЧО, испольауемая для фиксации образцов, одновременно вы­полняет функцию красителя, поскольку содержит атом электрон­но-плотного элемента Os. Для неспецифического контрастирова­ния наиболее часто применяются уранилацетат и цитрат свинца.
  

8.1.1. Уранилацетат (УА)

  
   УА реагирует главным образом с фосфатными, карбоксильны­ми и аминогруппами и имеет особенно сильное сродство к нукле­иновым кислотам. Последние, а также ряд белков интенсивно им окрашиваются [179]. УА хорошо проникает в ткань и может использоваться как в водных, так и в спиртовых растворах. Спирто­вые растворы проникают в ткань быстрее и обеспечивают более высокую контрастность. Применяются 1-5%-ные водные раство­ры, 2%-ный или насыщенный раствор в 50, 70 или 100%-ном этаноле или метаноле. УА лучше растворяется в метаноле. Поэтому при использовании метаноловых растворов УА достигается наи­высшая контрастность объектов (насыщенный раствор УА в абсо­лютном метаноле).
   Водные растворы УА (чаще 2%-ные) хранятся не более одной недели в темных склянках с притертой крышкой. Приготовление УА на буферных растворах (например, Na-ацетатный буфер, рН 5.2) уменьшает скорость его преципитации. Аналогичный резуль­тат Получается, если применять бидистиллированную воду. Перед использованием раствор УА должен центрифугироваться или фильтроваться через миллипоровый фильтр. Фосфатные буферы нельзя использовать в смеси с солями урана.
   Работа со спиртовыми растворами УА также сопряжена с ря­дом трудностей. Из-за большой летучести спиртов при длитель­ном контрастировании на срезах часто выпадает осадок. Кроме то­го, спиртовые растворы УА довольно агрессивны: они разрушают некоторые пленки-подложки. Это особенно опасно при монтирова­нии срезов на бленды. Спиртовые растворы УА также чувствитель­ны к свету - в них с течением времени выпадает осадок. Для их стабилизации к 10 мл раствора добавляют 0.15 мл ледяной уксусной кислоты [11, 72, 105, 179, 367].
  

8.1.2. Ионы свинца

  
   Чаще всего для контрастирования биологических образцов используется цитрат свинца (ЦС), реже - гидроокись свинца, аце­тат, тартрат и другие соли. Применяется окрашивание образцов в блоке аспартатом свинца [235]. ЦС связывается с отрицательно заряженными компонентами, такими как гидроксильные группы и реагирующие с осмием области. В этот процесс вовлечены и фосфатные группы [341] (см. Приложение, 8.5.2).
  

8.1.3. Другие соли

  
   Фосфорно-вольфрамовая кислота (ФВК) в зависимости от рН (больше или меньше 3) окрашивает полисахариды и гликопротеины (т.е. имитирует ШИК-реакцию), а также нуклеопротеиды и белки, особенно коллаген. ФВК и фосфорно-молибденовую кисло­ту (ФМК) лучше применять в виде 1%-ных растворов в 100%-ном этаноле в процессе обезвоживания образцов (1-3 ч).
   Увеличение контрастности ядер при обработке ткани перед ее обезвоживанием раствором аммиачного серебра обусловлено окра­шиванием гистонов. Хлорид гафния хорошо контрастирует мик­ротрубочки, особенно в комбинации с УА и при использовании в качестве растворителя ацетона [11, 72, 105, 179, 367].
   Таниновая кислота (ТК) при контрастировании связывается с карбогидратными группами. Чаще она используется в сочетании с солями тяжелых металлов. При рН 7.0-9.0 ТК окрашивает эласти­ческие волокна и лишь слегка - коллаген и ядра, при рН выше 9.0 обычно выпадает в осадок. ТК увеличивает также контрастность продуктов реакции на пероксидазу и защищает актин от разруша­ющего действия 40. Вместе с метиламином вольфрамата ТК ис­пользуется для контрастирования мембран клеток в процессе про­водки материала, при фиксации которого не использовалась 40, с последующим контрастированием УС с помощью УА и ЦС [235]. Если ТК использовать в качестве добавки к ГА, то контрастируются большинство белков (особенно в клеточных мембранах) и ком­поненты цитоскелета [83].
  

8.2. СПОСОБЫ КОНТРАСТИРОВАНИЯ

  
   Контрастирование может быть осуществлено как до, так и по­сле заливки.
  

8.2.1. Контрастирование в блоках

  
   Окраску ткани в блоках с помощью УА можно проводить сразу после осмирования или во время обезвоживания. В первом случае используют 0.25-2%-ный (реже 5%-ный) раствор УА в воде либо в вероналацетатном, малеатном или Na-ацетатном буфере (рН 5). Конечный рН может варьировать от 4.2 до 5.2 в зависимости от концентрации УА. Применение раствора УА с рН 5.0-5.2 ведет к лучшей сохранности ДНК, клеточных контактов, митохондрий, миофибрилл, нуклеопротеидов и фосфолипидов. Вместо УА можно применять магнийуранилацетат (см. Приложение, 8.2 и 8.3).
   При окраске УА нельзя использовать какодилатный и фосфат­ный буферы. Если эти буферы использовали ранее для приготов­ления фиксаторов, то кусочки тканей следует тщательно отмыть перед погружением их в раствор УА. После обработки УА отмыва­ние объектов производят в 20%-ном этаноле, который меняют не­сколько раз. Образцы ткани можно инкубировать в растворе УА (0.5-2.0%-ном) на этаноле (обычно 70%-ном) во время обезвожи­вания. Для окрашивания образцов в блоках этим раствором наи­более удобно пользоваться 05%-ным раствором УА на смеси абсо­лютных этанола и ацетона, поскольку он может храниться как угодно долго. Можно окрашивать объект (по 15-20 мин) в 0.5-2.0%-ных растворах УА в этаноле при восходящей его концентра­ции с отмыванием в последней смене чистого абсолютного этано­ла. Можно во время обезвоживания использовать 2%-ный рас­твор УА на 30%-ном метаноле или 1%-ный раствор ФВК в 70-100%-ном ацетоне (в последнем случае уже без других контрастеров) [70, 72]. После контрастирования блоков с помощью УА обезвоживание должно быть ускорено, так как УА медленно, но все же удаляется с помощью дегидратантов.
   Основным недостатком контрастирования в блоках является плохое проникновения красителя в ткани. Однако контрастирова­ние в блоке обеспечивает лучшую сохранность мембранных струк­тур. После контрастирования блоков полученные УС можно докра­сить при помощи УА и ЦС.
   Контрастирование в УА можно осуществить после заключения в смолу, но до изготовления УС (см. Приложение, 8.4). Глубина проникновения УА зависит от типа пластика и обычно составляет 10-15 мкм. Этот метод наиболее полезен для высоковольтной ЭМ толстых срезов. Особенно хорошие результаты при таком способе дает использование 5%-ного раствора УА на метаноле. Вместо УА можно применять ФВК [70, 72, 105].
  

8.2.2. Контрастирование УС

  
   Более удобным и эффективным способом контрастирования является окрашивание УС, которые могут быть подвергнуты воз­действию контрастера с одной или с обеих сторон. Считается, что если сеточку с УС не погружать в каплю красителя, а положить на нее срезами вниз, то окрашиваться будет только одна сторона УС. При контрастировании УС перед красителем нет барьеров, созда­ваемых плазматическими мембранами, и он может непосредст­венно воздействовать на открытые внутренние отделы клеток. Единственное препятствие на пути красителя - это сам заливоч­ный материал. Как полагают, заливочная среда не окрашивается - контрастируются только срезанные поверхности ткани, если ее ре­активные группы не были блокированы в ходе предшествующей обработки. Окраска УС с помощью УА увеличивает контрастность рибосом, областей расположения гетерохроматина в ядре и митохондриального матрикса.
   Углерод, напыленный на УС препятствует проникновению контрастера. Эпоновые УС окрашиваются быстрее, чем аралдитовые (см. Приложение, 85).
   Оптимальная продолжительность контрастирования определя­ется несколькими факторами: заливочной средой, типом контр­аста, концентрацией и рН контрастера. Обычно для ЦС время контрастирования составляет 2-5 мин, для водного раствора УА 2-3 мин [11, 72, 105, 179, 367].
  

8.2.2.1. Процедура контрастирования

  
   В большинстве случаев используется 2%-ный водный раствор УА. На дно чашки Петри укладывают лист фильтровальной бума­ги, смоченный водой, на него помещают пластинку зубного воска (или парафильма), поверх которого наносят капли водного раство­ра УА; чаще сеточка с УС плавает на капле. Чашку Петри закрыва­ют. Влажная атмосфера в чашке позволяет предупредить высыха­ние контрастера, что дает возможность обрабатывать срезы от 15 мин до 18 ч в темноте при комнатной температуре. Путем повышения температуры до 40-60®С. можно ускорить процесс окраши­вания, однако надо следить за тем, чтобы не расплавился воск. Краситель перед применением надо центрифугировать (5000 g, 20 мин) или фильтровать через миллипоровые фильтры. Мутный раствор использовать нельзя. Сеточки захватывают пинцетом и промывают путем многократного (до 25 раз) погружения в бидистиллированную воду; необходимо действовать аккуратно, чтобы не порвать срезы или подложку.
   Для отмывания можно либо поместить сеточку срезами вниз на крупную каплю дистиллированной воды, либо на сеточку, кото­рая удерживается пинцетом, капать воду из пластикового контей­нера.
   После контрастирования с помощью УА сеточку или сразу же контрастируют с помощью ЦС, или же высушивают и некоторое время перед контрастированием хранят в контейнере.
   При переносе сеточек необходимо оттягивать воду между браншами пинцета, иначе сеточка оказывается в капле на одной из бранш или же происходит загрязнение следующего раствора. Бранши пинцета надо держать чистыми и без заусениц. Протирать бранши удобно с помощью фильтровальной бумаги, а удалять за­усеницы пилочкой для ногтей. При использовании никелевых се­точек пинцет и сеточку надо размагничивать в специальном уст­ройстве.
   Можно контрастировать сеточки и погружением их в краси­тель. Для этого надо осторожно вдавить сеточки в пластинку раз­мягченного с помощью тепла воска, поместить на них каплю воды, а затем контрастера. Преимущество данного метода в том, что при использовании сеточек без подложек срезы окрашиваются с двух сторон.
   Некоторые смолы с множеством поперечных связей не позво­ляют водным растворам УА контрастировать ультраструктуру (смола Сперра, например). В этом случае рекомендуется исполь­зовать спиртовые растворы УА (чаще на этаноле или метаноле). Резервуары и контейнеры с этанолом и метанолом должны быть более герметичными. Чаще всего применяют 2-4%-ные или насы­щенные растворы УА в 50%-ном этаноле. Насыщенный раствор готовится как минимум за день до окрашивания, поскольку УА растворяется очень медленно. Перед использованием его надо от-центрифугировать (5000 g, 15-20 мин). Время контрастирования 15-30 мин при комнатной температуре для большинства эпоксид­ных смол.
   В случае применения смолы Сперра необходимо увеличить время контрастирования до 1-2 ч, а температуру - до 40-60®С. При увеличении времени контрастирования и температуры сеточ­ки лучше помещать не на поверхность капли, а внутрь нее. После окрашивания сеточки с помощью пинцета очень быстро (!) пере­носят в несколько смен 50%-ного этанола, затем промывают и кладут на фильтровальную бумагу, а после высыхания контрасти­руют с помощью ЦС. Можно сразу после обработки спиртовым раствором УА перенести сеточку вначале в 25%-ный этанол, затем в бидистиллированную воду и в раствор ЦС.
   Для растворения УА лучше использовать абсолютный метанол, в котором может быть получен 25%-ный раствор УА. В этом слу­чае нельзя применять коллодиевые подложки, которые растворя­ются в метаноле. Метакрилаты также немного растворимы в метаноле. Сеточки погружают в раствор и окрашивают в течение 10-15 мин, после чего с помощью пинцета извлекают и промыва­ют 10-25 раз в 3-4 сменах абсолютного метанола. Переносить се­точки надо очень быстро. Для контрастирования в УС можно так­же применять 2%-ный УА в абсолютном метаноле с добавлением 1 % диметилсульфоксида для улучшения проникновения краси­теля.
   Переконтрастирование УА проявляется в виде характерного пылевидного осадка в цитоплазматическом матриксе клеток. Та­кой же осадок может наблюдаться на подложке, вне срезов. Иногда возникают картины ложного негативного контраста. Для устране­ния преципитации рекомендуется, во-первых, фильтровать рас­твор УА перед употреблением, во-вторых, использовать быстрое отмывание сеточек в спирте а затем в воде [11, 179] (см. Прило­жение, 8.5.3).
  

8.2.2.2. Контрастирование с помощью ЦС

  
   Перед началом контрастирования в маленькую чашку Петри следует налить расплавленный воск. Можно для этих целей ис­пользовать пластинку тефлона или пленку парафильма. Когда воск застынет, чашку с воском надо поставить в чашку Петри большего диаметра, на дно которой необходимо положить гранулированный едкий калий (натрий) или фильтровальную бумагу, пропитанную раствором NaOH, который будет связывать двуокись углерода. На поверхность воска накапывается раствор ЦС. Капли лучше нано­сить с помощью глазной пипетки правой рукой, а левой придер­живать крышку чашки Петри так, чтобы защитить краситель от дыхания. В капли положить сеточки со срезами, закрыть крышку. Время контрастирования - от 5 до 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные срезы промыть и высушить.
   Воск на чашках Петри и пипетки, которыми пользуются во время окрашивания, каждый раз тщательно отмывают. После свинца их моют щелочью и водой, а после УА - этанолом и водой. Полностью отмыть воск не всегда удается, и тогда при повторном использовании срезы загрязняются. Чтобы избежать этого, можно исключить процедуру промывания воска. В чистую чашку Петри в-таком случае каждый раз кладут предметные стекла, на которые нанесен слой парафина (воска). Использованный парафин не мо­ют, а удаляют и наносят новый.
   Раствор ЦС при правильном приготовлении и хранении может использоваться в течение 6 мес. (см. Приложение, 852). Даже ес­ли появилась небольшая мутность, краситель станет пригодным к применению после центрифугирования (5000 g, 10 мин) или фильтрования через миллипоровый фильтр. Можно разлить кра­ситель по 1 мл в пластиковые закрывающиеся трубочки и отцентрифугировать. Если осуществляется миллифильтрация, то жела­тельно вначале пропустить через фильтр несколько миллилитров 0.01 М NaOH для удаления смачивающих веществ, применяемых при изготовлении фильтра.
   Раствор ЦС сохраняется более 5 месяцев, если сразу после приготовления его отфильтровать через миллипоровый фильтр, подсоединенный к одноразовому шприцу, в закрытый резиновой пробкой (прокалывается иглой) пузырек, из которого потом вытесняется воздух с помощью баллончика с инертным газом (фре­оном). Краситель извлекается из пузырька с помощью шприца и иглы, которой прокалывается резиновая пробка. Вначале сеточки с УС рекомендуется поместить так, чтобы они плавали на поверх­ности большой капли свободной от углекислоты воды срезами вниз (см. Приложение, 8.1). Затем сеточки поднимают так, чтобы со стороны срезов осталась только небольшая капелька воды, и по­мещают плавать на свежую каплю раствор ЦС, которая не должна находиться в чашке более 15-30 мин. ЦС нельзя использовать повторно. Контрастирование длится от 30 с до 15 мин, затем сеточку поднимают с капли так, чтобы на срезах осталась большая капля контрастера, и немедленно 25 раз окунают в свежеприготовленный 0.01 М раствор NaOH, а потом в бидистиллированную воду, свободную от углекислоты. Избыток жидкости между браншами пин­цета необходимо удалять. Затем сеточки высушивают. Свежепри­готовленный или долго хранившийся контрастер рекомендуется вначале проверить на небольшой партии УС [11, 70, 367].
  

8.2.2.3. Многокомпонентное контрастирование

  
   При совместном использовании УА и ЦС контрастность пре­парата увеличивается в значительно большей степени, чем при раздельном применении этих веществ. Поскольку обычно до этого ткань окрашивалась в ЧО, то данную процедуру правильнее на­звать "тройным окрашиванием" [72]. Еще большей контрастности можно достичь последовательным контрастированием УС с по­мощью ЦС, УА и снова ЦС.
   Объекты можно окрашивать в блоках с помощью УА, а затем в УА и ЦС контрастировать уже УС на сеточках. В большинстве ла­бораторий вначале УС окрашивают УА, а затем ЦС. После каждого красителя УС тщательно промывают. Используемые совместно УА и ЦС дают довольно стабильные результаты. Обычно двойное окрашивание УС производят по следующей схеме: 1) окрашива­ние с помощью УА (в термостате) - 15 мин; 2) промывание в воде; 3) высушивание на воздухе; 4) окрашивание с помощью ЦС при комнатной температуре - до 30 мин; 5) промывание в воде; 6) вы­сушивание на воздухе.
   Если срезы плохо контрастируются обычным способом, то хо­рошие результаты получаются в случае применения следующей схемы окрашивания: 1) окрашивание с помощью ЦС - 1-5 мин; 2) промывание; 3) высушивание; 4) окрашивание с помощью УА -40 мин; 5) промывание; 6) высушивание; 7) окрашивание повтор­но с помощью ЦС - 20 мин; 8) промывание; 9) высушивание.
  

8.3. УСЛОВИЯ КОНТРАСТИРОВАНИЯ

  
   Для контрастирования надо использовать свежие и сверхвысокочистые реактивы, хранить растворы свинца в химически чистой, герметически закрытой темной посуде. Для уменьшения контакта контрастирующего раствора с углекислотой воздуха удобно хранить его в шприце, прикрывая после употребления канюлю шпри­ца колпачком; контрастирование сеточек надо вести либо в атмос­фере инертного газа, либо в присутствии поглотителя углекислого газа - сухой щелочи. Перед ополаскиванием следует удалить ос­татки контрастирующего раствора с сеточки и пинцета чистой фильтровальной бумагой. Если проводится двойное контрастиро­вание, то необходимо строго следить за тем, чтобы в раствор, со­держащий свинец, помещались УС, тщательно отмытые и высу­шенные после контрастирования в УА.
   Часто используют окрашивание сразу нескольких сеточек, по­мещенных в специальный изолированный от атмосферы контей­нер (такие контейнеры выпускает ряд фирм), с помощью коммер­ческих реагентов [71, 105, 139].
   Надо помнить, что ионизация объекта под действием элект­ронного луча может изменять его свойства и загрязнять поверх­ность, изолируя компоненты клеток от молекул красителя. УС лучше контрастировать непосредственно перед просмотром в ЭМ [11, 179]. Возникающие нередко после контрастирования загряз­нения срезов можно существенно уменьшить, если УС держать по­сле резания влажными, а высушивать уже после окрашивания, за­щитив от пыли. Предложен простой метод удаления осадков после двойного контрастирования: промывание сначала в 10%-ной све­жеприготовленной уксусной кислоте (1 мин), затем в воде [224].

8.4. ПРИМЕНЕНИЕ МОРДАНТОВ

  
   Мордант - это химическое вещество, которое так меняет струк­туру тканей, что они становятся более восприимчивыми к после­дующим красителям. Термин "мордант" происходит от француз­ского слова mordre - кусать. В качестве мордантов может выступать таниновая кислота (ТК), эффект которой обеспечивается в основном галловой кислотой, реагирующей с карбоксильными группами. Обработка галлоилглюкозой фиксированной ткани су­щественно увеличивает контрастность препаратов (см. Приложение, 8-5.4). Использование галлоилглюкозы и ТК позволяет улуч­шить сохранность ультраструктур, увеличить контрастность и вы­ход реакционного продукта при гистохимических реакциях, уменьшить экстрагирование осмиевой черни во время дегидрата­ции. С той же целью после постфиксации и отмывания в буфере объекты можно обработать в 4%-ном растворе галаскорбина (вме­сто ТК) и снова промыть [3].
   Обработка УС с помощью ТК и водного раствора УА увеличи­вает контрастирование частиц гликогена и коллагеновых фибрилл, но блокирует окрашивание других клеточных компонентов, обыч­но контрастируемых УА [354]. Специфичность мордантного эф­фекта зависит от морданта, а не от используемой соли тяжелого металла. Комбинация ТК + УА + ЦС создает интенсивную контр­астность и особенно высокую электронную плотность частиц гли­когена [83].
  

8.5. НЕГАТИВНОЕ КОНТРАСТИРОВАНИЕ

  
  
   Негативное контрастирование (см. Приложение, 8.6) обеспечи­вает получение высокого разрешения при исследовании биологи­ческих макромолекул и изолированных ультраструктур. При этом вокруг объекта создается гомогенный фон вещества большой элек­тронной плотности. Негативный контрастер увеличивает контраст­ность биологических частиц путем инфильтрации пор и неровно­стей на поверхности образца и окружения электронно-прозрачного объекта электронно-плотным материалом: биологический объект
   выглядит как электронно-про­зрачная область на фоне элект­ронно-плотного окружения. Иногда можно обходиться без фиксации. Методика проста и непродолжительна. Для изуче­ния тканей метод малопригоден (рис. 26).

0x01 graphic

   Рис. 26. Схема формирования изобра­жения объекта при негативном контрастировании. А - вид сбоку; Б - вид сверху. 1 - объ­екты; 2 - раствор соли тяжелого метал­ла; 3 - стекло.
   Разрешение при негативном контрастировании выше, чем в случае УС. Предел разрешения определяется размером частиц высушенного красителя. При использовании ФВК предел раз­решения составляет приблизи­тельно 1.2 нм. Если применяет­ся урановая соль муравьиной кислоты, то разрешение не­сколько выше [172, 173].
  

8.5.1. Красители для негативного контрастирования

  
   Вещества, применяемые для негативного контрастирования, должны, во-первых, не вступать в реакцию с объектом, во-вторых, быть хорошо растворимыми и иметь высокую электронную плот­ность, в-третьих, иметь высокую точку плавления и быть термиче­ски стабильными для предупреждения сублимации и плавления под электронным лучом (табл. 4).

Таблица 4. Вещества, используемые для негативного контрастирования

Соль

Концентрация, %

Для контрастирования следующих структур

Молибденацетат

1-3

Мембраны, субъединицы ферментов, кле­точные фракции

ФВК

0.5-2

Вирусы, бактерии, клеточные фракции, замороженные срезы, макромолекулы (ДНК, актин, ферменты)

УА

0.5-2

То же

Уранилмагнезиумацетат

1

То же

Уранилоксалат

0.012 М

Небольшие макромолекулы

Уранилформат

0.5-2

То же

  
   Для разных объектов используют различные контрастирую­щие вещества. Очень часто для улучшения окраски необходимо подобрать рН. Буферный раствор, в котором суспензированы объ­екты, может не подходить для смешивания с негативным контрастером. В этом случае следует применить диализ.
   Для негативного контрастирования используют молибдат ам­мония (2-4%-ный), ФВК в виде натриевой или калиевой соли (1%-ный), кремневольфрамовокислый натрий, (2%-ный, рН 7.0), УА (0.5-2%-ные растворы, рН 2.0-5.0), уранилоксалат (см. Прило­жение, 8.6.2), уранилформиат, который особенно хорошо контр­астирует микрорельеф (1%-ный, рН 5.0). Время окрашивания - несколько минут. Наиболее популярны УА и ФВК.
   Урановые соли быстро кристаллизуются под электронным пучком. Кроме того, УА при негативном контрастировании может "положительно" окрашивать исследуемую структуру. Его микро­кристаллы под действием пучка электронов могут перемещаться по подложке. Наконец, он способен вызывать агрегацию изучае­мых частиц. Преимуществом УА и уранилформиата является их самая высокая электронная плотность.
   Молибденацетат удобен для негативного контрастирования осмотически чувствительных органелл по той причине, что его 2%-ный раствор является изотоничным. Однако он менее элект­ронно-плотен, чем другие красители.
   Фосфорно-вольфрамовокислые натрий и калий широко ис­пользуют для негативного контрастирования вирусных частиц, белковых молекул и липосом, однако эти красители оказывают разрушительное воздействие на многие мембранные системы. Фосфорно-вольфраматы взаимодействуют с липопротеинами с об­разованием "миелиновых фигур". Кремневольфрамовокислый на­трий дает мелкогранулярный осадок [172, 173].
  

8.5.2. Приготовление негативных контрастеров

  
   УА растворяется с использованием интенсивного перемешива­ния в бидистиллированной воде в концентрации 1-2 %. Раствор готовится за сутки до использования, так как УА плохо растворя­ется в воде. Раствор должен быть прозрачным и храниться в защи­щенном от света месте. Нельзя применять ФБ при контактирова­нии с УА, так как в этом случае УА выпадает в осадок.
   ФВК готовится в виде 1-2%-ного раствора. рН устанавливается в пределах от 5.0 до 7.0 с помощью 1 М КОН. Если рН ниже 6.0, то краситель стабильно хранится в холодильнике в течение многих недель. Для улучшения растекаемости красителя к нему добавляют несколько капель бычьей фетальной сыворотки, 3-4 капли 10%-ного крахмала или бычьего сывороточного альбумина (БСА) до конечной концентрации 0.01 %. Для достижения изоосмотичности к раствору можно добавить 0.4 % сахарозы, однако она разлагается под пучком электронов и загрязняет колонну микроскопа. ФБ со­вместим с ФВК.
   Молибденацетат (1-2%-ный раствор на бидистиллированной воде) используется для негативного контрастирования субъединиц ферментов, мембран, различных клеточных фракций. Получаемая контрастность меньше, чем в случае УА, но фон более мелкозер­нистый что и обеспечивает лучшее по сравнению с УА разреше­ние. Молибденацетат не так стабилен, как ФВК, но аналогичен по этому параметру УА [9,172, 173].
  

8.5.3. Общая схема негативного контрастирования

  
   Успех негативного контрастирования зависит от того, будут ли агрегировать частицы и насколько случайно они распределены по подложке. Краситель может смешиваться с взвесью объекта до на­несения его на подложку, либо наносится на подложку после адге­зии к ней объекта. Суспензирование образцов в растворе контр­астера позволяет получать различную ориентацию изучаемых час­тиц на подложке.
   При обычной процедуре негативного контрастирования кон­центрация частиц должна быть порядка 10-6 - 10-7 на 1 мл. Раствор исследуемого белка должен иметь концентрацию 0.1-0.2 мг/мл, суспензия липидов - 0.1-0.5 мг/мл, взвесь клеток и клеточных мембран - 0.5-1.0 мг/мл. При подборе оптимальной концентра­ции важно добиться, чтобы не было наложения частиц друг на друга. Контрастируемый материал обычно суспензируют в гипото­нических растворах. При негативном контрастировании осмотически чувствительных структур (митохондрий, хлоропластов и других окруженных мембранами органелл) часто приходится в те­чение 12-24 ч проводить диализ фракций против изотонических растворов веществ, таких как ацетат аммония и карбонат аммо­ния. Наиболее простыми методами негативного контрастирования являются метод нанесения капли на сеточки и метод касания капли.
   При проведении негативного контрастирования углеродную подложку рекомендуется выдержать в тлеющем разряде в при­сутствии паров аммиака. Можно использовать УФО и погруже­ние подложки в раствор вещества, богатого катионными группи­ровками, например альцианового синего или полилизина. Такая обработка существенно увеличивает адсорбцию отрицательно заряженных биологических объектов. Однако краситель может заполнить микронеровности подложки, что увеличивает уровень "шума".
   Существуют различные способы нанесения образцов на под­ложку.
  

8.5.3.1. Метод капли

  
   На взятую пинцетом сеточку с подложкой наносят каплю взве­си объекта. Через 1 мин после адсорбции объектов поверхностью на сеточку помещают каплю раствора для негативного контрасти­рования. Избыток жидкости удаляется путем касания конца сеточки фильтровальной бумагой. После высушивания в течение 15-30 мин образец может быть исследован в ЭМ. Можно смешать взвесь образца с красителем (1: 1, по капле) на пленке парафильма, а затем каплю смеси поместить на сеточку.
  

8.5.3.2. Метод флотации

  
   Сеточку с подложкой помещают на поверхность капли взвеси объекта. За 1 мин объект успевает адсорбироваться на поверхности подложки. Затем сеточку с объектом переносят на рядом располо­женную каплю раствора негативного контрастера на 30 с и высу­шивают.
  

8.5.3.3. Метод распыления

  
   Раствор красителя смешивают с взвесью объекта и напыляют на подложку. При анализе патогенных частиц такая процедура представляет большую опасность для здоровья. Взвесь материала готовят обычно в 1%-ном водном растворе контрастера и из пуль­веризатора либо с помощью микропипетки наносят на поверх­ность сеточки с подложкой. Сеточки высыхают почти мгновенно, и образуется тонкая пленка красителя, заключающая в себе объект [9, 172, 173].
  

8.6. КОНТРАСТИРОВАНИЕ ПРИ КРИОЗАЛИВКЕ

  
   После фиксации альдегидами и заливки в Ловикрил визуали­зация ультраструктур в ТЭМ обусловлена главным образом релье­фом поверхности получаемых УС [309]. Поэтому требуется контр­астирование. В большинстве случаев ловикриловые УС контрасти­руют 3%-ным водным раствором УА (5 мин), а затем ацетатом или цитратом свинца по Миллонигу (45 с). Можно улучшить контрастность путем введения УА при дегидратации [94, 97, 309].
   Разработан очень эффективный способ контрастирования ловикриловых УС - адсорбционное контрастирование раствором УА в метилцеллюлозе (МЦ) [309]. Сеточки с УС помещают на повер­хность капли раствора, содержащего 1.8 % УА и 0.2 % МЦ (рН 4.5-6.0), затем удаляют избыток жидкости путем прикосновения края сеточки к фильтровальной бумаге. УС высушивают на воздухе. Приготовление 2%-ного раствора МЦ (Methocell, Fluka) осуществ­ляется путем добавления порошка при постоянном перемешива­нии к нагретой до t=95®С воде. Затем раствор выдерживают на льду в течение 8 ч, центрифугируют при 55000 об./мин в Бекмановской центрифуге в течение 1 ч при t=4®С, хранят в холо­дильнике. Контрастирование УС из гидрофильных акрилатов с по­мощью УА + МЦ основано на том, что УА аккумулируется в ще­лях, формирующихся в процессе резания в месте контактирования мембран объектов с акрилатами, обеспечивая их высокую элект­ронную плотность. МЦ выполняет функцию среды, содержащей УА, кроме того, она защищает УА от преципитации.
   Для контрастирования ловикриловых УС рекомендуются сле­дующие режимы: 1) насыщенный водный раствор УА (если НМ20 и НМ23, то 25-35 мин; если К4М и КИМ, то 5-15 мин); 2) тща­тельное промывание в трех сменах по 5 мин; 3) ацетат свинца по Миллонигу (можно использовать ЦС) в течение 1-3 мин. Необхо­димо удалить углекислый газ из камеры для контрастирования. УС из ловикрилов К4М и КИМ перед помещением на каплю рас­твора УА рекомендуется поместить на короткое время на каплю воды (см. Приложение, 85.5).
  

8.7. КОНТРАСТИРОВАНИЕ КРИО-УС

  
   Для предупреждения образования мембранных везикул на не­фиксированных замороженных срезах (реакция на обнажение гид­рофобного слоя мембраны при скалывании) можно использовать обработку срезов вначале нейтральным, а затем кислым раствором УА.
   К сожалению, интенсивность контрастирования значительно варьирует от среза к срезу. Это связано с тем, что из заморожен­ных срезов контрастер быстро и неравномерно вымывается. Для того чтобы этого избежать, используют контрастирование в смеси УА + МЦ без отмывания в воде (см. Приложение, 85.6).
   Вначале крио-УС стабилизируют, контрастируя их 10 мин в крупной капле 2%-ного нейтрального УА, который готовят путем смешивания равных объемов 4%-ного УА и 0.3 М оксалата калия (рН доводят до 7.0-7.4 путем добавления небольших объемов 10%-ного гидрохлорида аммония), промывают в 4-6 крупных каплях воды, переносят на каплю 1.8-2%-ного раствора МЦ, содержащего 0.1-0.4 % кислого УА, на 10 мин; можно также использовать смесь, содержащую 1.8 % ПЭГ-1540, 0.2 % МЦ (вязкость 400 или 1500 сП) и 0.005-0.1 % кислого УА. Каждую сеточку поднимают с помощью платиновой петли и после удаления избытка заливоч­ной среды фильтровальной бумагой высушивают на воздухе. Из­быток жидкости надо удалять только до такой степени, чтобы вы­сушенная пленка заливочной среды имела серебристо-золотой или золотисто-голубой цвет [309].
   Часто после этой процедуры крио-УС обнаруживают специ­фические черты негативного контрастирования: контрастер больше концентрируется вокруг органелл, чем в цитоплазматическом матриксе. Этот метод применяют, если маркером служит коллоидное золото (КЗ), а не ферритин, поскольку после нега­тивного контрастирования частицы ферритина плохо выявля­ются [172].
   Эти методы чаще используют для контрастирования мембран­ных структур. Для контрастирования фибриллярных структур крио-УС вначале обрабатывают (15 мин) 1%-ным ЧО, промывают два раза в воде, обезвоживают в двух сменах этанола и два раза промываются в амилацетате. Каждая промывочная или дегидратационная процедура продолжается 2 мин. Сеточки затем оставляют в 1%-ном растворе этилцеллюлозы, приготовленном на амилаце­тате, на 10 мин, вынимают с помощью пинцетов, немедленно ка­саются сеточки со срезом фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
   При контрастировании крио-УС в смеси УА и поливинилового спирта, если соотношение их концентраций 1 : 10 (0.2-0.3 % УА и 2-3 % поливинилового спирта), контрастирование будет пози­тивным, если 1 : 1 или 10 : 1 - негативным. Контрастирование УА можно усилить с помощью ЦС. Для этого после окраши­вания 2%-ным кислым УА сеточки промывают в воде и поме­щают на каплю смеси, содержащей 0.002-0.01 % ЦС и 3 % поливинилового спирта, на 5-10 мин, а затем заключают в эту смесь. Можно сделать по-другому: после контрастирования в УА промыть в воде, окрасить в 0.3%-ном ЦС (2 мин), промыть в трех каплях воды и поместить в смесь УА и поливинилового спирта. В первом случае опасен контакт с воздухом, что при­водит к образованию частиц (5-10 нм) карбоната свинца. Крио-УС можно контрастировать в 40 [161, 350] (см. Приложе­ние, 8.5.6).
  

8.8. АРТЕФАКТЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ КОНТРАСТИРОВАНИИ

  
   Артефакты появляются в основном при недостаточном или из­быточном окрашивании структур, в случае использования старых растворов, грязных реактивов и др. Артефакты часто обусловлены наличием электростатического заряда на поверхности среза, изме­нениями температуры воздуха и влажности.
   Контрастеры легко реагируют с двуокисью углерода, образуя нерастворимые осадки. ЦС при взаимодействии с двуокисью угле­рода, который может быть растворен в воде или содержаться в воз­духе, образует углекислый свинец. Последний в виде мелких тем­ных частиц оседает на срезах, делая их совершенно непригодными для изучения. Предотвратить это часто бывает чрезвычайно труд­но, да же если очень тщательно оберегать краситель от контакта с углекислым газом. ЦС иногда откладывается в виде скоплений размером 5 нм, что существенно ограничивает разрешение.
   УА на срезах часто выпадает в виде игольчатых или ромбовид­ных кристаллов умеренной электронной плотности или грануляр­ных скоплений, а ЦС - в виде прямоугольных кристаллов высо­кой электронной плотности. Форма кристаллов может меняться в зависимости от условий контрастирования.
   Осадки карбонатов свинца имеют округлую форму и часто ока­зываются сгруппированными вблизи переплетов сеточки. При сильном загрязнении они покрывают весь препарат.
   Нечеткость мембран, которые выявляются не сплошной ли­нией, а конгломератом точек и мелких гранул, может быть резуль­татом не только плохой фиксации, но и плохого контрастирова­ния. Своеобразным артефактом является ложная негативная контрастность, иногда возникающая при избыточной обработке срезов насыщенным раствором УА.
  

8.8.1. Артефакты микроскопии

  
   Под пучком электронов может сублимироваться заливочная среда, уменьшая толщину среза. Кроме того на срезах под пучком могут образовываться углеводородные пленки, увеличивающие об­щую электронную плотность среза. Поэтому желательно вначале делать снимки на малом увеличении (с малой лучевой нагрузкой на объект), а потом на большом. Возможен тепловой дрейф срезов, обнаруживаемый при больших увеличениях. Рекомендуется в на­чале просмотра объектов расфокусировать электронный пучок для стабилизации исследуемых срезов [11,121].
   Глава 9 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ
  

9.1. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

  
   Среди множества гистохимических методов, применяемых для СМ, лишь небольшое число адаптировано для ЭМ. Это связано с тем, что конечный продукт реакции должен быть электронно-плотным, не растворяться и не смещаться в процессе препариро­вания, быть стабильным под электронным пучком. ЭМ-гистохи­мия стремительно развивается, однако из-за ограниченного объе­ма книги мы не в состоянии привести все ее методы (см. Приложение, 9), число модификаций которых насчитывает десят­ки тысяч наименований (подробнее см. [15, 235]).
  

9.2. ЭМ-ГИСТОХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ

  
   Ферментная ЭМ-гистохимия - это комплекс методов ЭМ-визуализации ферментов в тканях и клетках. Их цель - продемонст­рировать наличие ферментативной активности на морфологиче­ски хорошо сохраненных тканях. Метод считается прецизионным, если электронно-плотный осадок конечного продукта реакции ло­кализуется в месте прижизненной локализации фермента in vivo, воспроизводимым, если дает воспроизводимые результаты незави­симо от места и времени проведения, специфичным, если продукт реакции образуется исследуемым ферментом, и пропорциональ­ным, если количество образующегося продукта реакции пропорци­онально активности фермента in vivo [15, 235].
   ЭМ-гистохимия ферментов использует способность ферментов при расщеплении субстратов выявлять места своего расположе­ния. Для проведения ферментной реакции экзогенный субстрат добавляют к биологическому объекту, непрореагировавший мате­риал отмывают, а объекты готовят для ЭМ-исследования с приме­нением более или менее стандартной процедуры. Общая схема ги­стохимической реакции может быть представлена следующим об­разом: экзогенный субстрат ? фермент ? нерастворимый продукт реакции ? захватывающий агент ? электронно-плотный продукт (осадок) [15, 235, 357].
   Можно выделить три группы методов: 1) преципитация солей тяжелых металлов, например свинца; 2) осаждение органических неметаллических компонентов (окисление-восстановление), на­пример солей тетразолия; 3) образование осмиофильных полиме­ров, связывающих осмий при последующей проводке, например ДАБ; 4) реакции со вспомогательными экзогенными ферментами (любой из вышеупомянутых принципов).
   Захватывающий агент - это экзогенно добавляемое вещество, которое связывает и сохраняет (захватывает) продукты энзиматической реакции, а также делает их видимыми под ТЭМ или СЭМ. В ряде случаев требуются дальнейшие превращения захватываю­щего агента, для того чтобы сделать его электронно-плотным. В качестве такого реагента в большинстве случаев применяют нера­створимые соли тяжелых металлов, которые интенсивно рассеива­ют электроны. Наиболее часто для этих целей используют свинец, церий, магний, барий, кадмий, кобальт, медь и др. Так, фосфатные группы, освобождающиеся под действием фосфатаз, связываются свинцом с образованием нерастворимого фосфата свинца. Захва­тывающий агент сам по себе может быть ферментом (например, пероксидазой), который обладает способностью реагировать с дру­гими субстратами с образованием электронно-плотных осадков.
   Реакции осаждения солей тяжелых металлов обычно состоят из трех этапов: ферментативная реакция, реакция захвата (осажде­ния), реакция превращения в электронно-плотный продукт. По­следний этап присутствует не во всех случаях.
   Реакции окисления-восстановления обычно проводятся с акцеп­торами электронов (тетразолиями). В ЭМ используют тетранитротетразолий и тиокарбимил нитротетразолий, так как они осмиофильны. Можно применять искусственный переносчик электро­нов - феназинметасульфат. Эти реакции можно проводить в один этап, например для выявления цитохромоксидазы и пероксидазы [235, 357].
   При проведении ЭМ-гистохимических реакций некоторые ко­нечные продукты требуют осмирования, поэтому обработка в ЧО включена в пропись. Однако ЧО может использоваться и в качест­ве постфиксатора. Для улучшения контрастности объектов в этом случае рекомендуется использовать ЧО в комбинации с ферроцианидом (см. Приложение, 3.10.2) [235, 357].
  

9.2.1. Методы осаждения металлов при выявлении гидролитических ферментов

  
   Наиболее типичными методами в данной группе являются ме­тоды выявления кислых гидролаз: фосфатазы, 5'-нуклеотидазы и др. Особняком стоят методы выявления АТФаз, щелочной фосфа­тазы, глюкозо-6-фосфатазы. Широкое применение в ЭМ нашли методы детектирования эстераз и особенно холинэстеразы.
   Методы выявления оксидаз делятся на две группы: 1) с ис­пользованием ДАБ (для определения пероксидазы, цитохромоксидазы, каталазы, производных гема); 2) с использованием хлорида церия (для выявления НАДН-оксидазы и других оксидаз, дегидрогеназ). Методы ЭМ-гистохимии с ДАБ (для выявления цитохром-С-оксидазы, каталазы, пероксидазы) приобрели широкое рас­пространение. Мономер ДАБ имеет слабо-коричневый цвет, водо­растворим, тогда как полимер коричневый, осмиофильный, не растворим в воде (см. Приложение, 9.5). Существуют методы се­ребряного усиления ДАБ-реакции. Диффузия окисленного ДАБ в препаратах может быть предупреждена с помощью обработки тка­ней (после иммуноцитохимической реакции связывания) гипертоническим раствором сахарозы. В качестве ЭМ-гистохимического реагента широко применяется феррицианид. Методы с феррицианидом используются для выявления оксидаз и дегидрогеназ, эстераз и арилсульфатаз. Феррицианид в качестве искусственного акцептора восстанавливается до ферроцианида, который в присут­ствии ионов меди выпадает в осадок, имеющий высокую элект­ронную плотность. Этот первичный продукт может быть усилен с помощью ДАБ и ЧО. Основанные на использовании церия мето­ды превосходят те, что базируются на реакции с феррицианидом. Поэтому реакции выявления оксидаз здесь также не приводятся (см.: [235, 357]).
   Соли тетразолия нашли широкое применение в ЭМ-гистохи­мии при выявлении дегидрогеназ (сукцинатдегидрогеназы, диафоразы, лактатдегидрогеназы и др.). Поглощая электроны, они легко восстанавливаются до формазанов. Для проведения реакции используют физиологические субстраты, поэтому любые дегидрогеназы и оксидазы могут выявляться с помощью солей тетразо­лия. Мы не приводим здесь примеров реакции с тетразолиями для выявления оксидаз и дегидрогеназ, поскольку в первом случае лучшие результаты получаются с солями церия, а во втором - с феррицианидом (подробнее см.: [15, 235, 357]). Здесь лишь отме­тим, что в ЭМ-гистохимии используются только производные нитросинего тетразолия, например дистирилнитросиний тетразолий, и BPST-тетразолия. Они довольно медленно проникают в тка­ни, поэтому к инкубационной среде рекомендуется добавлять Три­тон Х-100. Обработка в ЧО из-за окисления формазана может вы­зывать ложные отрицательные результаты. То же иногда является следствием медленного проникновения красителя в ткани. Нако­нец, остающийся связанным с тканями непрореагировавший тетразолий может давать ложный положительный результат. Поэтому образцы надо тщательно отмывать.
   В ЭМ-гистохимии нашла применение реакция азосочетания, например для выявления аминопептидаз. Методы с солями диазония (гексазотированный парарозанилин и гексазотированный но­вый фуксин) используются для ЭМ-выявления эстераз и протеаз.
   Методы азосочетания очень похожи на азоиндоксиловый метод, но в качестве субстрата используется альфа-нафтилацетат.
   Протеазная активность выявляется с помощью синтетических субстратов, содержащих или одну аминокислоту, или их цепочку в зависимости от специфичности реакции. Большинство протеаз и их физиологических ингибиторов очень чувствительны к фиксации, а некоторые и к колебаниям рН. К примеру, лизосомальные катепсины ингибируются при рН меньше 7.0. Добавление в инкубацион­ную среду поливинилового спирта повышает точность этих методов.
   Существуют и другие методы выявления ферментов для ЭМ-гистохимии: свинцово-оксалацетатный метод определения трансаминазы, орнитин-карбамоилтрансферазы, ацилтрансферазы, других трансфераз, карбонилангидразы [15, 235, 357].
  

9.2.2. Применение ионов церия - новый шаг в ЭМ-гистохимии

  
   При использовании хлорида церия конечный продукт реак­ции - перекись водорода - захватывается церием с образованием нерастворимого в воде электронно-плотного осадка. Вначале церий был предложен только для выявления оксидазной активности, а затем и для захвата образующихся фосфатных ионов. Сейчас ста­ло понятным, что в принципе все методы, основанные на осажде­нии металлов, могут быть осуществлены с ионами церия. Причем получаемые результаты оказываются лучше.
   Недостатки иона свинца как захватывающего агента очевидны. Так, в случае применения методов осаждения свинца возможны появление неспецифических осадков свинца и диффузия продук­тов промежуточных реакций. При высоких значениях рН очень сложно удержать ионы свинца в растворе, кроме того, они ингибируют активность многих ферментов. Ионы церия имеют сущест­венные преимущества: 1) методы лучше воспроизводятся; 2) обра­зующийся осадок имеет более мелкогранулярную структуру; 3) об­разуется меньше неспецифических осадков; 4) ингибирующее влияние на ферменты выражено меньше [235, 357].
   Существует несколько способов увеличения проницаемости тканей для церия: 1) преинкубация в среде без субстрата; 2) добав­ление к инкубационной среде 0.0001-0.0002 % Тритона Х-100; 3) замораживание объектов в жидком азоте. Инкубацию (и преинкубацию) обычно проводят при t=37®С в течение 10-60 мин (в зависимости от ткани). Неспецифические осадки, такие как гидро­окись церия, могут образовываться в щелочной среде, однако они легко удаляются путем промывания объектов в течение ночи в 6.8%-ной сахарозе на 0.1 М КБ (рН 6.0, t=4®С).
   Ионы церия применяют и для выявления оксидазной активно­сти. Одним из продуктов реакции является перекись водорода, ко­торая связывается ионами церия с образованием, вероятно, гидро­окиси церия. Осадок имеет мелкогранулярную структуру, неспеци­фические преципитаты не найдены. Поскольку каталаза пероксисом также образует перекись водорода, то во время прове­дения оксидазной реакции активность каталазы желательно блоки­ровать с помощью добавления в среду азида натрия или 3-амино-1,2,3-триазола (а чаще преинкубации с этими веществами). Кроме церия в ЭМ-гистохимии используются стронций и барий [15, 235, 357] (см. Приложение, 9.1-9.8).
  

9.2.3. Условия проведения гистохимических реакций в ЭМ

  
   Процесс препарирования, как правило, включает фиксацию (обычно альдегидную), измельчение, инкубацию с раствором суб­страта, обработку захватывающим агентом, отмывание, постфик­сацию, обезвоживание, заливку, подготовку к просмотру в ТЭМ. В зависимости от исследуемого фермента может отсутствовать тот или иной этап. К примеру, в некоторых случаях, для того чтобы избежать маскировки продукта реакции осмиевой чернью, пост­фиксацию опускают.
   Криоультратомия не нашла практического применения в фер­ментной ЭМ-гистохимии. В крио-УС содержится слишком малое количество фермента для успешного проведения реакции. Подав­ляющее большинство ЭМ-гистохимических реакций основано на использовании вибратомных или криостатных срезов толщиной 40-60 мкм. суспензии клеток и, реже, измельченных образцов (до, 0.2-0.5 мм ). Разработаны методы проведения реакций на УС с повторным заключением в смолу [158].
   Очень важными являются физико-химические параметры ин­кубационного раствора, время инкубации и т.д. Для проведения ферментной гистохимической реакции необходимы определенная температура, рН, присутствие субстрата в оптимальной концент­рации. Используемый буфер должен быть совместим с реакцией. Например, КБ чаще используется в методах с применением свин­цовых солей. Ферменты имеют разную субстратную специфич­ность. При проводке продукты реакции могут вымываться эпок­сидными смолами и органическими растворителями. Субстраты и(или) захватывающие агенты проникают в ткани не более чем на 100 мкм. Созданы специальные вибратомы, которые позволяют получать срезы из нефиксированной или слабо фиксированной ткани толщиной от 10 до 150 мкм. Перед резанием объекты обыч­но заключаются в теплую смесь агара. После застывания агар со­здает необходимые условия для резки на вибратоме [15, 235, 357].
  

9.2.4. Фиксация и активность ферментов

  
   Основной задачей метода ЭМ-гистохимии является необходи­мость одновременного сохранения ультраструктуры, активности и локализации ферментов. Для фиксации обычно используется ГА в концентрации 0.2-2 %. Изредка вместе с ГА применяется ФА для обеспечения быстрой фиксации. Режим фиксации должен подби­раться для каждого исследуемого фермента отдельно.
   Для того чтобы получить хорошую сохранность ультраструк­тур, лучше фиксировать до инкубации с субстратом. Это наклады­вает существенные ограничения на режим фиксации, от которого требуется в этом случае выполнение двоякой задачи: обеспечить сохранность как ультраструктур клетки, так и активности фермен­тов. В большинстве случаев фиксация осуществляется с помощью 4%-ного ФА при t=4®С в течение 30-120 мин. Иногда использу­ют смеси ФА и ГА.
   На активность ферментов оказывают влияние буфер, на кото­ром растворен фиксатор, и буфер, использующийся для промыва­ния. Например, показано, что ФБ полностью ингибирует актив­ность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Ферменты очень чувстви­тельны к действию фиксаторов. Инактивироваться некоторые ферменты могут и в ФА. Сохранность ферментов при альдегидной фиксации находится в обратной зависимости от реакционной спо­собности фиксатора. Фиксация обычно снижает активность фер­ментов прямо пропорционально способности фиксатора к образо­ванию поперечных связей. К сожалению, морфологическая со­хранность тканей возрастает с увеличением способности фиксатора к образованию этих связей. Следовательно, невозможно совместить высокий уровень ферментативной активности и хоро­шую морфологическую сохранность ткани. Компромиссом явля­ется использование ФА, который обладает ограниченной способ­ностью к формированию поперечных связей.
   Для лучшей сохранности ферментов можно, во-первых, фик­сировать объект в присутствии субстрата, во-вторых, обрабатывать фиксированные образцы трипсином и, в-третьих, стабилизиро­вать объекты с помощью микроволнового излучения. Фиксация может помочь в дифференцировке энзиматической активности: например, использование низких концентраций ГА не угнетает ак­тивность щелочной и кислой фосфатазы, однако разрушает нуклеозидфосфатазу [15, 235, 357].
  

9.2.5. Контроль

  
   При ЭМ-гистохимическом анализе ферментов обязательно должны быть проведены все возможные контроли: 1) замена суб­страта, 2) исключение субстрата, 3) активация фермента. Сущест­вуют так называемые маркерные ферменты, характерные для оп­ределенных органелл. При биохимическом изучении субклеточ­ных фракций маркерные ферменты используются для оценки степени чистоты выделенной фракции. Например, можно оценить степень загрязненности фракции плазматической мембраны эле­ментами комплекса Гольджи с характерной маркерной энзимати­ческой активностью. Ферменты, меченные коллоидным золотом (КЗ), применяются для локализации субстратов на УС [93].
  

9.3. МЕТОДЫ УДАЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ИЗ ТКАНЕЙ

  
   До сих пор в ряде лабораторий используется ферментная иден­тификация различных веществ: вначале их выявляют окрашива­нием, а затем обрабатывают срезы ферментом и смотрят, сохра­нилась ли окраска. Однако методы ферментного переваривания в основном имеют исторический интерес. Сравнивая ткани, подвер­гшиеся воздействию фермента и не подвергавшиеся таковому, иногда можно установить локализацию тех веществ, которые ис­чезли под влиянием фермента.
   Однако при использовании указанного метода могут возникать значительные повреждения ткани [235, 357].
  

9.4. МЕТОДЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ

  
   Наряду с энзимоцитохимией существуют и успешно развива­ются методы специфического цитохимического окрашивания. Для визуализации актина используют фрагменты миозина, которые специфически связываются с F-актином. Для перфорирования цитоплазматической мембраны клетки обрабатывают неионными детергентами - Тритоном Х-100 или Нонидетом NP-40. После обработки меромиозином актиновые филаменты декорируются таким образом, что вершина образующейся своеобразной "елочки" направлена в сторону начала актинового филамента.
   Методы выявления гликопротеидов и гликозаминогликанов можно разделить на три группы: 1) производные классической ШИК-реакции, 2) основанные на сродстве ФВК при низких значе­ниях рН к полисахаридам, 3) специфичные для кислых групп, на­пример окрашивание рутениевым красным (РК).
   Часто для выявления гликопротеидов и гликозаминогликанов используют модификации окраски Шифф-йодной кислотой. При этом реактив Шиффа обычно заменяется веществами, которые об­разуют отложения электронно-плотных веществ в месте реакции. Применяют ФВК (при низких значениях рН), коллоидную дву­окись тория, коллоидное железо, РК, альциановый синий, соли лантана и коллоидный лантан. Добавление к ГА альцианового си­него (1%-ная концентрация) делает гликозаминогликаны нераст­воримыми. Образующийся в результате комплекс краситель-мудин осмиофилен и, таким образом, его можно увидеть в ТЭМ по­сле дополнительной фиксации ткани в ЧО. Гидроксильные группы могут выявляться этилатом таллия. РК очень плохо рас­творим в воде. Поэтому в процессе растворения его рекомендуется растирать в фарфоровой ступке [15, 235]. Окрашивание анионных групп с помощью РК может быть осуществлено и после фиксации в ГА. Число рутениевых гранул, маркирующих анионные группы, может быть подсчитано. Рутениевые гранулы исчезают при обра­ботке образцов растворами солей при высокой их концентрации (15-2.0 М). Для улучшения проницаемости тканей для РК добав­ляют Тритон Х-100, однако в этом случае сохранность ультра­структур часто оказывается неудовлетворительной (см. Приложе­ние, 9.10 и 9.11)). Окрашивание анионных групп, напротив, резко усиливается. Для выявления отрицательно и положительно заря­женных сайтов в интерстиции применяют катионные и анионные частицы КЗ. Для получения отрицательно заряженных трейцеров частицы КЗ покрывают ацетилированными и "вытянутыми" мо­лекулами БСА, а для создания положительного заряда частицы покрывают метилированными молекулами БСА [166, 179]. Разра­ботан новый маркер для мечения в СЭМ анионных сайтов и сиаловых кислот на поверхности клеток - КЗ, конъюгированное с хитозаном [194, 235, 357].
   Для окрашивания кислых гликоконыогатов рекомендуется по­сле заливки в водорастворимые смолы (ЛР Байт) окрашивать УС 1%-ным альциановым синим (рН 1.0-2.5, 40-90 мин), затем по­сле промывания в кислом растворе докрашивать в 2%-ной ФВК (10-30 мин). Гликозаминогликаны связываются с коллоидными растворами. Плотный аморфный осадок образуется в местах лока­лизации карбогидратов. Для окрашивания гликозаминогликанов часто применяется коллоидная двуокись тория, карбогидраты вы­являют при помощи коллоидного железа, гликозаминогликаны можно обнаружить после обработки тканей акридиновым оранже­вым. Для выявления протеогликанов используют сафранин О, а для сульфатсодержащих полианионов (например, гепаран-сульфатпротеогликан) - альциановый синий в присутствии 0.3 М хлористого магния. Гликокаликс хорошо, но неспецифически контрастируется с помощью РК или Купролинового синего (Cuprolinic Blue) (см. Приложение, 9.9). Оптимальными условиями для окра­шивания гликозаминогликанов с помощью РК является добавле­ние в растворы ГА и ЧО 0.4-0.7 % красителя. Следует использо­вать КБ с рН 7.4. Оптимальной следует считать осмолярность рас­твора в пределах 320 мОсм Ђ20 мОсм. При добавлении РК к раствору ГА рН падает до 6.95 (при концентрации красителя 0.7 %) или до рН 7.0 (при концентрации красителя 0.4 %) [15, 235, 357].
   Для выявления карбогидратов и олигосахаридов применяют лектины, ТК и металлы. Можно использовать модифицированную Шифф-реакцию. Объекты обрабатывают йодной кислотой для специфического оксигенирования карбогидратов. При этом обра­зуются альдегидные группировки. Они затем реагируют со щелоч­ным раствором серебра, которое выпадает здесь в осадок. Вместо серебра можно использовать щелочной висмут. Карбогидраты ок­рашивают с помощью РК (трихлорид гексамина рутения). Карбо­гидраты могут окрашиваться последовательно тиокарбогидразидом и протеинатом серебра (см. Приложение, 9.12). Гликоген вы­является щелочным висмутом, кислые карбогидраты - ионами железа в комплексе с диамином, коллоидным железом, коллоид­ным диоксидом тория. Для визуализации карбогидратов применя­ется метод серебрения: вначале молекула сахара оксидируется с образованием альдегидных группировок, которые затем выявля­ются серебром. В этом случае нельзя применять ГА. Обычно ис­пользуется ФА [15, 235, 357].
   Для ЭМ-изучения гликокаликса пригодны следующие методы: 1) визуализация анионных групп кислых гликопротеидов путем связывания с электронно-плотными катионными реагентами; 2) идентификация клеточной поверхности путем отщепления гли­копротеидов с помощью гликозидаз известной специфичности с последующей обработкой электронно-плотными катионными реа­гентами; 3) визуализация группировок гексоз путем окисления их до альдегидов с помощью периодата с последующим контрастиро­ванием; 4) высокоразрешающая радиоавтография с использовани­ем изотопов, связывающихся с определенными группировками гликопротеидов; 5) меченые лектины, специфически связываю­щиеся с углеводными детерминантами клеточной поверхности. Последний метод сочетает хорошую разрешающую способность с высокой специфичностью [15,190, 235, 357]. Добавление к фикса­тору тиофосфамида позволяет выявить на поверхности клеток тол­стый осмиофильный слой гликокаликса [33].
   Для демонстрации холестерина и других стеролов применяют сапонин, Филиппин и другие антибиотики (подробнее см.: [366]).
   Для ЭМ-гистохимического окрашивания белков используют ФВК, методы выявления сульфгидрильных групп. Биогенные ами­ны окрашиваются акролеин-дихроматиновым методом, а нуклеи­новые кислоты - трихлоридом индия, вольфраматом натрия, уранилацетатом. Специфическими для ДНК являются метод Фельге-на с протеинатом серебра и сочетание метода Фельгена-Шиффа с этилатом таллия. Для окрашивания нуклеиновых кислот в ГА до­бавляют малахитовый зеленый и нейтральный красный [190, 227].
   Базальные мембраны хорошо контрастируются при последова­тельной обработке УС аммиаком, йодной кислотой, тиосемикарбазидом, аммиаком и желатиновым раствором метамина серебра [269]. Ионы серебра окрашивают лизосомы или энтерохромаффинные клетки. Перспективным контрастирующим агентом для внутриядерных структур является комплекс темно-фиолетового индия (III) с гематоксилином. Комплекс Гольджи окрашивается раствором ЧО [15, 157, 235, 357].
   Обработка тканей с помощью ТК и УА или ТК и коллоидного железа увеличивает электронную плотность эластических волокон. Смесь ЧО и ферроцианида натрия используется для выявления гликогена, эндогенных пероксидаз, для увеличения контрастности ферритинсодержащего материала, клеточных мембран [135]. При нейтральном рН смесь ЧО с феррицианидом (при отсутствии ионов кальция) селективно окрашивает межклеточные простран­ства [208]. Имеется множество методов выявления неорганических ионов (калия, натрия, кальция, тяжелых металлов). Широко ис­пользуется фиксация тканей в присутствии пироантимоната калия (калиевой соли сурьмяной кислоты), который при наличии кати­онов образует преципитат [192, 193]. Первоначально эта методика была предложена для выявления натрия, однако большая часть ра­бот посвящалась изучению ионов кальция. При изучении локали­зации кальция в клетке можно не только осаждать катион с по­мощью аниона (пироантимонатный, оксалатный методы и др.), но и выявлять не сам ион кальция, а кальцийсвязывающие компо­ненты ткани. Результаты всех этих методов необходимо контроли­ровать с помощью РМА [248].
   Разработаны методы ЭМ-маркировки рецепторов, например гистаминовых, с помощью конъюгатов гистамина с ферритином [182]. Из срезов ткани, залитой в эпоксидные смолы, можно час­тично удалить белки и полисахариды. При этом снижается элект­ронная плотность рибосом. ДНК можно извлечь из эпоксидных срезов с помощью хлорной кислоты. Предложены способы имп­регнации эндоплазматической сети [15, 235, 357] (см. Приложе­ние, 9.13, 9.14).
  

9.5. СУБСТРАТНАЯ ЭНЗИМОГИСТОХИМИЯ

  
   Принцип данного класса методов состоит в том, что срезы тка­ней и клеток обрабатываются ферментами, конъюгированными с маркерами, для выявления их субстратов. Обычно используется комплекс фермента с КЗ. Наиболее оптимальное мечение достига­ется на хорошо идентифицируемом субстрате.
   УС на никелевых сеточках инкубируют на капле 0.01 М забуференного физиологического раствора при оптимальном для фер­мента рН, а затем - на капле раствора комплекса фермента с КЗ (время зависит от фермента, но обычно составляет 30 мин, t=20®С), промывают струей буфера, потом водой, высушивают и контрастируют в УА и ЦС [235, 357].
   Используются следующие контроли: 1) инкубация УС с комп­лексом фермент-КЗ с добавлением соответствующего специфиче­ского субстрата, который связывает фермент в растворе; 2) инку­бация в неподходящем буфере или при неподходящем рН; 3) ин­кубация с комплексом, у которого ферментная активность инактивирована нагреванием; 4) инкубация с комплексом в при­сутствии специфического ингибитора фермента; 5) инкубация с комплексом в присутствии специфических антител против фер­мента; 6) инкубация с комплексом постороннего белка с КЗ; 7) продолжительная инкубация с немеченым ферментом, что ве­дет к экстрагированию субстрата, затем следует инкубация с ком­плексом фермента с КЗ; 8) обработка тканей, в которых заведомо отсутствует специфический субстрат.
   Глава 10 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ АВТОРАДИОГРАФИЯ
  
   Гистоавторадиография (гисто-АРГ) - это метод, позволяю­щий с помощью изотопов и радиочувствительных эмульсий или растворов локализовать вещества на срезах и на поверхности объ­ектов. Он дает возможность выявить экзогенные или вновь синте­зированные молекулы, если их радиоактивные предшественники были метаболизированы. Возможны следующие способы мечения молекулы-предшественника с помощью изотопа: 1) замещение одного или нескольких атомов радиоактивным изотопом; 2) при­соединение радиоактивного изотопа к молекуле; 3) внедрение радиоактивного изотопа или радиоактивной молекулы в избранную молекулу во время ее синтеза.
  

10.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

   Электронно-микроскопическая авторадиография (ЭМ-АРГ) является практически единственным морфологическим методом, позволяющим судить о динамике метаболических процессов в тканях. Наиболее часто ЭМ-АРГ используется для исследования процессов синтеза и секреции макромолекул. Этот метод полезен для изучения синтеза нуклеиновых кислот, метаболизма липидов, синтеза полисахаридов, а также более мелких молекул. Если изу­чают диффундирующие молекулы, то применяют криометоды. ЭМ-АРГ используется при гибридизации in situ и для локализа­ции мест связывания гормонов. Возможно также сочетание двух методов: ЭМ-АРГ и иммуно-ЭМ [68, 107, 226].
   Кристаллы бромистого серебра в фотографической эмульсии относятся к несовершенным кристаллам, т.е. таким, которые име­ют различные нарушения в кристаллической решетке. Эти нару­шения представляют собой включения кристаллического серебра и называются "центрами чувствительности", или "центрами прояв­ления", от которых начинается проявление всей массы кристалла галоидного серебра. Желатина, отделяя кристаллы друг от друга, делает процесс проявления в них автономным. Он начинается не обязательно в месте попадания бета-частицы, а с центров скрыто­го изображения, которые могут располагаться в любом месте кри­сталла. Это, конечно, снижает разрешающую способность метода.
   Чувствительность метода определяется минимальной концент­рацией радиоактивных атомов, вызывающих восстановление се­ребра в фотоэмульсии [28]. Она прямо пропорциональна концент­рации в срезах радиоактивного вещества и содержанию кристал­лов галоидного серебра в эмульсии. Это связано с тем, что при испускании частиц ионизирующего излучения (бета-частиц) больше половины их уходит в сторону от эмульсии, а часть погло­щается желатиной и не достигает кристаллов. Кроме того, не каждая частица может образовать центр скрытого изображения.
   Специфичность ЭМ-АРГ определяется путем подсчета разни­цы в уровнях мечения в условиях введения меченой молекулы по сравнению с введением смеси меченой молекулы с 40-100-крат­ным избытком немеченого вещества. В последнем случае чаще всего получается 60-90%-ное уменьшение уровня мечения. Обыч­но реакция оценивается на ПС. In vitro специфичность может быть определена путем снижения температуры до 4®С, добавления ин­гибиторов, например ингибиторов синтеза белка, а также заменой гормона агонистом, антагонистом или неактивным аналогом. При исследовании биосинтеза белка естественный предшественник мо­жет заменяться метаболически инертным аналогом [25, 68, 261].
  

10.2. РАЗРЕШЕНИЕ

  
   Разрешающая способность метода ЭМ-АРГ превышает анало­гичный светооптический показатель в 10-15 раз и составляет 50-100 нм, что, однако, значительно меньше разрешения ТЭМ. Такая низкая разрешающая способность объясняется тем, что на авто­графе регистрируется не сам радиоактивный атом, находящийся в каком-либо участке структуры, а побочный эффект его действия на кристаллы бромида серебра, размеры которых довольно значи­тельны. Следовательно, разрешающая способность метода зависит прежде всего от размеров кристаллов галоидного серебра в фото­эмульсии, толщины ее слоя и расстояния между источником из­лучения и эмульсией, т.е. толщины среза. Чем меньше величина кристаллов и толщина срезов, тем больше разрешающая способ­ность метода. Если толщина срезов и диаметр кристаллов пример­но равны, а эмульсия расположена монослоем, то разрешающая способность соответствует величине зерен серебра.
   Рассеяние зерен вокруг источника радиации при гисто-АРГ выше, чем при ЭМ-АРГ. Расстояние между источником излучения и кристаллом бромида серебра представляет собой геометрическое отклонение (ошибку), а расстояние между центром кристалла бро­мида серебра и центром зерна после проявления называется фотографическим отклонением (ошибкой) метода. Суммарная ошибка составляет сумму указанных выше отклонений. В числе факторов, увеличивающих геометрическую ошибку, следует назвать толщи­ну УС и слоя эмульсии, угол испускания (эмиссии) бета-частиц. Размеры кристаллов и зерен определяют фотографическую ошиб­ку.
   Разрешение ЭМ-АРГ зависит от следующих показателей: 1) толщины срезов, 2) толщины слоя эмульсии, 3) использованного проявителя, 4) типа эмульсии, 5) применявшегося изотопа. В луч­шем случае разрешение ЭМ-АРГ не превышает 100 нм. Экспери­ментально установлено, что бета-частица трития может восстано­вить только одно зерно [25, 68, 261].
   В последние годы введено понятие "половинное расстояние" - это расстояние между источником излучения и окружностью вок­руг него, в пределах которой откладывается 50 % тотально прояв­ленных зерен серебра: например, для УС толщиной 120 нм, по­крытого монослоем эмульсии Ilford L4, после проявления в про­явителе Microdol оно составило 165 нм [25, 68, 261].
   Для оценки уровня мечения вначале подсчитывается площадь, занимаемая органеллой. Затем определяется центр каждого зерна (или с помощью кольцевой маски, или нахождением центра зер­на), вокруг которого проводится круг. Радиус круга равен вероят­ной величине разрешения (зависит от указанных выше ошибок). Если только одна органелла локализована в пределах круга, то зер­но обозначается как целое. Если в круг попадает несколько органелл, то зерно обозначается как долевое: например, если три органеллы, то к каждой относят 1/3. Затем подсчитывается абсолют­ный уровень мечения, который соответствует сумме целых и долей зерен для каждого вида органелл, выраженной в процентах к общему числу зерен. Относительный уровень мечения вычисляет­ся как частное от деления абсолютного уровня на процент площа­ди, занятой данной органеллой в данной клетке. Если относитель­ный уровень мечения превышает 1, то можно считать, что про­изошло мечение данной органеллы.
   Круг вокруг зерна с диаметром, равным возможному пути про­бега частицы, называется кругом разрешения. Он показывает, в ка­ких пределах может находиться источник излучения в срезе. Три­тий имеет диаметр круга 1 мкм. Рисование кругов вокруг всех зе­рен и подсчет площади ультраструктур под этими кругами может помочь интерпретировать результаты и определить вероятность, где действительно находится источник излучения в клетке. Можно просто подсчитать органеллы под зернами или определить чис­ленную плотность гранул над данным видом органелл и сравнить с таким же показателем над другими органеллами.
   Разрешение может быть существенно повышено лишь путем одновременного уменьшения толщины среза и размеров кристал­лов. Существенное влияние на разрешающую способность оказы­вает энергия заряженных частиц - с ростом энергии увеличивает­ся область действия излучения, а следовательно, ухудшается раз­решение. Если провести подсчет, то окажется, что для трития разрешение составляет 100 нм, а для фосфора-32 - порядка 300 нм. Все множество используемых в биологии изотопов укладыва­ется между этими пределами [25, 68, 261].
   Для анализа фона вначале подсчитывается среднее число зерен вне среза, затем среднее число зерен в пределах среза. Их частное дает соотношение уровней сигнала и фона. В гетерогенных тканях за уровень фона принимается минимальное среднее количество зерен на популяцию определенных клеток. Если фон превышает 5%, то такой УС лучше не анализировать. Если фон незначителен, а сигнал (число гранул) достаточно велик, то при подсчете можно использовать точечный принцип подсчета, принимая за точку центр зерна.
   Повышение фона при ЭМ-АРГ связано с самопроизвольной активацией кристаллов эмульсии во время длительного хранения, со случайной засветкой или радиационным облучением, с возник­новением напряжений в слое эмульсии при высушивании, перепроявлением. Кроме этих причин сходное влияние (позитивная хемография) на эмульсию могут оказывать некоторые химические компоненты тканей, например лизосомы. Для предупреждения ре­комендуется между УС и эмульсией напылить тонкий слой угля. Позитивную хемографию можно выявить с помощью препариро­вания немеченых УС. Хемографические зерна на электронограм-мах особенно большие и сложные. Такой же эффект оказывают медные сеточки, не покрытые подложкой. Проблема диффузии меченых молекул решается путем замены или исключения заливочных сред. Негативная хемография - исчезновение засвечен­ных кристаллов под действием тканевых компонентов при ЭМ-АРГ - встречается редко.
  

10.3. ПЛАНИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА

  
   Перед началом исследования необходимо решить, какую моле­кулу пометить, в какой биохимической форме будет данная моле­кула использована, какова стоимость препарата и токсичность экс­перимента. Обязательно следует учитывать удельную радиоактив­ность. Если взять слишком маленькую дозу, то экспонирование придется сделать продолжительным и из-за этого резко возрастет фоновая "засветка". Напротив, если доза очень высока, то нару­шится функция клеток.
   Введение изотопа может быть осуществлено импульсно (одно­кратно) или импульсно-последовательно (за однократным введе­нием изотопа вводят нерадиоактивный компонент). Выбор метода введения изотопа существенно влияет на интерпретацию получае­мых результатов. Последовательность основных процедур метода ЭМ-АРГ представлена на рис. 27.
   Место введения меченых молекул зависит от объекта исследо­вания. Если исследуется мозг, то лучше инъецировать метку в же­лудочки мозга, при изучении кишечника рекомендуется вводить изотоп внутрибрюшинно, почки лучше метить с помощью внутриартериального введения изотопа и т.п. В экспериментах на млекопитающих чаще всего используется внутрибрюшинное введение изотопов (см. Приложение, 10.1).

0x01 graphic

   Рис. 27. Этапы метода электронной авторадиографии. А - введение изотопа экспериментальному животному; Б - взятие кусочка ткани; Bi - получение УС (а) и ПС (б); Вг - погружение ПС на стекле в эмульсию и проведение гистоавторадиографии; Г - размещение сеточек с УС на опорных столбиках; Д - погружение проволочной петли (1) в разведенную фотоэмульсию (2); Е - подсушивание образовавшейся эмульсионной пленки; Ж - нанесение мо­нослоя (3) эмульсии (в верхней части петли) на сеточки с УС; 3 - прикрепление сеточек с УС и эмульсией к стеклу; И - экспонирование сеточек в светонепрони­цаемом контейнере; К - нанесение УС на капле прямо на предметное стекло, по­крытое подложкой; Л - погружение стекла с УС в разведенную фотоэмульсию; М - подсушивание эмульсии и экспонирование УС; Н - снятие подложки с по­крытыми эмульсией УС на поверхность воды; О - размещение сеточек на УС; П - извлечение из жидкости плавающей подложки с УС, которую покрывают фильтровальной бумагой; Р - взятие сеточек пинцетом (4) для просмотра в ТЭМ.
   После введения раствора надо выждать определенное время, для того чтобы препарат всосался в кровь и включился в опреде­ленную структуру. Затем объекты быстро фиксируют обычным способом для ЭМ [25, 68, 261].
   Разрушение меченых молекул в организме способствует усиле­нию фона. На получаемых препаратах, особенно в конце экспери­мента, не все излучение исходит от введенных молекул. Источни­ком его являются также метаболиты введенной молекулы. Поэто­му в подобных случаях меченые молекулы рекомендуется вводить внутривенно, а не внутрибрюшинно, поскольку в последнем случае меченое вещество проходит через печеночные микрососуды и ин­тенсивно метаболизируется. [25, 68, 261].
   При изучении биосинтетических процессов обычно использу­ют дозы радиоактивных предшественников 10-40 мкКи на 1 г массы, для исследования связывания гормонов лигандами приме­няется внутривенная инъекция в дозе менее 1 мкКи/г. In vitro ис­пользуется концентрация лигандов 0.2 мкКи/г.
   Время экспонирования УС для ЭМ-АРГ колеблется в зависи­мости от задач исследования от 1 до 12 мес. Большинство иссле­дователей проводят экспонирование при t=4®С, хотя можно это делать при t=20®С. Более низкая температура уменьшает хемографический эффект.
   Перед проведением ЭМ-АРГ можно проверить корректность процедур на ПС с помощью гисто-АРГ. ПС содержат большее ко­личество изотопа и требуют для экспонирования меньше времени. Время экспозиции для ЭМ определяется по количеству зерен на ПС. Одна неделя светооптической экспозиции эквивалентна меся­цу экспозиции для ЭМ (см. Приложение, 10.2).
   При использовании метода ЭМ-АРГ рекомендуется готовить в 5-10 раз больше УС, чем обычно.
  

10.4. УСЛОВИЯ ЭМ-АРГ

  
   На чувствительность метода сильно влияют процесс проявле­ния, а также регрессия скрытого изображения. Причиной исчезно­вения скрытого изображения является "реокисление". Наиболее значительных размеров (до 60 %) оно может достигать при длительной экспозиции и, таким образом, ставит под сомнение вос­производимость и количественную оценку метода. Размеры регрес­сии можно контролировать, экспонируя препараты в атмосфере сухого азота без кислорода или в атмосфере углекислого газа при t=О®С над осушающим реагентом.
   Наиболее широко используемым маркером в ЭМ-АРГ являет­ся тритий, который испускает бета-частицы с коротким пробегом. В меньшей степени применяется изотоп серы 35S. Период полураспада трития составляет 125 лет. Время, необходимое для того чтобы то незначительное количество вещества, которое содержится в срезе толщиной 60 нм, облучило фотографическую эмульсию, лежит в пределах от 2 до 3 мес.
   Если в экспериментах используются радиоактивные препара­ты высокой удельной активности, то надо следить, чтобы они бы­ли свежими, поскольку при длительном хранении таких веществ происходит их разрушение под действием собственного радиоактивнбго излучения (радиола). Кроме того, при подготовке образ­цов следует помнить о возможности неспецифического связыва­ния вводимых радиоактивных аминокислот, что может имитиро­вать высокий уровень радиоактивной метки и адсорбции нуклеотидов внутриклеточными структурами. Для предупрежде­ния данного явления необходимо после фиксации в ГА длительное время (1-2 сут) промывать ткани буфером, после чего постфиксировать в ЧО [25, 68, 261].
  

10.5. МЕТОД ЭМУЛЬСИОННОЙ ЭМ-АРГ

  
   Методы ЭМ-АРГ разделяют на эмульсионные и адсорбцион­ные. Общая схема метода эмульсионной ЭМ-АРГ следующая. Ра­диоактивный компонент вводят в живой организм или в часть его (жизнеспособность последней поддерживают с помощью методов культивирования тканей). Через некоторое время образцы фикси­руют и заключают в смолы, затем из них изготавливают срезы, которые покрывают или приводят в контакт с фотографической эмульсией или радиочувствительным веществом. Через несколько недель или месяцев (применение эмульсии) или часов (примене­ние радиочувствительного раствора) инкубации под действием ионизирующего излучения, выделяющегося из изотопа, происхо­дит экспонирование эмульсии, наступают изменения, которые можно проявить с помощью фотографического процесса. Прояв­ленная эмульсия и препарат наблюдаются одновременно. Полу­ченный препарат называют радиоавтографом. Аминокислоты, нуклеозиды, сахара и некоторые липиды, используемые в качестве меченых предшественников, хорошо сохраняются с помощью обычных методов препарирования. Для визуализации нейтраль­ных жиров, стероидов, нативных пептидов и некоторых других ве­ществ лучше использовать замораживание.
   С каждого блока, предназначенного для ЭМ-исследования, ре­комендуется изготовить ПС и сделать светооптический автограф с целью предварительного анализа материала. Такой анализ позво­ляет, во-первых, сравнивать общий характер распределения зерен в свето- и ЭМ-автографах и выявлять возможные артефакты, во-вторых, выбирать участок для ультрамикротомирования не только по морфологическим особенностям, но и по содержанию метки, в-третьих, ориентировочно судить о сроке экспонирования ЭМ-радиоавтографа по плотности зерен над структурами ПС. Если эта плотность после экспозиции в течение 3-5 сут низка, то не стоит бесполезно тратить недели и месяцы на ожидание хороших ре­зультатов от эксперимента с применением ЭМ-АРГ.
   При исследовании кусочков органов, удаленных при биопсии, разрезанные на мелкие кусочки (OS • 0.5 • 1.0 мм) объекты ре­комендуют [68] помещать в охлажденную до t=2®С смесь среды 199 с сывороткой крупного рогатого скота в отношении 9 : 1. На каждые 5.5 мл полученного раствора советуют добавить 500 мкКи меченного изотопом предшественника, например уридина (удель­ная активность не менее 24 Ки на 0.001 М), и перенести флаконы в термостат (t=37®С) на 15 ч. Во время инкубации через рас­твор медленно пропускается кислород. Далее кусочки промывают холодной средой (1 смена), ФБ (рН 7.4; 3 смены) и фиксируют в течение 15 ч 25%-ным раствором ГА. После фиксации кусочки оставляют на ночь в ФБ с 10-кратной сменой раствора для отмы­вания невключившегося в РНК предшественника. После этого сле­дует постфиксация в ЧО и заливка в эпоксидную смолу.
   При изучении с помощью ЭМ-АРГ легко диффундирующих молекул можно рекомендовать следующие подходы: 1) фиксация с помощью тщательно подобранного фиксатора, который образует осадок с мечеными молекулами; 2) замораживание-высушивание или замещение в замороженном состоянии; 3) лиофилизация крио-УС (в данном случае покрывают сухие крио-УС только сухой эмульсией с помощью метода петли). Так как ГА полимеризуется на поверхности объектов, разрешение покровных структур (напри­мер, эндотелия) после длительной фиксации в нем резко снижает­ся. Для повышения прочности объектов при подготовке их к СЭМ желательно, но не обязательно фиксировать их в ГА несколько су­ток. При выявлении водорастворимых веществ ткани обычно за­мораживают, высушивают и заливают в смолу в вакууме. Заморо­женную ткань чаще подвергают лиофильной сушке, заливают в смолу, избегая контакта с водными средами, и покрывают слоем сухой эмульсии. Пригоден также метод замещения в заморожен­ном состоянии [25, 68, 261].
   Метод двойной метки [68] позволяет исследовать в одном пре­парате обмен двух различных веществ или одного и того же веще­ства, но введенного дважды с определенным промежутком време­ни. Метод дает лучшие результаты на ПС и менее специфичен на УС. В качестве изотопов применяют обычно тритий и углерод-14. Дозы изотопов подбирают таким образом, чтобы излучение три­тия приводило к образованию достаточно плотного скопления зе­рен серебра над клеткой уже через 3-4 сут экспонирования, а угле­род-14 - только через 20-40 сут. Предметные стекла со срезами тканей покрывают тонким слоем эмульсии, экспонируют 3-4 сут, а затем проявляют и окрашивают. Затем эмульсию покрывают тонким слоем какого-нибудь прозрачного и водонепроницаемого вещества, например пластмассы, используемой для заключения срезов, а сверху снова наносят слой эмульсии и экспонируют 20-40 сут. После проявления получают радиоавтограф с зернами се­ребра, расположенными на двух уровнях. В первом, лежащем не­посредственно над срезом, представлены главным образом зерна, образовавшиеся вследствие излучения трития. Доля зерен, отража­ющих излучение углерода-14, в данном случае незначительна из-за короткого срока экспозиции и малого содержания углерода-14 в клетках. Во втором верхнем слое зерна образуются только за счет излучения изотопа углерода, тогда как слабое излучение трития не проникает за пределы первого слоя эмульсии и промежуточного слоя пластмассы. Отдельный подсчет зерен в нижнем и верхнем слоях эмульсии позволяет определять активность синтеза двух ве­ществ в одной и той же клетке.
   Чтобы легче отличать зерна двух слоев, их можно окрашивать, например, в первом слое в синий цвет, а во втором - оставлять черными [355]. С этой же целью можно использовать для второго слоя эмульсию с большей величиной зерен. Определение излуче­ний трития и углерода-14 можно проводить и в одном слое эмуль­сии, для чего наносят толстый (15-20 мкм) слой эмульсии и под­считывают отдельные зерна серебра, образуемые тритием, а также треки, которые возникают при пробеге в эмульсии бета-частиц уг­лерода-14 и состоят из ряда последовательно расположенных зе­рен.

10.5.1. Нанесение эмульсии

  
   Для ЭМ-АРГ требуется специальная эмульсия. Работы с эмульсией производятся в абсолютно светонепроницаемой комна­те (фотолаборатории) с использованием безвредного желто-зеле­ного светофильтра (например, Ilford 902S или N 117) и фонаря с мощностью лампочки не выше 15 Вт. Все манипуляции с эмуль­сией осуществляются на расстоянии 15-2 м от источника света. Для того чтобы проверить затемнение, надо выждать в полной темноте 15 мин, так как только после этого человеческий глаз сможет определить возможные источники засветки. Фонарь со све­тофильтром следует направить в сторону от эмульсии.
   Температура в комнате не должна быть выше 26®С, влажность 70-80 %. В комнате для нанесения эмульсии необходим термостол с автоматической регуляцией температуры, которую следует уста­новить в диапазоне от 39 до 42®С. На нем размещают препараты, на которые наносится эмульсия. В комнате должна быть водяная баня с автоматически регулируемой температурой, которую необ­ходимо установить на 40®С. В водяную баню помещают кронш­тейн-держатель для градуированной мерной посуды различного объема.
   Стеклянным или фарфоровым шпателем желеобразную эмульсию осторожно извлекают из темной посуды, в которой она хранится при t=4®С. Стакан помещают в водяную баню. Эмуль­сию постоянно перемешивают стеклянной палочкой, вращая ее все время в одном направлении. Помешивать эмульсию следует медленно, так как интенсивное перемешивание приводит к образо­ванию воздушных пузырьков. Этот этап длится 25-30 мин, до ис­чезновения комков эмульсии. Чтобы убедиться в полном расплавлении эмульсии, необходимо вынуть из нее стеклянную палочку. Если на ней отсутствуют комки и эмульсия равномерно стекает, то можно приступать к следующему этапу. Нужно определить коли­чество расплавленной эмульсии в стакане и в соответствии с этим добавить 3%-ный раствор тимола из расчета 5 мл на 100 мл эмульсии. Если не предполагается длительное хранение препара­тов, то антисептик можно не добавлять. В этом случае мерной пи­петкой приливают необходимое количество пластификатора (смачивателя, например, 15%-ного раствора СВ1ВЗ), тщательно его размешивают и добавляют дубитель. Обычно на каждые 100 мл разведенной эмульсии 1 мл раствора смачивателя.
   Некоторые исследователи предпочитают не расплавлять эмульсию, а сразу помещать необходимое ее количество в подо­гретый до нужной температуры растворитель и размешивать эмульсию уже там.
   При растворении эмульсии необходимо использовать только стеклянную посуду и избегать контакта эмульсии с металлически­ми предметами. Температура водяной бани, в которой плавится эмульсия, должна быть не выше 41®С. При расплавлении эмуль­сии и помешивании ее стеклянной палочкой следует исключить резкие удары стеклянных предметов друг о друга. При t=41®С фотоэмульсию (например, типа М) расплавляют и смешивают с равным объемом дистиллированной воды или коммерческого рас­твора специального умягчителя или 0.02%-ного раствора бромида калия. Однако некоторые авторы считают, что для разбавления эмульсии раствор бромида калия лучше не применять, поскольку он снижает смачивающие свойства эмульсии. Некоторые типы эмульсий рекомендуется разводить водой в объемном соотноше­нии 1:9с добавлением 1 % глицерина. Глицерин добавляют в эмульсию от растрескивания при хранении. Разведенную эмуль­сию желательно отфильтровать. В дальнейшем эмульсию из водя­ной бани вынимать не рекомендуется. Однако некоторые авторы предпочитают разведенную эмульсию охлаждать при комнатной температуре [52, 68, 261].
   Наиболее ответственным этапом является нанесение фото­эмульсии на УС. Эта операция производится в темноте. Разработа­но несколько приемов нанесения эмульсии на УС. Можно сеточку с УС просто пинцетом опустить в жидкую эмульсию после соответствующего ее разведения. Если УС не находятся на подложке, то в этом случае обеспечивается двухстороннее покрытие пленкой срезов.
   Прикрепить сеточки на чистое предметное стекло можно с по­мощью двухсторонней липкой ленты Scotch.
  

10.5.1.1. Метод погружения

  
   Предметное стекло покрывают коллодиевой или формваровой пленкой, на которую с помощью проволочной петли помещают УС (рис. 28). Для этого изогнутую специальным образом прово­лочную (лучше платиновую) петлю подводят под УС, плавающие в ванночке, и быстрым движением петлю поднимают (рис. 28, А). Петля захватывает УС, которые оказываются на верхней поверхно­сти капли, оставшейся на петле. Предметное стекло подносят к УС, плавающим на капле, и прикасаются к ней той стороной, ко­торая покрыта пленкой, - УС прилипают к подложке (рис. 28, Б). Очень важно точно отметить место прикрепления УС и не "поте­рять" их из виду. Если в дальнейшем эмульсия наносится мето­дом погружения, то лучше всего УС помещать в верхней части стекла. Затем на УС напыляют тонкий слой углерода, который улучшает прикрепление эмульсии, контрастируют их с помощью ЦС (см. гл. 8), помещая каплю раствора последнего на место рас­положения срезов, и промывают. Эмульсию наносят непосредст­венно на ленты срезов каплями с помощью пастеровской пипетки. Избыток эмульсии отсасывают или дают ему стечь. Иногда стекло просто погружают в расплавленную и разведенную эмульсию. По­сле экспонирования и проявления пленку-подложку снимают на поверхность воды, сеточки помещают прицельно на каждую груп­пу УС, подложку с сеточками снимают с поверхности воды и вы­сушивают. Пробные стекла окунают в эмульсию и выносят из фо­толаборатории для оценки - после высушивания слой эмульсии над сеточкой должен иметь в отраженном свете фиолетовый цвет, что свидетельствует об образовании монослоя эмульсии и удачно подобранном разведении.

0x01 graphic

   Рис. 28. Способ переноса УС из ванночки на подложку, расположенную на предметном стекле.
   1 - проволочная петля; 2 - УС; 3 - стеклянный нож; 4 - ванночка; 5 - предметное стекло с подложкой на нижней поверхности; 6 - капля жидкости с плавающими УС.
  

10.5.1.2. Метод проволочной петли

  
   Петлю из медной или платиновой проволоки диаметром 20-40 мм погружают в эмульсию. Лучше использовать петлю в форме капли с крючком на остром конце, за который подвешива­ют петлю при высушивании. После извлечения петлю постепенно переводят в вертикальное положение, держа ее на черном фоне пе­ред лабораторным фонарем со светофильтром 118 на расстоянии 1 м от фонаря. Промакивать избыток эмульсии с петли не следу­ет - надо дождаться, когда лишние капли стекут сами. Свет фона­ря направляют на пленку в петле под острым углом. По мере стекания эмульсии можно наблюдать образование полос интерферен­ции (красного, золотистого и других цветов). При этом в верхней части петли формируется монослой кристаллов эмульсии, кото­рый и имеет вид золотистой зоны. Как только полоска монослоя эмульсии станет достаточно широкой, ее можно нанести на сеточ­ку, укрепленную на столбике. Иногда пленка лопается до возник­новения монослоя. Зоны золотистого и красного (в которой кри­сталлы бромида серебра также образуют сравнительно однородный монослой) цветов существуют очень короткое время, а затем вы­сыхают и сморщиваются. Если вовремя не нанести эмульсию на срез, то перенесенный на сеточку слой будет иметь многочислен­ные складки. В этом случае операцию лучше повторить. Однако постоянно следить за строением и цветом пленки необязательно. Если к моменту нанесения эмульсии на бленду пленка в петле сморщивается, то достаточно осторожно подышать на нее, чтобы полностью расправить и создать обширную красную зону, значи­тельно превышающую ширину бленды. Продолжительное пребы­вание эмульсии при t=42®С приводит к появлению вуали. Поэ­тому всегда надо готовить такое количество эмульсии, которое позволит покрыть 20-30 сеточек. Высушенные после нанесения эмульсии препараты помещают на 3-5 ч в пары перекиси водоро­да, что уменьшает количество фоновых зерен на 90-95 % [25, 68, 261].
   Существенно улучшает результаты нанесение эмульсии с обе­их сторон среза. Для этого ленту срезов помещают на бленду. Предварительно на нее наносят пленку, приготовленную из 0.6%-ного раствора формвара в дихлорэтане. Эта концентрация обеспе­чивает механическую прочность пленки, позволяющую сохранить ее целостность при многочисленных манипуляциях [68]. В то же время получающаяся пленка формвара достаточно тонка и прони­цаема для бета-частиц. Ленту срезов на бленде покрывают сверху тонким слоем углерода, а затем на обе стороны бленды наносят монослой эмульсии. Нанесение эмульсии с обеих сторон среза в два раза увеличивает чувствительность метода. Сравнение распре­деления серебра в соседних серийных УС делает полученные дан­ные еще более достоверными.
   Для ускорения нанесения эмульсии на срезы (на сеточках или блендах) рекомендуется одновременно использовать четыре петли. Петли с пленками могут быть развешены на крючках.
   Нанесение пленки эмульсии на сеточку удобно осуществлять, вложив особым образом вырезанный кусочек фильтровальной бу­маги между браншамй пинцета с закрепленной в нем ЭМ-блендой или сеточкой (рис. 29). Такой способ позволяет избежать загиба­ния краев эмульсионной пленки на сеточку. Сеточкой, которую располагают параллельно плоскости петли, быстро прикасаются к пленке, натянутой в петле. Эмульсия прилипает к одной стороне сеточки. Затем берут вторую петлю с пленкой эмульсии и таким же образом покрывают эмульсией другую сторону сеточки.
   После нанесения эмульсии сеточки или бленды закрепляют в разрезанной продольно полиэтиленовой трубочке (диаметр 3-5 мм), например в стержне от шариковой авторучки (рис. 30). В трубочке через каждые 4 мм делают поперечный разрез овальной формы. Внутрь трубочки помещают прочный пластмассовый стержень (металлический может влиять на процесс проявления). Вдвинув его до нужного поперечного разреза и согнув трубочку на этом уровне, можно раздвинуть края продольного разреза в этом месте и поместить (взять) в данный участок разреза сеточку. По­сле прекращения сгибания края продольного разреза, стремящие­ся в силу эластичности сомкнуться, достаточно прочно удержива­ют сеточки и бленды (от 3 до 10-12 штук). В таких трубочках очень удобно проводить экспонирование и проявление сразу не­скольких препаратов.
   Экспонирование удобно проводить в специальных пластмассо­вых контейнерах. На дно контейнера для экспонирования реко­мендуют насыпать прокаленный силикагель, в который, как в пе­сок, погружают трубки с блендами [68].
  

10.5.2. Экспонирование

  
   Обычно сеточки с УС экспонируют в темных боксах от 2-3 не­дель до нескольких месяцев. Длительное экспонирование может приводить к регрессии скрытого изображения. В результате хемографического эффекта при продолжительном экспонировании ис­чезает около 60 % активированных зерен серебра, что значительно снижает воспроизводимость результатов. Во избежание хемографического эффекта препараты следует хранить в темных коробках в атмосфере инертного газа в присутствии достаточного количест­ва влагопоглотителя, например силикагеля. Можно использовать откачиваемые герметические контейнеры. Для снижения фона на дно контейнера помещают фильтровальную бумагу, слегка смо­ченную раствором перекиси водорода.
  

0x01 graphic

   Рис. 29. Схема взятия сеточки (1) пинцетом (2) с вложенным между браншами кусочком фильтровальной бумаги (3).
  

0x01 graphic

   Рис. 30. Устройство для крепления нескольких сеточек (бленд) в процессе их проявления и закрепления. 1 - пластмассовый стержень; 2 - трубочка диаметром 3-5 мм; 3 - поперечные разрезы трубочки, 4 - продольные разрезы трубочки; 5 - пинцет; 6 - сеточки.
  

10.5.3. Проявление

   Чтобы скрытое изображение сделать видимым, его проявляют. При проявлении следует четко соблюдать температурный режим. Количество зерен серебра и их размеры возрастают с увеличением длительности проявления. Для уменьшения размеров зерен сереб­ра используют мелкозернистые проявители, однако они снижают чувствительность эмульсии. Так, при использовании проявителя, состоящего из 0.1 М раствора парафенилендиамина и 1 М раство­ра сульфата натрия, проявление в течение 1 мин дает мелкое круг­лое зерно, диаметр которого меньше непроявленного кристалла. Чувствительность при этом снижается.
   Для повышения чувствительности скрытого изображения пре­параты обрабатывают тиоцианатом золота, а затем растворами метола и аскорбиновой кислоты, что увеличивает количество про­явленных кристаллов. Чувствительность метода при этом увели­чивается в 4 раза, однако разрешающая способность падает.
   Чтобы увеличить точность локализации, а следовательно, и разрешения, часто прибегают к так называемому мелкозернисто­му проявлению. Мелкозернистого проявления с одновременным повышением чувствительности и разрешения можно добиться пу­тем обработки ионами золота [25, 68, 261].
   Фиксируют препараты в 20-25%-ном растворе тиосульфата на­трия обычно в течение 2-4 мин.
   Для эмульсии типа М наилучшим оказался метол-гидрохиноновый проявитель. Для эмульсии типа Пр более всего подходит пирогалловый проявитель. В случае проявления эмульсий типа М или Пр проявитель разводят водой в соотношении 1 : 10, время проявления 1.5-25 мин при t=20®С. Затем объекты переносят в 1%-ный раствор уксусной кислоты. После метол-гидрохинонового проявителя фиксацию проводят в кислом фиксаже, после пирогаллового - в 25%-ном растворе гипосульфита в течение 5 мин. Промывают в двух сменах воды (по 1 мин) (см. Приложение, 10.3) [25, 68, 261].
  

10.5.4. Контрастирование

  
   Контрастирование можно осуществлять с помощью УА в про­цессе дегидратации объектов. УС могут контрастироваться как до, так и после экспозиции. В первом случае срезы обычно окрашива­ются с помощью УА. После проявления пользуются ЦС. Лучшие результаты получаются, если контрастировать препараты, покры­тые эмульсией, после проявления. В этом случае рекомендуется удалить желатину 0.2%-ным раствором пепсина или трипсина, 0.05-0.2 М NaOH или теплой водой, а затем обработать УС с по­мощью УА (30 мин при t=32®С) и ЦС (10-12 мин при комнат­ной температуре). Однако, несмотря на усиление контраста, про­исходит смещение зерен серебра. Часто (при достаточно тонкой эмульсионной пленке) в процессе контрастирования удаляется же­латина. При этом контрастность объектов возрастает. Некоторые исследователи считают, что контрастирование УС после экспони­рования, как правило, дает худшие результаты, так как красители плохо проникают через слой фотоэмульсии (если ее не удалить) [25,68,261].
  

10.5.5. Оценка результатов

  
   Зерна проявленной эмульсии представляют собой неправиль­ной формы треки или точки в зависимости от применяемого спо­соба проявления. Результаты ЭМ-АРГ могут оцениваться количе­ственно (см. выше). Разработаны эффективные приемы статистического анализа препаратов, например селективный метод мечения везикул радиоактивным йодом. Кроме того, для подсчета уровня мечения разработаны программы компьютерного анализа [25, 68, 261].
  

10.6. МЕТОД АДСОРБЦИОННОЙ ЭМ-АРГ

  
   Метод безэмульсионной ЭМ-АРГ основан на восстановлении до металла положительных ионов растворов солей благородных металлов в отрицательном поле бета-излучения изотопа. Сущ­ность метода состоит в том, что при контакте растворов некоторых комплексных соединений тяжелых, чаще благородных металлов (обычно золотохлористоводородной кислоты) с УС, излучающим бета-частицы, выпадает осадок восстановленного металла [273]. Микрокристаллы металлов растут в точках излучения ультрафио­летового света, начиная с устойчивого состояния двух атомов, и образуют радиоавтографы размером до 25 нм за несколько секунд.
   Сеточки срезами вниз помещают на поверхность водного рас­твора хлорного золота для экспонирования, высушивают, быстро промывают, снова высушивают. Рекомендуется использовать се­точки, покрытые палладием или другим благородным металлом, без пленки-подложки.
   Наиболее существенными параметрами данного метода явля­ются температура и концентрация раствора золотохлористо­водородной кислоты, а также продолжительность экспозиции. Оптимальное сочетание этих параметров даст возможность получать более высокое разрешение, чем при обычном эмульсион­ном способе. Эффект взаимодействия бета-частиц и ионов золота будет усиливаться, если капля раствора тяжелого металла не растекается по поверхности, а остается круглой, упругой [52] (см. Приложе­ние, 10.4).
   Манипуляции с сеточками, следующие за экспонированием срезов, часто приводят к потере части кристаллов, что делает не­возможным количественный анализ, а ограничение метода в ис­пользовании контрастеров, разрушающих отложения металла в точках излучения, предопределяет и очень низкую контрастность изображения.
   Поэтому после второй сушки срезы напыляют в вакууме слоем углерода толщиной 3-5 нм, закрепляя тем самым микрокристал­лы золота и создавая над ними защитный гидрофобный слой. Это делает возможным использовать УА и ЦС для контрастирования УС [13].
  

10.7. СЭМ и ЭМ-АРГ

  
   Для изучения больших тканевых пластов в СЭМ необходимо, чтобы метод ЭМ-АРГ отвечал следующим требованиям: 1) препа­рат должен включать всю интересующую исследователя поверх­ность и обеспечивать возможность проведения топографических исследований и картирования распределения меченых клеток; 2) ядра клеток должны находиться на минимальном расстоянии от эмульсии, чтобы изображение не экранировалось и регистриро­валось как можно полнее; 3) количество клеток должно быть до­статочным для проведения статистически достоверных измерений.
   Мы рекомендуем следующую пропись [49]. Под наркозом жи­вотным внутрибрюшинно вводят Н-тимидин, разведенный на среде 199 (05 мл на 300 г массы). Очень удобно вводить экспери­ментальным животным раствор изотопа микропипеткой через не­большой разрез в нижнем отделе брюшной стенки. Через 1 ч про­изводят перфузионную фиксацию (см. гл. 2). После дофиксации объекты (например, сосуды) распластывают, обезвоживают, высу­шивают и приклеивают на чистые предметные стекла. Стекла по­гружают на несколько секунд в разведенную фотоэмульсию.
   Для анализа мелких полостных образований после фиксации их не вскрывают, а высушивают целиком, затем приклеивают к полоскам алюминиевой фольги и под стереомикроскопом с по­мощью свежих лезвий разрезают на две половинки. Полученные препараты погружают в эмульсию. Экспозицию проводят в тече­ние 20-26 сут. Проявление осуществляют амидоловым проявите­лем в течение 3 мин [28]. После обработки закрепителем и промы­вания в воде препараты высушивают на воздухе, покрывают тонким слоем золота и просматривают в СЭМ.
   Глава 11 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕКТИНОВ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
  

11.1. ЛЕКТИНЫ, ИХ СВОЙСТВА И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

  
   Пектины (Л) - это белковые поливалентные лиганды, которые специфически и обратимо связывают углеводы, не вызывая при этом их химического превращения. Лигандом мы будем называть любую молекулу, специфически связывающуюся с локализован­ной в объекте исследуемой молекулой, находящейся в образце не­зависимо от характера взаимодействия. Специфичность связыва­ния углеводов является важнейшим свойством Л и лежит в основе их функциональной классификации. Связывание углеводов Л -процесс легко обратимый. В его основе лежит образование моле­кулярных комплексов с белком, при этом специфичность взаимо­действия определяется структурой активного центра Л. Устойчи­вость комплексов обеспечивается нековалентными связями, глав­ным образом водородными и гидрофобными (силы Ван-дер-Ваальса) [39, 77].
   Комплекс углевода с Л может быть неспецифически диссоции­рован в кислой среде (рН 3-4), при связывании ионов кальция комплексонами, в присутствии ионов бората, при повышении температуры до 50®С. Специфическая диссоциация комплекса происходит в присутствии простых углеводов, взаимодействую­щих с активным центром Л и конкурентно вытесняющих первона­чально связанный лиганд. В отличии от антител связывание Л с гликопротеидами менее специфично, поэтому вызвать диссоциа­цию комплекса проще. Это эффективно используется в аффинной хроматографии гликопротеидов.
   В молекуле Л имеется несколько центров связывания углево­дов. В большинстве случаев Л тетравалентны. Поливалентность обусловливает агглютинацию клеток и частиц, а также преципита­цию гликопротеидов. Эта же особенность отличает Л от гликозидаз и переносчиков углеводов, которые имеют один активный центр в молекуле, т.е. моновалентны. Кроме того, в отличие от гликозидаз и других углеводсвязывающих ферментов Л не вызы­вают химического превращения субстрата [24, 39].
   Наиболее ценными для гистохимических целей являются Л, специфические к определенному углеводу (моноспецифические), которые, однако, встречаются довольно редко.
   Реакция связывания моносахаридов с Л зависит от принадлеж­ности моносахарида к D- или L-ряду и положения гидроксилов при третьем и четвертом атомах углерода пиранозного кольца. Исходя из этого все взаимодействующие с Л моносахариды разделены на четыре группы: 1) 3,4-ОН, цис-положение, L-ряд (L-фу-коза, L-галактоза); 2) 3,4-ОН, цис-положение, D-ряд (D-галактоза); 3) 3,4-ОН, транс-положение, D-ряд (D-глюкоза, D-манноза); 4) 3,4-ОН, транс-положение, L-ряд (L-глюкоза, L-ксилоза). В соответствии с группами углеводов классифицированы по угле­водной специфичности и Л [29, 39, 77].
   Очистку Л проводят методом аффинной хроматографии, ис­пользуя самые разнообразные сорбенты. В качестве элюента для вытеснения связанных на сорбентах Л используют растворы угле­водов; 0.1 М уксусную кислоту или кислые буферные растворы, блокирующие активность Л; растворы ЭДТА применяют для Сазависимых Л; в некоторых случаях можно использовать боратный буфер. Для правильного выбора аффинного сорбента необходимо знать углеводную специфичность Л. Аффинная хроматография используется и для очистки меченых производных этих белков [24, 25, 260].
  

11.2. ПУТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ

  
   Как структурные зонды Л позволяют определять не только хи­мическую природу доступных углеводных детерминант, но и их распределение по поверхности клеток. Располагая набором Л, спе­цифичных к углеводам, которые встречаются в животных гликопротеидах, можно установить наличие и распределение гликопро­теидов на поверхности клеток и в других тканевых структурах. Со­хранение нативности гликопротеидных структур не является обязательным - необходимо сохранение только углеводных детер­минант. Для исследования экранированных с поверхности угле­водных остатков используют метод умеренной модификации кле­точной поверхности ферментами. При этом следует учитывать, что связывание Л с мембранными рецепторами может происхо­дить не только по концевым углеводным детерминантам, но и по углеводным остаткам внутри олигосахаридной цепи (см. Прило­жение, 11).
   Кроме структуры Л позволяют исследовать функциональное состояние клеточной мембраны. Это обусловлено тем, что молеку­лы мембранных рецепторов-гликопротеидов перемещаются в пло­скости мембраны и этот процесс регулируется субмембранными сократительными цитоскелетными структурами [22]. При этом подходе обязательным условием является сохранение жизнеспо­собности клеток, обработанных Л.
   Важный аспект использования меченых Л - подсчет количест­ва Л-связывающих мест и плотности расположения рецепторов различных Л на поверхности клеток, изучение константы ассоциа­ции и диссоциации комплексов Л с рецептором. Л можно исполь­зовать для выявления гликоконъюгатов с помощью ТЭМ и СЭМ на сколах клеток и тканей [214].

11.3. МАРКЕРЫ ЛЕКТИНОВ

  
   Нативные Л невидимы в ЭМ, поэтому для визуализации мест связывания Л обычно используются конъюгаты Л с маркерами. Конъюгирование должно обеспечивать сохранение биологических свойств Л (сродство к углеродам и специфичность). Выбор марке­ра для Л зависит от метода последующего исследования (см. гл. 21). Связь метки с Л должна быть прочной (аффинное специ­фическое или ковалентное связывание), а неспецифическое связы­вание у них должно быть минимальным [24, 25, 260, 278].
  

11.4. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ

  
   Для получения пероксидазных конъюгатов предложено не­сколько методов (см. Приложение, 11.1.4). Для получения конъю­гатов ферритина с Л обычно используют ГА. Процедура обработки клеток Л, меченными ферритином, для ЭМ практически не отли­чается от таковой для конъюгатов Л с пероксидазой хрена (ПХ).
   Образование комплексов Л с коллоидным золотом (КЗ) обес­печивается силами электростатического взаимодействия и поверх­ностной адсорбции. Необходимым условием получения устойчи­вых коллоидных растворов золота является высокая степень чис­тоты посуды и реактивов.
   Для эффективного связывания КЗ с молекулами Л следует со­блюдать следующие условия: рН растворов КЗ и Л перед смешива­нием должны быть несколько выше изоэлектрической точки Л; ко­личество Л должно быть оптимальным для получения стабилизиру­ющего эффекта в смеси; раствор Л должен быть тщательно обессолен диализом против воды или гельфильтрацией. Изоэлектрическая точ­ка Л чечевицы соответствует значению рН 7.0; Л арахиса - 6.3; Л сои - 6.0; Л зародышей пшеницы - 8.7; Л бобовника анагиролистного -7.0; Л утесника европейского, тип I - 6.1; конканавалина А - 55; агг­лютинина клещевины - 8.0. После достижения соответствующего значения рН опытным путем определяют количество Л, необходи­мое для получения стабилизирующего эффекта [167].
   Применение Л, меченных КЗ, обеспечивает получение посто­янных невыцветающих препаратов и дает хорошо воспроизводи­мые результаты как в СМ, так и в ЭМ. Возможность мечения час­тицами КЗ различной величины (от 5 до 150 нм) позволяет прово­дить обработку препаратов одновременно двумя-тремя мечеными Л.
   Допустима комбинация пероксидазных и ферритиновых конъюга-тов с Л, меченными с помощью КЗ; возможно одновременное ис­пользование материала; обработанного лектин-пероксидазным конъюгатом, для исследования с помощью СМ и ЭМ. Электронно-плотные частицы при этом должны различаться по размерам.
   Для обнаружения Л, которые не могут стабилизировать золь КЗ, разработаны реакции связывания с глюкопротеидами, мечен­ными с помощью КЗ. При этом углеводные детерминанты ткане­вого гликопротеина взаимодействуют со специфичным для нее немеченным Л, который, в свою очередь, связывается со вторым реагентом (гликопротеином), меченным КЗ [24, 25, 260] (см. Приложение, 11.1.1 и 11.1.2).
  

11.5. ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ В ЭМ

  
   Использование Л, меченных ферментами ПХ либо электрон­но-плотными маркерами (ферритином, гемоцианином, КЗ и т.п.), предусматривает фиксацию клеток через различные промежутки времени и исследование таким образом динамики распределения метки. Индуцированная Л латеральная миграция комплексов лектиновых рецепторов с Л при последовательном образовании "кла­стеров", "пятен" и "шапочек" приводит к эндоцитозу меченых лектиновых рецепторов. Изучение скорости этого процесса позволяет строить так называемые гликограммы. Как правило, для их построения используют 3-4 временные точки [24, 25, 260].
  

11.5.1. Фиксация

  
   Требования к процедуре фиксации при использовании Л ока­зываются во многом близкими к таковым, предъявляемым к про­цедуре фиксации объектов для иммуно-ЭМ (см. гл. 2). При прове­дении реакций с Л можно использовать ГА и ЧО и заливать об­разцы в эпоксидные смолы. Для блокирования альдегидных групп после фиксации альдегидами используются обычные способы, на­пример обработка 0.2 М глицином на ФБФР.
  

11.5.2. Методы визуализации мишеней с помощью лектинов

  
   Эти методы принято классифицировать на прямые и непря­мые. В первом случае конъюгаты Л с маркером используют одно­моментно, во втором - клетки сначала взаимодействуют с Л, а за­тем маркер связывается с комплексом Л-рецептор (см. ниже, рис. 31) (см. Приложение, 11.2, 115, 11.6).

11.5.2.1. Прямые методы

  
   Примером может служить техника использования конъюгатов Л с ПХ и Л с ферритином для ТЕМ (см. Приложение, 11.1.3 и 11.1.4). Следует подчеркнуть важность температуры, при которой происходит мечение, поскольку t > 5®С способствует распаду конъюгатов, а если используются нефиксированные объекты, то обработка их с помощью Л индуцирует перераспределению рецеп­торов на клеточной поверхности.

11.5.2.2. Непрямые методы

  
   При непрямом двухстадийном методе срезы обрабатывают нативным Л, а затем зондом, конъюгированным с маркером и обла­дающим сродством к Л. К примеру, для конканавалина А зондом может служить ПХ, для выявления Л чечевицы, агглютинина кле­щевины и конканавалина А можно использовать конъюгированный с ПХ тиреоглобулин. При этом происходит связывание моле­кул зонда с молекулами Л, фиксированными на гликополимере. Для большинства лектинов рекомендуется использовать концент­рацию 25-100 мкг/мл (для конканавалина А 100-200 мкг/мл).
   Примером непрямых методов является мечение лектиновых рецепторов с помощью ПХ для ТЭМ и с помощью гемоцианина для СЭМ (см. Приложение, 11.5). ПХ является гликопротеином, поэтому ряд Л, в первую очередь манноспецифичные (конканава-лин А, лектин гороха и чечевицы) связываются с ней с образова­нием нерастворимых комплексов. Это свойство используется для локализации связанного с рецепторами Л. Гранулы гемоцианина имеют характерную форму и легко идентифицируются под СЭМ. После обезвоживания образцы также можно провести и для ТЭМ.
   КЗ вначале можно связать с овомукоидом (белок, специфиче­ски связывающийся с некоторыми Л, например с ВГА (WGA -wheat germ agglutinin), церулоплазмином, фетуином) или с ПХ (которая связывается с конканавалином А), и только потом присо­единить полученный комплекс к Л, связанному с мишенью объек­та. Ряд преимуществ для выявления многих Л непрямым методом имеет нативный гликопротеин - тиреоглобулин [24, 25, 260]. Можно использовать антитела и систему биотин-стрептавидин. В первом случае (рис. 31, А) объект обрабатывают вначале лектином, а затем маркером, конъюгированным со специфичным для лектина гликопротеином. Во втором случае (рис. 31, Б) объект обраба­тывают вначале лектином, а затем противолектиновым антителом, конъюгированным с маркером (см. Приложение, 11.6). В третьем случае (рис. 31, В) объект обрабатывают вначале лектином, конъ­югированным с биотином, а затем стрептавидином, конъюгиро­ванным с маркером. Непрямые методы имеют ряд преимуществ: во-первых, исключается необходимость получения конъюгатов Л с соответствующими маркерами; во-вторых, с помощью одного реагента (например, меченого тиреоглобулина) можно выявлять лог кализацию нескольких Л. Кроме того, непрямые методы предпо­лагают использование нативных Л, что гарантирует сохранность их активных центров и соответственно предотвращает возмож­ность неспецифического связывания с гликополимерами.

0x01 graphic

   Рис. 31. Схема непрямых двухступенчатых методов выявления углеводных детерминант клеточных мембран с помощью лектинов (Л). 1 - углеводные детерминанты; 2 - клеточные мембраны; J - Л; 4 - маркеры; 5 - гликопротеин, специфичный для Л; 6 - противолектиновсе антитело; 7 - биотин; 8 - стрептавидин.
  
   В целом непрямые методы проще. Однако у них есть и свои недостатки: 1) используемые реагенты связываются нековалентно, что может привести к их спонтанной потере в ходе препарирова­ния; 2) непрямой метод не подлежит количественному анализу, так как связывание маркера во многом определяется числом сво­бодных пектиновых валентностей; 3) необходим контроль на нали­чие эндогенной пероксидазной активности, так как определенные типы клеток могут реагировать с ДАБ и создавать ложное впечат­ление эндоцитоза Л; 4) многостадийность обработки препарата обусловливает потребность в контроле специфичности реакции на каждом этапе [24, 25, 77, 260].
  

11.5.3. Контроля

  
   Для контроля специфичности реакции препараты обрабатыва­ются мечеными Л при наличии в инкубационной среде 10 % соот­ветствующего углерода-ингибитора. Для Л чечевицы и конканава-лина А рекомендуется использовать альфа-О-маннозу, для Л клещевины и арахиса - лактозу, для Л сои - N-ацетилгалактозамин, для Л зародышей пшеницы - N-ацетилглюкозамин, хитобиозамин или овомукоид, для Л бобовника анагиролистного и утесника ев­ропейского - L-фукозу. Для контроля специфичности используют также предварительную обработку срезов с помощью немеченого Л, нативной ПХ, либо только ДАБ с пероксидазой, а также окис­ление углеводных детерминант 1%-ным раствором KJО4 (в тече­ние 30 мин).
   Следует отметить, что отрицательного контроля в присутствии ингибитора удается добиться не для всех Л. Это объясняется тем, что степень сродства Л к терминальным углеводным остаткам в составе гликополимеров может быть выше, нежели к молекулам простых углеводов. Хорошие результаты при проведении контролей получаются с конканавалином А и Л клещевины, худшие -при использовании Л зародышей пшеницы, арахиса, сои, бобов­ника анагиролистного. Окрашивание препаратов при обработке конъюгатами указанных Л с ПХ в присутствии ингибитора в большинстве случаев наблюдается вследствие того, что сродство Л к углеводам в молекуле гликополимеров намного выше, нежели к простым сахарам-ингибиторам. При этом подтверждением специ­фичности реакции обычно служит отрицательный результат при исключении Л из процесса обработки препарата либо при окисле­нии углеводных остатков гликополимеров 1%-ной HJO4.
  

11.5.4. Методы обработки объектов

  
   Мечение с помощью Л возможно в режиме как преэмбеддинга (до заключения объектов в смолу), так и постэмбеддинга (после за­ключения объектов в смолу) (подробнее см. гл. 12). В первом случае приготовленные криосрезы или изолированные клетки (например, культура ткани) инкубируют в растворах Л или их конъюгатов с ПХ. Увеличение проницаемости тканей объектов (пермеабилизация) до­стигается за счет обработки сапонином, добавляемым в инкубацион­ную среду. Концентрация Л в этом случае варьирует от 30 до 200 мкг/мл. Инкубация ведется при комнатной температуре в течение 3-6 ч. После обработки чистым Л обычно следует обработка ПХ.
   Криосрезы во время инкубации постоянно перемешиваются (см. Приложение, 11.4).
   Для проведения мечения с помощью лектинов в качестве раство­рителя для фиксатора и промывочного раствора нельзя использовать среду 199, содержащую глицин. Лучше пользоваться средой Хэнкса.
   После инкубации с Л объекты необходимо промыть и дофиксировать в ГА. Для визуализации реакции связывания криосрезы и об­разцы культуры инкубируют в растворе ДАБ, несколько раз промы­вают в бидистиллированной воде, обрабатывают препараты в феррицианиде осмия, а затем в ЧО, обезвоживают в этаноле и заливают в эпоксидные ЗС. УС и ПС исследуют без контрастирования.
   Процедура мечения УС с помощью Л и комплексов гликопротеин-КЗ в режиме постэмбеддинга сходна с таковой при иммуномечении. Потребность в контрастировании УС зависит от приме­няемого маркера и заливочных сред [24, 25, 77, 260] (см. Приложение, 11.3).
  

11.6. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ ЛЕКТИНОВ

  
   Синтезируемые гликопротеины можно использовать для ана­лиза эндогенных Л и гликоконъюгатов [260]. Они метятся с по­мощью ПХ, КЗ, ферритина и т.п. Синтезируемые гликопротеиды могут связываться с биотином или его производными. Маркиро­вание же биотина проводится с помощью авидина.
   Для определения эндогенных Л препарат обрабатывают синте­зированным гликопротеином, который может быть уже помечен с помощью маркера или метится им после присоединения к иссле­дуемому Л. Разработан способ мечения с использованием гликопротеинов, гликозильные части которых ковалентно прикреплены к белку-переносчику. Это позволяет проследить судьбу эндогенных Л.
   Определение мембранных гликоконъюгатов с использованием Л, меченных синтезированными гликопротеидами, можно прово­дить на изолированных клетках перед фиксацией с помощью ГА или после нее на гистосрезах, небольших тканевых блоках, УС тка­ней, залитых в гликольметакрилат [24, 25, 77, 260].
   Глава 12 ИММУНОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
  

12.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

   Реакция антиген-антитело высокоспецифична и используется для выявления антигенов (АГ) в тканях. Методы регистрации АГ в тканях с использованием антител (AT) объединены в раздел иммуногистохимии. В случае выявления АГ внутри клетки говорят о методах иммуноцитохимии. В зависимости от применяемого для детектирования реакции АГ-АТ прибора все эти методы могут быть разделены на методы иммуносветовой микроскопии (иммуно-СМ) и методы иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ЭМ). Иммуно-ЭМ более чувствительна и дает возможность выяв­лять антигенные детерминанты, присутствующие в низких кон­центрациях [184, 185]. Этот метод позволяет изучать распределение АГ как по поверхности, так и внутри клеток.
   Антигенные детерминанты - это уникальные части молекулы АГ, распознаваемые с помощью AT. Эпитопы - топографические структуры на поверхности белка, определяемые конформацией нативной молекулы и распознаваемые AT. Антигенная детерминанта - это скопление (кластер) эпитопов. Животное, иммунизирован­ное определенным иммуногеном, будет продуцировать поликло-нальную антисыворотку, которая содержит смесь популяций AT, или поликлональные AT.
   Поликлональная антисыворотка может быть очищена с по­мощью аффинного связывания на твердой фазе. Для этого чистый АГ адсорбируют на специальном сорбенте, упакованном в колонку. Антисыворотку пропускают через колонку, при этом AT реагиру­ют с АГ, адсорбируются и не удаляются при промывании колонки стандартными буферами. Высокоаффинные AT затем отделяют с помощью буферного раствора с низким (или высоким) рН. Пара­докс заключается в том, что AT с самой высокой аффинностью и авидностью наиболее трудно выделить из колонки. Поэтому в ре­зультате обычно получается относительно бедная популяция AT, сравнительно низкоаффинных по отношению к изучаемому АГ. Монорецепторные AT - это раствор поликлональных AT, исто­щенных на сорбенте против различных антигенных детерминан­тов и содержащих обычно AT только против одной антигенной де­терминанты.
   Моноклональные AT (МАТ) синтезируются одной иммунной клеткой-гибридомой. Эта клетка в культуре не только синтезирует один клон AT, но и способна бесконечно долго делиться. МАТ обычно высокоспецифичны. Однако они могут быть низкоаффинными и связываться только с одной антигенной детерминантой, которая может быть изменена в процессе препарирования .объек­тов.
   AT обычно присутствуют в глобулиновой фракции сыворотки крови и в совокупности образуют субфракцию иммуноглобулинов (Ig), в которую входят иммуноглобулины G, А, М, D, Е. Против одного АГ может образоваться несколько AT. Средний диаметр AT достигает 10 нм [54, 115, 279, 300, 310, 357].

12.2. МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНТИГЕНОВ

  
   В иммуно-ЭМ используют прямой и непрямой способы выяв­ления АГ (рис. 32).
      -- Прямой метод. AT против исследуемого АГ конъюгируют с электронно-плотной меткой. Объект обрабатывают этим конъюгатом, т.е. AT, конъюгированное с маркером, прямо связывается с АГ. В настоящее время этот метод используется сравнительно ре­дко (рис. 32, Г).
      -- Непрямой метод. Объект обрабатывают AT к искомому АГ (первыми AT - ПАТ), которые связываются с ним. Затем препа­рат с прикрепленными ПАТ обрабатывают вторыми AT (ВАТ), для которых ПАТ являются АГ. ВАТ в большинстве случаев явля­ются видоспецифичными и поликлональными. Их готовят путем введения в организм животного другого вида иммуноглобулинов того животного, от которого получены ПАТ. ВАТ обычно конъю­гируют с электронно-плотным маркером. Непрямой метод может быть "двухслойным" - используются два лиганда, "трехслойным" -используются три различных лиганда, и многослойным - исполь­зуются много различных лигандов.
   Двухслойный метод может быть реализован несколькими спо­собами: 1) на первом этапе с помощью ПАТ метят АГ, а затем с ПАТ связывают противоиммуноглобулиновое AT, конъюгирован­ное с маркером; 2) вначале АГ метят с помощью ПАТ, а затем с ПАТ связывают протеин А, конъюгированный с маркером; 3) пер­воначально АГ метят с помощью ПАТ, конъюгированного с биотином, а затем биотин связывают со (стрепт) авидином, конъюгированным с маркером; 4) на первом этапе АГ метят с помощью ПАТ, а затем к ПАТ присоединяется маркер, конъюгированный с изолированным специфическим АГ (подробнее см. ниже) (рис. 32, Я).
   Трехслойный метод осуществляют следующими способами (рис. 32, III): 1) вначале с АГ связывают ПАТ, затем ПАТ метят вторым противоиммуноглобулиновым AT, наконец, с ВАТ связы­вают маркер, конъюгированный с иммуноглобулином, в роли ко­торого может выступать и ПАТ; 2) на первом этапе с АГ связыва­ют ПАТ, конъюгированное с гаптеном, затем с гаптеном соединя­ют второе противогаптеновое AT, наконец, ВАТ метят с помощью маркера, конъюгированного с гаптеном; 3) вначале АГ метят с по­мощью ПАТ, затем с ПАТ связывают второе противоиммуноглобулиновое AT, наконец, с ВАТ соединяют маркер, обработанный противомаркерным AT; 4) первоначально с АГ связывают ПАТ, затем с ПАТ сшивают второе гибридное AT, обладающее авидностью как против иммуноглобулинов, так и против маркера, нако­нец, препарат обрабатывается маркером, который связывается с гибридным AT.

0x01 graphic

   Рис. 32. Методы иммуно-ЭМ.
   1 - ПАТ; 2 - Мр; 3 - АГ; 4 - второе противоиммуногпобучиновое АГ; 5 - протеин А; 6 - биотин; 7 - стрептавидин; 8 - иммуноглобулин; 9 - гаптен; 10 - противомаркерное AT; 11 - гибридное AT. I-IV - пояснения см. в тексте, с.173-175.
  
   Четырехслойный метод состоит в следующем (рис. 32, IV): вначале с АГ связывается ПАТ, затем с ним связывается противо-иммуноглобулиновое ВАТ, конъюгированное с биотином; послед­ний связывается со стрептавидином, а к стрептавидину присоеди­няется маркер, конъюгированный с биотином.
   Преимущества непрямого метода следующие: 1) антисыворот­ки к IgG обычно имеют высокий титр и авидность; 2) с каждой молекулой первого (специфического) AT могут связываться две меченые молекулы ВАТ, что увеличивает чувствительность метода (визуализация АГ становится более четкой); 3) экономичность - один препарат меченых ВАТ может быть использован для окра­шивания множества ПАТ, необходимо только, чтобы последние были получены у животных того вида, IgG которого использованы для получения ВАТ; 4) связывание маркера с ПАТ представляет определенные трудности и не всегда эффективно, кроме того, до­бавление маркера может снижать авидность ПАТ [115, 279, 300, 310, 357].
   Сущность метода иммуносорбентной ЭМ состоит в том, что подложку обрабатывают с помощью AT. Затем на подложку нано­сят суспензию исследуемых объектов. AT подложки связываются с АГ поверхностных структур этих объектов (вирусов, фагов и т.д.), как бы "вылавливая" их. После промывания и негативного контра­стирования структуру адсорбированных частиц изучают в ТЭМ. В качестве носителя AT можно использовать поверхность бактери­альной клетки. Вместо AT на сеточку можно вначале адсорбиро­вать протеин А, а затем AT. Это повышает чувствительность и эф­фективность метода [179].
  

12.2.1. Метод меченого антигена

  
   Частицы коллоидного золота (КЗ) покрывают белком - АГ, против которого получены AT. Ткань вначале обрабатывают из­бытком AT, а затем метят с помощью КЗ, конъюгированного с белком-АГ.
   При этом каждая молекула AT одним концом связывается с тканевым АГ, а другим - с АГ на поверхности частицы КЗ. Ре­акцию можно провести и в другой последовательности. КЗ свя­зывается с АГ, который затем взаимодействует с избытком AT. При этом часть антигенсвязывающих участков остается свобод­ной и может при иммуномечении взаимодействовать с тканевы­ми АГ. Однако в этом случае пропадает одно из достоинств не­прямых реакций - универсальность меченого реагента второго слоя.
  

12.2.2. Метод с протеином А или G

  
   Определенными штаммами Staphylococcus aureus (А) или стрептококков G (G148) продуцируются белки (протеины А и G соответственно), которые имеют свойство специфически связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов (главным образом IgG) нескольких видов животных. С протеином А и G можно конъюгировать несколько маркеров, но чаще всего используется КЗ. Протеин А или G можно связывать также с пероксидазой хрена (ПХ) и ферритином.
   Протеин А имеет очень высокую аффинность к человеческим IgGl, IgG2, IgG4 (но не к IgG3) и к мышиным IgG2a, высокую - к человеческим IgG2b, среднюю - к IgG3, слабую - к IgGl и к крысиным IgG2c, к остальным IgG аффинность отсутствует. Про­теин G очень высокоспецифичен ко всем 12 видам IgG за некото­рыми исключениями: так, он имеет высокую аффинность к мы­шиным IgG2b и IgG3; слабую - к крысиным IgGl и IgG2b; сред­нюю - к крысиным IgG2c [171].
   Метод иммуно-ЭМ с протеином А или G относится к двухсту­пенчатым. После первичного взаимодействия AT с АГ, присутст­вующим на поверхности УС, комплекс АГ-АТ визуализируется с помощью связывания протеина А или G с Fc-фрагментом молеку­лы первого иммуноглобулина. Другими словами, комплекс марке­ра с протеином А или G при иммуномечении выполняет функцию ВАТ (второй слой). Недостаток метода в том, что протеин А или G на УС выявляет все присутствующие иммуноглобулины. Поэтому стадию блокирования неспецифического связывания нормальной сывороткой приходится опускать. Другими словами, при исполь­зовании метода с протеином A(G) нельзя применять блокаторы, содержащие глобулины, так как может иметь место неспецифиче­ская псевдоиммунная реакция с протеином А.
   Протеин А или G бывает удобно использовать лишь в тех слу­чаях, когда не применяются ВАТ против иммуноглобулинов того вида животных, от которого получены ПАТ. Протеин А использу­ется в том же разведении, что и ВАТ.
   Хотя спонтанное взаимодействие между смолой, используе­мой для заливки, и комплексом маркера с протеином А или G в стандартных условиях минимально, неспецифическое связывание все же может наблюдаться, если проводить реакцию в нестандарт­ных условиях или не обрабатывать УС перед иммуномечением растворами в ФБФР инертных протеинов (05%-ного раствора яич­ного белка, 05%-ного бычьего сывороточного альбумина или 2%-ного обезжиренного порошка молока).
   Очень важно, чтобы комплекс протеина А или G с КЗ находил­ся в растворе при соответствующем разведении. Если для приго­товления КЗ пользовались таниновой кислотой (ТК), то к буфер­ному базовому раствору, применяемому для разведения, необхо­димо добавлять для предупреждения неспецифического связывания Тритон Х-100 или Твин-20 до концентрации 0.05-0.1 % [307].
   Метод с протеином А или G имеет ряд преимуществ перед ме­тодами с использованием противовидовых AT: 1) протеин А или G связывается с IgG многих видов животных (нет необходимости подбирать антитела против ПАТ); 2) он высокорезистентен к дена­турирующим воздействиям; 3) способ конъюгирования протеина А или G с КЗ отличается простотой, является прямым и дает вы­сокоактивный мономерный комплекс, который сохраняет свои свойства в течение года; 4) специфические AT того же самого жи­вотного можно использовать для двойного мечения; 5) комплекс КЗ с протеином А или G имеет очень низкую степень неспецифи­ческого связывания с заливочной средой УС; 6) один и тот же рас­твор протеина А или G может одновременно использоваться как для СМ, так и для ЭМ; 7) возможно мечение нескольких АГ на од­ном срезе с помощью КЗ с частицами разного размера. Если при­меняется протеин А или G для локализации двух АГ, то надо обя­зательно использовать обе стороны УС (без подложки).
   Популярность способа объясняется его относительной просто­той, а также возможностью обнаружения разных иммуноглобули­нов с помощью одного маркера и одновременного окрашивания нескольких АГ одной клетки протеином А или G, связанным с ча­стицами КЗ разного размера. Метод с протеином А или G среди других способов иммуномечения дает наибольшее разрешение, поскольку размер его молекулы равен 5 нм, а длина молекулы AT 8 нм. Если диаметр частиц КЗ равен 15 нм, то на поверхности каждой из них укладывается по 60 молекул протеина А.
   К недостаткам метода можно отнести слабое реагирование про­теина А или G с определенными мышиными и крысиными МАТ; иногда для усиления реакции после воздействия ПАТ применяют промежуточную обработку УС высокоочищенными кроличьими противомышиными или противокрысиными IgG.
   Перед иммуномечением с помощью комплекса КЗ с протеи­ном А или G надо проверить, нет ли на УС компонентов, которые связываются с КЗ. Для этого УС обрабатывают раствором КЗ, ста­билизированным полиэтиленгликолем или Твином-20 при тех же значениях рН и ионной силы раствора, которые будут использова­ны при иммуномечении. Если КЗ неспецифически связывается УС, то нужно подобрать белок с высокой аффинностью к КЗ и сла­бой - к тканевым компонентам и включить его в состав инкуба­ционной среды.
   Для уменьшения неспецифического связывания комплекса КЗ с протеином А или G применяют один из следующих способов: 1) блокирование непрореагировавших альдегидных групп с по­мощью аминирования (инкубация объектов в 0.05 М растворах NH4CI, лизина или глицина в буфере в течение 45-60 мин, t=4®С); 2) блокирование мест неспецифического связывания путем преинкубации с инертными белками; 3) использование оптимальных концентраций комплекса КЗ с протеином А или G [308].
   Кроме того, фоновое окрашивание уменьшается, во-первых, с помощью преинкубации УС в растворе альбумина или Твина-20, во-вторых, путем использования акрилатов вместо эпоксидных смол, в-третьих, вследствие применения метода плавания сеточки на капле вместо погружения в нее. Комплекс КЗ с протеином А или G перед каждым использованием необходимо центрифугиро­вать при малой скорости центрифуги. Этот комплекс стабилен не­сколько месяцев, если его готовить в стерильных условиях и хра­нить при t=4®С (замораживать не рекомендуется). В тех случа­ях, когда необходимо замораживание, комплекс должен быть разведен 50%-ным глицерином. Перед лиофилизацией необходим диализ против 0.005 М NH4HCO3.
   Мечение протеином А или G осуществляют при физиологиче­ских значениях рН. Протеин G с поликлональными AT лучше все­го связывается при рН 7.2-7.4, с моноклональными мышиными AT (IgGl, IgG2) - при рН 5.0. Все последующие промывания так­же лучше осуществлять при рН 5.0. Протеин А или G обычно ис­пользуют в концентрации 20 мкг/мл. Инкубация должна прово­дится в хорошо увлажненной атмосфере, особенно если она зани­мает длительное время [54, 115, 279, 300, 310, 357].
  

12.2.3. Метод санидином (стрептавидином)

   Авидин - высокомолекулярный гликопротеин, выделяемый из яичного белка и имеющий очень высокое сродство (четыре уча­стка связывания) к биотину - низкомолекулярному витамину, присутствующему в яичном желтке. Связывание биотина с авидином необратимо, что делает образующиеся комплексы очень устойчивыми к промыванию и сходным процедурам. Биотин ко-валентно соединяется с белковым лигандом без значительного снижения его способности к связыванию и специфичности. При этом сам биотин сохраняет значительную степень сродства к авидину, конъюгированному с маркером. С авидином может быть конъюгировано множество маркеров: КЗ, ферритин, гемоцианин, ферменты и др. Комплекс авидина с КЗ является единым универ­сальным лигандом не только для AT, но и для многих биотинилированных лектинов, гормонов, токсинов и т.п.
   Авидин из яичного белка способен образовывать комплексы с КЗ при рН 8.5. Комплекс стабилен и может долго храниться в хо­лодильнике без нарушения способности к связыванию. Взаимо­действие авидина с биотином не нарушается при альдегидной фиксации. Следовательно, можно фиксировать ткань после взаи­модействия биотинилированного лиганда с рецептором, что по­зволяет избежать потери молекул лиганда или их перемещение из-за последующих гистохимических процедур.
   Для того чтобы избежать нежелательного связывания авидина с биотином, присутствующим в таких тканях, как печень и почки, срезы обрабатывают свободным авидином, который затем насы­щают биотином. На каждой молекуле биотина имеется только один авидинсвязывающий участок и, следовательно, связывание биотин-авидинового комплекса, помеченного маркером, с тканью исключается.
   Биотин можно присоединить к молекуле AT или к маркеру, например ПХ. Авидин также можно пометить ПХ. В этом случае реакция иммуномечения будет иметь следующий вид. Первый "слой" - кроличьи AT к исследуемому АГ, второй "слой" - биотинилированные козьи AT к кроличьим IgG, третий "слой" - комп­лекс авидина с биотинилированной ПХ или КЗ. Компоненты не­обходимо смешивать в таком соотношении, чтобы часть биотин-связывающих участков молекулы авидина была не занята биотинилированным маркером и могла бы взаимодействовать с биотином, присоединенным к AT второго "слоя". Затем ПХ обыч­но проявляют диаминобензидином или другим методом. Очевид­но, что в данном случае к каждой точке, содержащей АГ, будет присоединено довольно много молекул маркера. Разведенный ком­плекс авидина с КЗ перед использованием следует отцентрифугировать.
   Стрептавидин, который получается из бактерии Streptomyces avidim, имеет физико-химические свойства, сходные с таковыми авидина из белка куриного яйца. Оба вещества являются тетрамерами и связываются с коферментом биотином с чрезвычайно вы­сокой аффинностью. Стрептавидин не гликозилирован и имеет нейтральную изоэлектрическую точку, что делает его чрезвычайно удобным для детектирования биотинилированных лигандов.
   При использовании этого метода возможны различные вари­анты проведения иммуномечения - можно либо биотинилировать ПАТ и ВАТ, либо к ПАТ или ВАТ присоединить стрептави­дин, связанный с КЗ (либо вначале присоединить стрептавидин, а затем - связанное с биотином КЗ). Возможна процедура мечения в три ступени: 1) ПАТ; 2) биотинилированные антивидовые ВАТ; 3).меченый стрептавидин. Последний может маркироваться с по­мощью ПХ или КЗ при использовании стрептавидина в качестве мостика по такой схеме: первая ступень - ПАТ, вторая - биоти­нилированные антивидовые ВАТ, третья - стрептавидин, четвер­тая - биотинилированный фермент или КЗ. Для этой же цели мож­но применять преформированные комплексы: первая ступень - ПАТ, вторая - биотинилированные антивидовые ВАТ, третья - биотинилированный фермент, конъюгированный со стрептавидином. Очень часто биотин конъюгируется и с AT, и с молекулой фермента, а авидин используется в качестве мостика.
   Биотин-стрептавидиновый метод обладает высокой специфич­ностью и аффинностью. Кроме биотинилированных целых AT можно использовать биотинилированные фрагменты AT (F(ab)2), которые получают из молекул AT с помощью переваривания пеп­сином, для того чтобы получить АГ-связывающие сайты имму-ноглобулиновых молекул без Fc-фрагмента [54, 115, 279, 300, 310].
   Молекула авидина обладает большим зарядом и из-за высокой аффинности к биотину она связывается с любым ферментом, роль кофактора у которого выполняет биотин. Кроме того, авидин не­специфически связывается с ДНК (стрептавидин имеет к ДНК меньшую аффинность), гранулами тучных клеток и компонента­ми соединительной ткани [116]. Для предупреждения этого ис­пользуют специальные наборы. Вначале ткани обрабатывают авидином, который связывается с эндогенным биотином, а затем би­отином, блокирующим реакционные центры авидина. Поскольку молекула биотина содержит только одно место связывания авиди­на, дальнейшей обработки не требуется. Для блокирования неспе­цифического связывания с гранулами тучных клеток и компонен­тами соединительной ткани раствор авидина разводят бикарбонатным буфером (рН 10), содержащим высокую концентрацию соли (5 М NaCl) [115, 116].
  

12.2.4. Метод с комплексом пероксидаза-антипероксидаза (ПАП)

  
   Комплекс пероксидаза-антипероксидаза обычно используется в качестве третьей ступени иммуноцитохимической реакции: он реагирует с ВАТ, свободные реакционноспособные группы кото­рых связываются с имеющимися в его составе IgG. Суть метода в том, что вначале ПХ связывают с AT против нее, при этом обра­зуется ПАП-комплекс. К препарату, обработанному последовательно ПАТ и ВАТ, добавляют ПАП-комплекс. Так как AT против ПХ имеют другие антигенные детерминанты по сравнению с ПАТ, то ВАТ связываются как с ПАТ, так и с AT против ПХ. Другими сло­вами, третий "слой" образует очень стабильный комплекс, состоя­щий, как правило, из кроличьих AT к пероксидазе, связанных с ПХ (ПАП-комплекс). Он служит в качестве АГ для немеченых противокроличьих ВАТ (обычно козьих). В качестве ПАТ также применяют кроличьи IgG. Козьи противокроличьи ВАТ должны быть в избытке по отношению к AT первого "слоя", чтобы второй антиген-связывающий участок ВАТ мог взаимодействовать с ПАП-комплексом; последний используется в разведении 1 : 100 или 1:1000. Время инкубации в рабочем растворе ПАП чаще всего составляет 3 мин.
   Метод иммуно-ЭМ с ПАП имеет ряд преимуществ: 1) ПАП - комплекс состоит из трех молекул фермента и двух молекул AT, поэтому к одному АГ присоединяются три молекулы фермента, следовательно, образуется в 3 раза больше продукта реакции, чем при использовании обычного метода с ПХ; 2) чувствительность метода повышается в 100-1000 раз по сравнению с пероксидазным, так как молекулы ПХ связаны с AT не химически, а как АГ с AT, что не сопровождается потерей ферментной активности; 3) можно использовать более высокие разведения ПАТ, что пони­жает неспецифическое окрашивание; 4) метод обеспечивает очень высокую специфичность реакции, так как ПАП-комплекс пред­ставляет собой высокоочищенный препарат и взаимодействует только с AT к кроличьим иммуноглобулинам второго "слоя"; 5) ПАП-комплекс не реагирует с неспецифически связавшимися AT, поскольку они не являются анти-IgG. Для того чтобы ПАП-комплекс не связывался непосредственно с тканью (фоновое окра­шивание), достаточно провести блокирование объектов с по­мощью нормальной сыворотки.
   Недостатки ПАП-метода следующие: 1) требуются дополни­тельные реагенты; 2) процедура окрашивания удлиняется. Исполь­зование ПАП-комплекса для преэмбеддинга не очень эффективно, поскольку и IgG и ПАП-комплекс имеют довольно большие раз­меры (молекулярная масса 156 000 и 420 000 соответственно) и плохо проникают через клеточные мембраны. Преэмбеддинг обычно применяется только в том случае, когда не дает результа­тов метод постэмбеддинга [106].
   В последние годы альтернативным ПАП-комплексу является авидин-биотиновый комплекс с пероксидазой (АБПХ). После свя­зывания с ПАТ объект обрабатывают ВАТ, конъюгированными с биотином, а затем комплексом АБПХ, авидин которого связыва­ется с биотином ВАТ. Высокая чувствительность метода обеспечи­вается большим числом молекул ПХ, конъюгированных с авидином. Комплекс АБПХ имеет меньшие размеры (молекулярная масса 188 000), чем ПАП, и больше пригоден для преэмбеддинга [106].
   Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза, осо­бенно для исследования плохо стабилизируемых АГ, увеличивает воспроизводимость результатов и снижает уровень неспецифиче­ского окрашивания [115, 116].
  

12.2.5. Метод динитрофенол-гаптенового сандвича

  
   Вначале проводится реакция иммуноглобулина с имидоэфирным производным динитрофенола (DNP-N-IE) - образуется гаптен. Обработанные таким образом AT сохраняют свою авидность к тканевым АГ. В качестве ВАТ используют IgM против динитрофе­ноля, которые связываются с полученным гаптеном с высокой эффективностью. Третьим "слоем" является меченная динитрофенолом ПХ (или КЗ) [115, 310].
  

12.3. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ

  
   AT должны обладать, во-первых, высоким сродством к АГ, во-вторых, хорошей авидностью (липкостью, или силой связывания с АГ), в-третьих, достаточным титром (концентрацией AT). В случае использования МАТ фактор разведения не столь важен, так как в принципе можно получить неограниченное количество AT и практически без побочных реакций. AT, используемые для лока­лизации любого гликопротеина, должны быть проверены на их реакцию с углеводными эпитопами для предупреждения перекрестной реакции с гликопротеинами, содержащими сходные группы. Созданы так называемые гибридные AT, содержащие Fab-фрагменты против двух разных эпитопов (см. рис. 32).
   В настоящее время значительное число ПАТ продается фирма­ми. Однако они дороги и поставляются в небольших количествах. Цены на ВАТ значительно ниже. Для каждого нового объекта про­водится определение оптимального уровня разведения. Разведение ПАТ, как правило, невелико (от 1: 2 до 1: 25) [240]. Для разведе­ния ПАТ используют физиологический раствор, забуференный ФБ или Трис-буфером (рН 7.2) и содержащий 0.1 % бычьего сы­вороточного альбумина (БСА) и 0.01 % азида натрия. Обработка препаратов с помощью ВАТ обычно продолжается 1- 2 ч при ком­натной температуре или 12 ч при t=4®С [54, 279, 300]. Раствор ПАТ, разведенный с помощью раствора, блокирующего неспеци­фическое окрашивание, носит название "рабочего раствора".
   Следует тщательно следить за возможностью бактериальной контаминации инкубационных сред и других рабочих растворов: раствора, блокирующего неспецифическое связывание (РБНС), и раствора для разведения AT, особенно если реакция проводится при комнатной температуре. Поэтому эти растворы рекомендуется использовать свежеприготовленными или фильтровать через миллипоровый фильтр [116].
  

12.4. МАРКЕРЫ

  
   Иммуноглобулины электронно-прозрачны и поэтому для их выявления используют маркеры (подробнее см. гл. 22). Это могут быть ферменты (ПХ, кислая и щелочная фосфатаза, глюкозо-оксидаза), неферментные макромолекулы и микроорганизмы (гемо-цианин, вирусы, цитохром С), дериваты связанных с гемом микропероксидаз, обладающие способностью расщеплять перекись во­дорода, псевдопероксидазы, металлопротеины или комплексы полисахарида с металлом (ферритин, железодекстран, железоман­нан), коллоидные частицы металлов (золота или других благород­ных металлов), металлы (уран, комплекс урана с осмием, железо, ртуть), полимеры (полиэтиленимин, образующий комплексы с золотом и серебром в виде частиц диаметром 10 нм, полистирен, полиметакрилаты, кополимеры с железом и кремниевые микро­сферы) и др.
   Применимость различных маркеров зависит от конкретных условий проведения реакции. Так, хотя КЗ лучше выявляется в ЭМ, однако конъюгат AT с ферритином более чувствителен к АГ. Поэтому в том случае, когда важнее иметь большую чувствительность, лучше использовать ферритиновый маркер. Если окраши­вание УС тщательно контролируется, то частицы ферритина могут быть легко распознаны.
   При конъюгации маркера с AT свойства последних (в том чис­ле авидность) могут меняться. Конъюгация маркера с ПАТ (см. гл. 21) обеспечивает минимальное отклонение локализации части­цы маркера от местоположения АГ. Двух и более этапные реакции ведут к увеличению этого отклонения. В процессе конъюгирования с маркером не все молекулы лиганда связываются с меткой. Эф­фективностью мечения называется доля молекул АГ, меченная ча­стицами маркера.
   Эффективность мечения зависит от следующих причин: 1) специфичности AT и маркера; 2) доступности антигенных де­терминант; 3) чувствительности АГ к химической фиксации; 4) степени диссоциации маркера во время мечения; 5) стехиомет­рии процесса мечения; 6) способа препарирования; 7) способа ме­чения [115, 279, 300, 310]. Конъюгирование маркера с AT может быть одно- и двухступенчатым [103].
   На процесс иммуномечения существенное влияние оказывает способность AT и маркера проникать внутрь УС, а фиксаторов воздействовать на сохранность АГ. Для улучшения доступа AT и маркера к внутриклеточным структурам используется метод раскалывания образцов, защищенных криопротектором, с иммуноме­чением после оттаивания и удаления криопротектора. Для оценки латерального распределения антигенных детерминант в плоскости мембраны используют метод иммуно-ЭМ в сочетании с замора­живанием-травлением [115, 310].
  

12.5. МЕТОДЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ В ИММУНО-ЭМ

  
   В зависимости от того, когда проводится реакция АГ с AT, ме­тоды иммуно-ЭМ могут быть разделены на три группы: 1) безза­ливочные (использование крио-УС), 2) предзаливочные (преэм-беддинг), 3) постзаливочные (постэмбеддинг).
  
  

12.5.1. Крио-УС в иммуно-ЭМ

  
   Использование крио-УС из предварительно фиксированной или нефиксированной ткани позволяет проводить иммуномечение тканевых АГ с помощью AT без обработки объектов дегидратантом и без заключения их в заливочные среды. Метод используется для локализации лабильных АГ. Обычно иммуномечение крио-УС проводят после их оттаивания при комнатной температуре. Этот метод обеспечивает лучшую доступность АГ и позволяет быстро получить результат иммунной реакции. Сохранность антигенов на крио-УС гораздо выше, чем при других методах, поскольку значи­тельно сокращено число этапов препарирования. В большинстве случаев перед криоультратомией объекты фиксируют. Для улуч­шения проникновения AT в качестве маркера рекомендуется при­менять частицы КЗ сверхмалого размера (1 нм) с последующим серебрением (см. ниже) [102].
  

12.5.1.1. Иммуномечение

  
   Иммуномечение крио-УС осуществляется различными спосо­бами, но чаще всего непрямым двухступенчатым, в том числе и с протеином А или G. В случае альдегидной фиксации объектов для инактивации альдегидных групп крио-УС дважды обрабатывают раствором глицина (см. Приложение, 12.1).
   Перенос срезов лучше осуществлять с помощью петли диамет­ром 3-4 мм. После этого сеточки готовы для окрашивания ПАТ: на парафильм или специальный планшет наносят по капле рас­твора AT (около 10 мкл) для каждой сеточки, затем с помощью противокапиллярного пинцета (рис. 33) каждую сеточку из буфера переносят на эту каплю. Для промывания надо сделать по шесть больших капель буфера для каждой сеточки и перенести сеточку сначала в первую каплю буфера, а затем промывать в течение по крайней мере 1 мин в каждой капле. Обработку раствором ВАТ и последующее промывание осуществляют также. После иммуномечения сеточки также проводят через шесть крупных капель 0.1 М ФБ для удаления глицина и фиксируют в 2%-ном ГА в течение 5 мин (эта ступень может быть исключена, если ГА уже использо­вался, но желательна, если применялся один только ФА). Затем се­точки промывают в шести крупных каплях воды для подготовки к контрастированию (см. Приложение, 12.2 и 12.3). Для уменьшения фона вместо желатины можно использовать бычью сыворотку новорожденных телят. Эта сыворотка содержит только следы IgG, которые не связывают протеин А. Она дает также минимум фона после оттаивания крио-УС, особенно когда применяют очень аф­финные и авидные (клейкие) белки, такие как лектины и МАТ. Сеточки перед реакцией с AT обрабатывают в течение 10 мин с помощью 10%-ного раствора этой сыворотки на ФБФР. Все рас­творы AT и комплекса КЗ с протеином А или G рекомендуется го­товить на этой смеси. Методы контрастирования крио-УС после иммуномечения аналогичны таковым при обычном контрастиро­вании (см. гл. 8) [115, 310].

0x01 graphic

   Рис. 33. Оротивокапиллярный пинцет (1) с зажатой в нем сеточкой (2).
  

12.5.2. Преэмбедцинг

  
   Метод преэмбеддинга предполагает, что иммунологическая ре­акция проводится перед легкой фиксацией или после нее, но до за­ключения в заливочную среду (ЗС) и получения УС. Эта техника необходима для исследования АГ, вымывающихся или денатури­рующихся в процессе обработки в дегидратанте, пропитки ЗС и их полимеризации. Метод преэмбеддинга включает фиксацию, изго­товление микросрезов (вибратомных или, реже, криостатных) и(или) пермеабилизацию объектов (увеличение проницаемости клеток и тканей), иммуномечение, исследование объектов в СМ, осмирование, заливку в ЗС, изготовление УС, исследование в ТЭМ.
   При изучении органов реакция с AT в режиме преэмбеддинга чаще всего производится на микросрезах тканей (как фиксирован­ных, так и нефиксированных). Это улучшает соотношение поверх­ность/объем. Микросрезы толщиной 20-80 мкм готовят перед проведением иммуномечения с помощью вибратома. Можно ис­пользовать также криостатные срезы. После иммуномечения объ­ект обычно дофиксируется, осмируется и готовится для ТЭМ. Ос­мирование существенно увеличивает контрастность препаратов (см. Приложение, 12.4).
   Преэмбедцинг удобен для мечения поверхности живых клеток, клеточных фракций и изолированных клеток, когда метка легко достигает расположенного на их поверхности АГ, однако мечение внутриклеточных компартментов часто затруднено. Преимущест­вом преэмбеддинга является лучшая сохранность АГ тканевых и клеточных структур. Это обусловлено тем, что АГ не контактируют с растворителями до иммуномечения. Кроме того, эта техника по­зволяет на микросрезах при помощи СМ до заливки объектов най­ти и отметить нужный участок.
   Однако у данного метода есть ряд недостатков: 1) не всегда удовлетворительная сохранность ультраструктуры тканей, что су­щественно затрудняет интерпретацию изображений; 2) иммуно­мечение необходимо проводить почти сразу же после взятия объектов; 3) требуются значительные по объему опытный и контроль­ный объекты, поскольку для выявления каждой антигенной детер­минанты нужен как минимум один микросрез; 4) AT плохо про­никают в ткани, что создает добавочные проблемы при препариро­вании и делает необходимым повышение проницаемости объек­тов; 5) в процессе обработки тратится большое количество дорогостоящих AT; 6) затруднено проведение двойного иммуно-мечения [54, 115, 279, 300, 310].
  

12.5.2.1. Фиксация и хранение объектов

  
   Особенности фиксации образцов для иммуно-ЭМ изложены в гл. 2. Подчеркнем, что тип применяемого фиксатора зависит от резистентности антигенных детерминант. В последующем объекты могут сохраняться либо в буфере, либо в слабом растворе ФА при t=4®С. В первом случае, если фиксированный объект хранится при комнатной температуре, в буфер необходимо добавлять 0.2 % азида натрия.
  

12.5.2.2. Пермеабилизация

  
   Существенным недостатком метода преэмбеддинга является незначительная глубина проникновения в ткани AT. Увеличение концентрации и длительности инкубации не дают существенного улучшения результатов. Если не проводить специальной обработки, то из-за больших размеров AT и комплексов AT с маркером реакции AT с АГ в основном ограничиваются поверхностными слоями объектов. Использование AT, меченных КЗ (частицы раз­мером 1 нм), иногда позволяет без помощи детергентов исследо­вать более глубокие слои объекта.
   При работе с предварительно фиксированными криостатными микросрезами, препаратами органных или клеточных культур, мазками или целыми кусочками тканей необходимо разрушить липидные компоненты мембраны, чтобы обеспечить их проницаемость для AT.
   С целью повышения доступности тканевых структур для AT объекты подвергаются обработке, увеличивающей проницаемость клеток и тканей - пермеабилизации. Для этого используют, во-первых, вещества, разрушающие барьерные свойства биологиче­ских мембран, и прежде всего детергенты (например, добавление 0.02-0.1 % сапонина в промывающий раствор после фиксации, 10-20-минутная обработка 0.04-1.0%-ным Тритоном Х-100 на ФБФР после фиксации или его добавление в тех же концентрациях не­посредственно к фиксатору), во-вторых, обработку органическими растворителями для удаления мембранных липидов (например, обработка фиксированных объектов этанолом при низких, порядка 5-20 %, его концентрациях в течение 2-10 мин). В ряде случаев используют замораживание-оттаивание (например, быстрое замо­раживание и оттаивание объектов, обработанных криопротекто-ром). Проникновение крупных частиц КЗ в ткани после воздейст­вия сапонина затруднено. В этом случае рекомендуется использо­вать более мощные детергенты, в том числе и до фиксации объек­тов.
   Однако применение неионных детергентов, таких как НП40 (NP40), Тритон Х-100 (и даже сапонинов), разрушает мембран­ные структуры клеток и вызывает значительное экстрагирование клеточного содержимого, а также вымывание и перераспределение самих АГ. Использование Тритона Х-100 в смеси с фиксирующи­ми жидкостями в .значительной степени нарушает ультраструктуру клеток и тканей, его воздействие после фиксации повреждает тка­ни в меньшей степени, но и достигаемое повышение проницаемо­сти тканей для AT, особенно конъюгированных с маркером, будет существенно снижено. Сапонин и метанол, если их применять по­сле фиксации, обеспечивают наибольшую сохранность субмикро­скопической морфологии объектов, но также пермеабилизируют их в небольшой степени [115].
  

12.5.2.3. Иммуномечение и заливка

  
   После пермеабилизации объекты (клетки, кусочки тканей или микросрезы) обрабатывают раствором AT в соответствующем раз­ведении. Для преэмбеддинга обычно требуются более высокие концентрации AT. Обработка объекта раствором ПАТ (обычно в концентрации 0.5 мкг/мл) продолжается несколько часов (до 17 ч). В качестве маркера обычно используют ферменты. КЗ дает ме­нее удачные результаты. После иммуномечения образцы фиксиру­ют с помощью ГА и ЧО, обезвоживают и заключают в ЗС (как правило, в эпоксидную смолу). При этом применяется обычная процедура обезвоживания и заливки. Вибратомные срезы лучше вначале расправить и приготовить препараты для СМ, из которых впоследствии и получают УС [300].
  

12.5.3. Постэмбеддинг

  
   Постэмбеддинг - это группа методов иммуно-ЭМ, при кото­рых процедура иммуномечения проводится на УС, что позволяет применять очень маленькие объемы растворов AT. Данное семей­ство методов можно разделить на две группы в зависимости от то­го, какой тип смол используется в качестве ЗС: 1) гидрофобные смолы (эпоксидные и полиэфирные смолы, Ловикрилы НМ20 и НМ23 и др.); 2) гидрофильные акрилаты [306] (см. Приложение, 12.5). Следует иметь в виду, что при использовании эпоксидных смол метод постэмбеддинга имеет небольшую чувствительность и эффективность. В качестве маркеров чаще всего применяются КЗ и ПАП-комплекс.
   Схема препарирования включает фиксацию, обезвоживание, заключение в ЗС и изготовление УС, которые и подвергаются иммуномечению. УС, полученные из заключенных в гидрофобные смолы объектов, перед иммуномечением нуждаются в травлении. В этом случае желательно использовать золотые или никелевые сеточки с углеродной подложкой [115, 126, 300, 310].
  

12.5.3.1. Использование гидрофобных ЗС

  
   В случае заключения объектов в гидрофобные смолы необхо­дима процедура травления УС, улучшающая доступность АГ для AT. Точное время травления определяют эмпирически. Следует учитывать, что сама процедура травления способна повреждать АГ. Сокращение времени травления приводит к снижению доступно­сти тканевых АГ, а его удлинение ведет к повреждению УС и уве­личению неспецифического связывания. Залитые блоки могут храниться много лет [189].
   Эпоксидные УС перед иммуномечением с целью демаскировки АГ обрабатывают 5-10%-ным раствором перекиси водорода в те­чение 8-10 мин, однако перекись водорода не должна быть старой (срок хранения не более 2 мес). Ее рекомендуют разводить ех tempore, лучше в бидистиллированной воде. Для травления можно применять раствор этоксида натрия (см. Приложение, 123.3) в разведении 1 : 10 или больше (время обработки 1-3 мин). Если объекты фиксировались в ЧО, то для демаскировки АГ лучше ис­пользовать насыщенный (0.1%-ный) раствор метаперйодата на­трия (время обработки 3-10 мин). Эта процедура предпочтитель­нее, если в качестве маркера используется коллоидное золото [115, 116, 240]. После травления УС промывают и обрабатывают рас­твором ПАТ. Сохранность ультраструктуры при такой обработке обычно удовлетворительная. После травления и иммуномечения УС могут быть вновь заключены в смолу [87].
   Для установления СМ-ЭМ-корелляций ПС после иммуноме­чения можно обработать серебром, а с соседнего участка изгото­вить УС и, не проводя физического проявления, исследовать лока­лизацию маркера малого диаметра [54].
  

12.5.3.2. Использование гидрофильных акрилатов

  
   Процедура заключения в акрилаты описана в гл. 6. Для улуч­шения иммуномечения УС рекомендуется, во-первых, облучагь их перед иммуномечением с помощью УФО, во-вторых, разводить комплекс КЗ с протеином А в 10-50 раз больше, чем рекомендует­ся производителями, в-третьих, промывать в промежутке между процедурами УС при t=60®С. Все это позволяет уменьшить не­специфическое связывание, например, в случае комплекса КЗ с протеином А до 6-10 частиц на 1000 мкм2 [225].
  

12.5.4. Условия проведения иммуномечения

  
   Для иммуно-ЭМ удобнее использовать чуть более толстые ак­риловые УС. Лучше брать желтоватые, а не серые УС, поскольку при высушивании их толщина становится нормальной, тогда как серые УС при этом будут слишком тонкими и хрупкими, а контрастность получаемого изображения очень низкой. Если работать с сеточками, покрытыми подложкой, по УС повреждаются значительно меньше [249].
  

12.5.5. Процедура иммуномечения

  
   Обычно для проведения иммуномечения используют пластин­ку воска, парафильм в чашке Петри или пластиковый иммуноло­гический планшет с мелкими лунками. На пластинку помещают ряды с каплями реактивов в нужной последовательности. Количе­ство рядов должно быть равно числу окрашиваемых сеточек. Чаш­ки Петри и планшеты необходимо закрывать крышкой - это пре­дохраняет объекты от загрязнения и помогает сохранить 100%-ную влажность внутри чашки. На крышке чашки пишут номера сеточек. Для улучшения перемешивания жидкости планшеты удобно помещать на вращающиеся столики. В этом случае во вре­мя инкубации сеточка должна плавать на поверхности капли сре­зами вниз. Иммуномечение крио-УС можно производить либо на поверхности капли реагента, либо погружением в каплю.
   Время инкубации чаще всего составляет 1-2 ч при комнатной температуре или около 12 ч при t=4®С. Некоторые АГ не требу­ют столь длительной инкубации - достаточно 30-120 мин [300].
   Если необходимо локализовать на УС два разных АГ, то снача­ла обрабатывают одну поверхность среза соответствующими ПАТ и ВАТ, а затем, поворачивая сеточку другой стороной, обрабатыва­ют таким же образом вторую поверхность УС соответствующими AT. Иммуномечение в этом случае обязательно осуществляется в процессе флотации сеточки на поверхности капли реагентов.
   Для того чтобы предупредить загрязнение первой стороны се­точки во время второго мечения, первую сторону после высушива­ния можно напылить тонким слоем углерода. Если УС собирали на подложку, то после первого иммуномечения их напыляют угле­родом, подложку растворяют, проводят второе мечение, после чего УС можно вновь покрыть формваровой подложкой [115].

12.5.6. Промывание

  
   После иммуномечения сеточки с УС должны быть тщательно отмыты. Обычно непосредственно после инкубирования сеточек с УС в рабочем растворе ПАТ их вначале промывают в холодном (t=0®С) ФБ или РБНС, а затем в бидистиллированной воде. Ис­пользование холодных растворов позволяет удалять загрязнения и одновременно препятствует вымыванию специфически связав­шихся AT [116]. Промыть сеточки можно, если переносить их из одной крупной капли в другую или многократно погружать в емкость с промывающей жидкостью. Высушивать УС во время процедуры мечения нежелательно. Это возможно только перед контрастированием при помощи УА и ЦС. Промывание (до 6 раз) сеточек удобно осуществлять на большой капле (100-200 мкл) промывочной жидкости. Можно промывать сеточку струей буфера из шприца. Поскольку в большинстве случаев в иммуно-ЭМ применяют никелевые сеточки, то можно воспользоваться магнитными мешалками, которые заставляют сеточки интен­сивно вращаться на капле промывочной жидкости. Скорость вращения не должна быть очень высокой (60 об./мин). Нельзя использовать магнитные мешалки, которые нагревают жидкость на платформе, так как это ведет к денатурации АГ и испарению жидкости [310].

12.5.7. Контрастирование и просмотр в ТЭМ

  
   Для контрастирования обычно используются УА и ЦС (под­робнее см. гл. 8). Так, после иммуномечения УС из ловикрила или ЛР Байт рекомендуется контрастировать на капле УА и капле ЦС, а затем подвергнуть действию паров ЧО, этап обезвоживания проводить в метаноле и на соответствующем этапе обработать объек­ты 2%-ным УА на 70%-ном метаноле (в течение 1 ч). После про­смотра УС в ТЭМ процесс формирования поперечных сшивок за­вершается, поэтому повторные иммуномечение и контрасти­рование делаются затруднительными и не рекомендуются.

12.5.8. Одновременное исследование ПС и УС

  
   Данный метод предполагает заливку образцов в гидрофильные акрилаты, изготовление ПС толщиной 1 мкм, которые монтируют на стекла. Сразу же после изготовления ПС с той же пирамидки получают несколько УС, которые с свою очередь помещают на се­точки. ПС используют для иммуно-СМ и последующего изготов­ления УС для ТЭМ. Последовательный просмотр ПС и УС позво­ляет визуализировать одни и те же клетки под СМ и ЭМ.
  

12.5.9. Иммуно-СЭМ

  
   Для иммуно-СЭМ маркер должен иметь размеры, превышаю­щие 20 нм. При меньших размерах маркера необходимы преци­зионные СЭМ высокого разрешения или надо использовать метод серебряного усиления (см. гл. 21, а также Приложение, 12.6 и 21.4).
  

12.5.10. Комплексные реакции

  
   На одном образце можно комбинировать реакции иммуно-ЭМ и ЭМ-гистохимии. При этом вначале проводят гистохимическую реакцию, а затем иммуномечение. Можно комбинировать имму­но-ЭМ с авторадиографией. Для этого вначале вводят меченную изотопом молекулу, затем осуществляют иммуномечение и, нако­нец, УС покрывают фотоэмульсией [145, 310].
  

12.5.11. Оценка результатов иммуно-ЭМ

  
   Одним из наиболее применимых контролей для иммуно-ЭМ является иммуно-СМ. Поэтому довольно часто возникают пробле­мы ложнонегативной реакции на уровне СМ (при иммуно-ЭМ мечение есть, а при иммуно-СМ его нет). Это может быть связано с фокальным распределением АГ. Одна из причин - маскирован­ные АГ. Ложноположительная (на уровне СМ) реакция может быть обусловлена одним из следующих обстоятельств: 1) перекре­стной реактивностью; 2) неспецифическим связыванием AT с тка­нями; 3) наличием эндогенной активности пероксидазы или авид-ности некоторых клеточных компонентов для индикатора реакции; 4) захватом чужеродной ткани (например, опухолевых клеток, ко­торые имеют исследуемый АГ); 5) освобождением растворимых протеинов из прилежащих клеток.
   Гетерогенность популяции поликлональных AT в сыворотке ведет к их взаимодействию не только с исследуемым АГ, но и с другими компонентами ткани. С другой стороны, несколько род­ственных веществ (особенно это касается пептидов) часто имеют общие аминокислотные последовательности, в результате чего AT реагируют с несколькими АГ вместо одного.
   Перекрестная реактивность является наиболее важным момен­том из всех отмеченных. Очень часто надо дать ответ на вопрос, что это - перекрестная реактивность или коэкспрессия. В первом случае одни и те же структуры будут метиться несколькими AT, однако более интенсивно - с истинной антигенной детерминантой, во втором случае будут метиться различные структурные ком­поненты. Иногда приходится последовательно метить серийные срезы несколькими AT для окончательного решения этого вопроса [184, 185].
   AT может перекрестно реагировать с другими пептидсодержащими молекулами, которые имеют те же самые или сходные де­терминанты. Перекрестная реакция может протекать с белками, которые имеют лишь незначительное функциональное или струк­турное сходство с исходным АГ, за исключением наличия сходной антигенной детерминанты.
   Истинную перекрестную реакцию устранить нельзя. Можно попытаться работать с AT, специфичными к разным частям моле­кулы, если, конечно, такие препараты AT имеются. Более того, хо­тя тот или иной АГ у разных видов животных может иметь одно и то же название, чаще всего ему присущи некоторые отличия в строении. Поэтому перекрестная реакция с АГ животного другого вида может протекать, а может и отсутствовать.
   Для ориентировки можно рекомендовать также непрямой ме­тод - двойное или тройное окрашивание, проводимое последова­тельно или параллельно при помощи AT, не дающих перекрестной реакции. Именно так поступают в случае использования двойного иммуноферментного метода. Можно покрасить две стороны одной и той же ЭМ-сеточки разными препаратами AT, отличающимися по диаметру конъюгированных с ними частиц КЗ.
   Перекрестное реагирование становится несущественным при использовании лигандов, не связанных друг с другом химически, например, если первый АГ идентифицируется с помощью биотинилированных МАТ с последующей обработкой комплексом стрептавидина с КЗ (диаметр частиц 15 нм), то второй АГ - с по­мощью небиотинилированных МАТ с последующей обработкой комплексом козьих AT, конъюгированных с КЗ (диаметр частиц 40 нм).
   Для двойного мечения ПАТ, продуцируемые разными видами животных, можно смешивать в одном растворе; в случае, если нет перекрестной реактивности, это же допустимо и с ВАТ [54, 115, 279, 300, 310]. Метод иммуно-ЭМ позволяет осуществлять имму­номечение и трех различных АГ [145].
  

12.5.12. Неспецифическое мечение

  
   Одним из недостатков всех методов иммуно-ЭМ являются не­специфические реакции, связанные с возникновением гидрофоб­ных и электростатических взаимодействий между иммуноглобу­линами и компонентами ткани, а также реакции загрязняющих AT с тканевыми АГ. Неспецифическое связывание приводит к возникновению фона. В числе причин этого феномена можно от­метить, во-первых, существование в объектах непрореагировавших альдегидных групп, во-вторых, наличие неспецифических мест связывания на объектах, в-третьих, неполное протеиновое покры­тие частиц КЗ, что и вызывает электростатические взаимодейст­вия между маркером и объектом. Присутствие в препаратах некро­тически измененных или плохо фиксированных клеток приводит к увеличению неспецифического окрашивания, возможно, из-за адсорбции сывороточных протеинов и КЗ.
  

12.5.13. Способы снижения фона

  
   При наличии сильного фона его необходимо уменьшить од­ним из следующих способов: 1) использовать более высокие раз­ведения ПАТ и(или) ВАТ; 2) до нанесения ПАТ провести блокирование нормальной сывороткой животного - донора ВАТ; 3) удалить свободный маркер из рабочего раствора; 4) провести адсорб­цию ПАТ и ВАТ альбумином или порошком ткани животного то­го вида, ткань которого окрашивают (например, добавить нор­мальную козью сыворотку в рабочий раствор); 5) провести аффинную очистку ПАТ (при этом может понизиться авидность); 6) удалить комплемент из препарата ПАТ путем добавления по­стороннего комплекса АГ-АТ или прогревания антисыворотки в течение 30 мин при t=56®С; 7) вместо одного маркерного фер­мента использовать другой; 8) увеличить время иммуномечения, но снизить температуру рабочего и промывающего растворов до t=4®С; 9) изменить протокол фиксации-заливки [116].
   Неспецифическое связывание иммуноглобулинов за счет гид­рофобных или электростатических взаимодействий можно пред­отвратить, если адсорбировать на исследуемых объектах антисыво­ротку или порошок ткани.
   Другой метод сводится к предварительной обработке ткани альбумином или нормальной неиммунной сывороткой, которая готовится из крови неиммунизированного животного того же ви­да, что и донор ВАТ, и используется в основном для блокирования неспецифического окрашивания. При этом блокируется большин­ство участков неспецифического связывания, но образующиеся связи слабее, чем связь АГ с AT, и поэтому не мешают специфи­ческим ПАТ взаимодействовать с АГ. К рабочему раствору AT можно также добавить нормальную сыворотку до концентрации 1 %. Связывания иммуноглобулинов с Fc-рецепторами при окра­шивании фиксированной ткани обычно не наблюдается, однако при исследовании поверхностных АГ на живых клетках в культуре или в суспензии могут возникать трудности. Неспецифические ре­акции такого рода можно исключить, работая с Fab-фрагментами вместо целых иммуноглобулинов.
   В результате сильного разведения антисыворотки абсолютное количество загрязняющих AT падает. Введение в буфер для про­мывания детергента (0.2 % Тритона Х-100) снижает неспецифи­ческое связывание белков.
   В качестве белков-блокаторов чаще всего используются овальбумин (1 %), БСА (1-3 %), желатина, включая полученную из ры­бы (1-5 %), обезжиренный порошок сухого молока (2-4 %), ацетилированный БСА (0.01 %), сывороточный альбумин человека (0.25%). Для уменьшения фона лучше преинкубировать УС в рас­творе овальбумина либо добавить к раствору AT альбумин (1 %), желатину (1 %) или Твин-20 (0.5 %). Преинкубация ПС в 5%-ном растворе нежирного сухого молока в значительной степени подав­ляет неспецифическую адсорбцию частиц КЗ.
   Обработка препаратов ацетилированными и "вытянутыми" мо­лекулами БСА перед инкубацией объектов с меченными КЗ реа­гентами второго "слоя" практически полностью блокирует связы­вание конъюгатов КЗ с гидрофобными субстратами. В этом случае для предупреждения маскирующего действия ацетилированного БСА на АГ в раствор добавляется Твин-20, поскольку он как бы инкапсулирует конъюгаты золота.
   Еще раз подчеркнем, что если в качестве усиливающего реа­гента используется протеин А или G, то нельзя применять БСА или другие сывороточные белки в качестве блокирующего неспе­цифическое связывание агента, поскольку иммуноглобулины нормальной сыворотки могут связываться с протеином А. Однако с протеином А не реагирует сыворотка цыплят [115, 300].
  

12.6. ОСНОВНЫЕ КОНТРОЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ

  
   Для предварительной оценки результатов, обнаружения опре­деленных структур, а также для проведения первых контрольных опытов целесообразно комбинировать СМ и ЭМ. Ввиду возможно­го неспецифического связывания AT очень важно проводить контроль для каждого этапа иммуно-ЭМ.
      -- ПАТ смешивают с избытком специфического АГ, а затем с раствором, из которого удалены ПАТ, обрабатывают препараты - результат должен быть отрицательным. Если же AT адсорбиру­ются с помощью неспецифического АГ, то результат должен быть положительным.
      -- Вместо AT, конъюгированных с маркером, препараты обра­батывают отдельно маркером, затем немеченым AT. Результат должен быть отрицательным.
      -- Мечение не должно иметь места, если исключить из проце­дуры обработку препаратов ПАТ или ВАТ.
      -- Меченая преиммунная или неиммунная сыворотока, кото­рая используется до обработки объекта с помощью ПАТ, не долж­на связываться тканью. Преиммунная сыворотка - это сыворотка от иммунизируемого животного, взятая до начала появления в ней AT. Если такая сыворотка недоступна, то пригодна и нормальная сыворотка или сыворотка, заведомо не взаимодействующая с тканью.
      -- При окрашивании с помощью проверяемых AT заведомо известных АГ в тканях результат должен быть положительным (положительный контроль).
      -- Если вначале объект обрабатывают немеченой антисыворот­кой, то при последующей инкубации с меченой антисывороткой результат должен быть отрицательным.
      -- При обработке тканей одним маркером результат должен быть отрицательным.
      -- Эндогенная ферментная активность на месте локализации АГ (в случае использования маркерного фермента) должна быть подавлена [54, 115, 279, 295, 300, 310].
  
  

12.7. ВОЗМОЖНЫЕ НЕУДАЧИ В ИММУНО-ЭМ, ИХ ПРИЧИНЫ И ПУТИ УСТРАНЕНИЯ

   Нет мечения. Причины: 1) трудности, связанные с реактив­ностью AT (выполнить тест на реактивность); 2) АГ поврежден (попробовать другие фиксаторы, заливочные среды, обработать ферментами для демаскировки АГ); 3) нарушение последователь­ности этапов (повторить процедуру); 4) чрезмерное разведение ПАТ (определить оптимальное разведение); 5) ПАТ испорчены (повторить процедуру с новой порцией ПАТ); 6) маркер денатури­рован (попробовать свежий маркер); 7) искаженные параметры инкубации (использовать рекомендованные параметры).
   Сигнал слишком слабый. Причины: 1) чрезмерное разведе­ние ПАТ; 2) чрезмерное разведение маркера; 3) время серебряного усиления слишком мало.
   Гетерогенность маркерных частиц после серебряного усиле­ния. Причины: 1) неподходящий метод серебряного усиления.
   Высокий фон. Причины: 1) неправильные условия инкуба­ции; 2) избыточная концентрация ПАТ; 3) неподходящий тип же­латины или другого блокирующего белка; 4) микропреципитация серебра во время серебряного усиления.
   Преципитация проявляющего раствора. Причины: 1) хромо­вая кислота, применявшаяся для мытья посуды, не отмыта с ее стенок; 2) имеет место контакт с металлами во время препариро­вания.
   В случае двойного мечения УС, если перепутать его стороны, будет происходить связывание других ПАТ свободными молеку­лами протеина А, адсорбированными на частицах КЗ, которые ис­пользовались во время первой реакции [115, 279, 300, 310].
   Глава 13 гибридизация in situ в электронной микроскопии

13.1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

  
   Гибридизация - это реакция формирования водородных связей между нуклеотидами при взаимодействии цепочек нуклеиновых кислот с комплементарными последовательностями нуклеотидов. Гибридизация может происходить между двумя цепями ДНК, между цепью ДНК и цепью РНК и между двумя цепями РНК. Гибридизация in situ (ГИС) с использованием нуклеиновых кис­лот в качестве зондов позволяет морфологически (на срезе или мазке) исследовать уровень экспрессии тех или иных генов в раз­личных нормальных и патологических условиях.
   ГИС позволяет выявлять определенные последовательности нуклеиновых кислот в целых клетках, на гистологических срезах и УС, в хромосомах, а также селективно распознавать генетический материал и молекулы РНК-посредников (т. е. локализовать специ­фические нуклеотидные последовательности в ДНК и РНК на уль­траструктурном уровне в пределах клетки), морфологически иден­тифицировать локусы репликации, транскрипции и трансляции генов, места взаимодействия цепочек РНК со специфическими структурами клеток. Данный метод дает возможность выявлять специфические последовательности нуклеотидов как в тканях и клетках, так и в хромосомах. ГИС может быть использована вме­сте с мечением антигенов на одном и том же объекте [114, 372].
   Идея метода очень проста - использовать меченые зонды из нуклеиновых кислот, которые способны связываться с "мишеня­ми" - комплементарными цепочками нуклеотидов ДНК или РНК - с образованием гибридных молекул.
   Суть метода ГИС состоит в том, что синтезируется зонд - по­следовательность нуклеотидов, комплементарная анализируемой последовательности нуклеотидов молекулы-мишени ДНК или РНК. Зонд метят либо изотопом (радиационные зонды), либо "молекулами-репортерами" (нерадиационные зонды), для обнару­жения которых существуют специфические иммунные или аф­финные системы. Детектирование зонда осуществляется, во-пер­вых, посредством регистрации излучения включенных в его состав изотопов (чаще всего трития), во-вторых, с помощью аффинного или. иммунного выявления "молекулы-репортера" [89, 168, 270, 289, 290, 360] (см. Приложение, 13).
  

13.2. ОСОБЕННОСТИ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

   В процессе препарирования необходимо достичь двух во мно­гом взаимоисключающих целей: сохранить молекулы нуклеино­вых кислот и структурную организацию клеток. В конечном итоге получаемый сигнал зависит от ряда факторов: 1) вида объектов; 2) степени разрушения мишени; 3) выбора фиксатора; 4) метода препарирования.
   Главной опасностью при препарировании является возмож­ность деградации РНК с помощью РНКазы - вездесущего и очень термостабильного фермента. В связи в этим все манипуляции не­обходимо проводить в перчатках. Посуда и другое термостабиль­ное оборудование должны подвергаться автоклавированию при t=250®С как минимум в течение 4 ч. Пластмассовые изделия и растворы также следует автоклавировать перед использованием. В процессе препарирования в растворы необходимо добавлять ингибиторы РНКазы.
   Использование нефиксированных объектов, их дегидратация и потеря целостности клеток в процессе резания при рутинном пре­парировании существенно ускоряют процессы деградации нуклеи­новых кислот из-за освобождения содержимого лизосом и дейст­вия эндогенных нуклеаз. Поэтому фиксацию желательно осущест­влять сразу же после взятия материала. От момента изъятия до момента начала фиксации не должно проходить более 10-20 мин. Увеличение этого времени резко снижает уровень получаемого сигнала.
   В качестве фиксаторов используют вещества, образующие по­перечные связи (например, ГА, ФА), и так называемые преципи­таты (например, этанол, метанол, ацетон), последние, однако, для целей ЭМ имеют весьма ограниченное применение.
   Из-за интенсивного образования поперечных связей после ис­пользования фиксаторов перед ГИС клетки и ткани подвергают пермеабилизации для улучшения проникновения зонда.
   Наиболее широко в настоящее время используют ФА, который обеспечивает возможность проведения на одном и том же объекте иммуноцитохимических исследований и ГИС. Однако в большин­стве случаев перед началом исследования необходимо подбирать адекватный фиксатор. Обычно чем дольше фиксируют объект, тем меньше уровень получаемого сигнала. В этом случае требуется об­работка срезов протеиназами.
   Фиксированный материал может храниться с определенными предосторожностями в буферном промывочном растворе в тече­ние 1-2 мес при t=4®С. С другой стороны, с фиксированных объ­ектов следует как можно быстрее (делая минимальным риск бак­териального загрязнения и деградации мишени) приготовить кри-остатные срезы (однако подобный метод резко снижает пригод­ность объектов для ЭМ). Наконец, замороженные блоки сохраня­ются значительно дольше в жидком азоте или при t=-70®С. Криостатные срезы обычно помещают на свободные от РНКазы предметные стекла, покрытые поли-Ь-лизином, и высушивают на воздухе. Они могут храниться в течение года при t=-70®С. Изо­лированные клетки рекомендуется осаждать на покрытое полили­зином предметное стекло.
  

13.3. ЗОНДЫ

  
   Нуклеотидные последовательности, применяемые в качестве зондов, могут состоять из одной или двух цепочек ДНК и одной цепочки РНК. Одноцепочечные зонды обеспечивают повышенную эффективность гибридизации в условиях насыщения без конкури­рующей собственной нуклеотидной цепочки, отделенной в процес­се нагревания. При этом одноцепочечные зонды РНК имеют пре­имущество, так как гибриды РНК с РНК представляют собой наи­более стабильные двойные нуклеотидные цепи. Более эффективны небольшие по размеру последовательности нуклеотидов вследствие их лучшей способности к проникновению в ткани. Большинство иссле­дователей, работающих в этой области, синтезируют собственные зон­ды. Однако в настоящее время быстро увеличивается число коммер­чески доступных зондов [89]. Зонды для ГИС имеются в продаже.
   Перед использованием необходимо проверить специфичность зонда (в соответствии с методами молекулярной биологии). Име­ется обратная зависимость между размерами зонда и его специ­фичностью. При выборе специфичного зонда желательно избегать наличия повторяющихся нуклеотидных последовательностей, для того чтобы зонд не связывался с множественными посторонними нуклеотидными цепочками. Варьирование последовательности нуклеотидов минимально в областях, кодирующих белки.
   Температура плавления гибридов имеет обратную зависимость от длины зонда и коррелирует с количеством в нем тех или иных нуклеотидов: зонды с увеличенным содержанием аденина и тимина имеют более низкую температуру плавления по сравнению с цепочками, где преобладают гуанин и цитозин. Чаще всего ис­пользуют зонды, состоящие из 100-400 оснований.
   Для ГИС применяют следующие виды зондов: 1) ДНК (одно-и двухцепочечные), 2) РНК, 3) олигонуклеотиды. ДНК и РНК про­дуцируют с клонируемых последовательностей, а олигонуклеоти­ды синтезируют химическим путем с помощью автоматических синтезаторов ДНК. Зонды из ДНК клонируются в бактериальных плазмидах или бактериальных векторах. После клонирования их достаточно легко пометить посредством имеющихся в продаже специальных наборов.
  

13.3.1. ДНК-зонды

  
   ДНК-зонды обычно прочнее, чем РНК, поскольку ДНКазы легче удаляются из зоны препарирования, чем РНКазы. Гетерологичные двухцепочечные ДНК способны формировать в клетке сеть, вызывая усиление сигнала. Такая ситуация особенно часто встречается, если зонд имеет на одном конце свободное основание, комплементарное основанию на другом конце зонда. В связи с большими размерами ДНК-зонды с трудом проникают внутрь клеток. ДНК-зонды, состоящие из двух цепочек, перед использова­нием должны быть денатурированы (например, с помощью кипя­чения) для отделения цепочек друг от друга и для того, чтобы ком­плементарная цепь могла гибридизироваться с комплементарной цепочкой мишени. В процессе проведения реакции идет конкурен­ция между реакциями восстановления ДНК и гибридизации зонда с мишенью, причем первая имеет преимущество.
   ДНК-зонды, включающие меченую векторную цепочку, могут увеличивать уровень фона при проведении ГИС на клетках из-за реагирования с геномом мишени и неспецифического связывания с клеточным матриксом. Для предупреждения этого проводят очистку зонда от векторной цепочки с помощью электрофореза в геле.
  

13.3.2. РНК-зонды

  
   РНК-зонды имеют как преимущества, так и недостатки. Например, поскольку они состоят из одной цепочки нуклеотидов, перед их использованием не требуется денатурации. Кроме того, не происходит реакции восстановления двойной цепочки в раство­ре. К нуклеотидной цепочке зонда может быть получена компле­ментарная цепочка, которую используют в качестве негативного контроля. Поскольку температура плавления (денатурации) гибри­дов, содержащих РНК, выше, чем в случае двойной цепочки ДНК, для проведения реакции гибридизации требуется более высокая температура. Однако такие условия способствуют снижению не­специфического связывания. При проведении ГИС необходимо осуществлять борьбу с РНКазами, легко разрушающими зонд. Скорость реакции гибридизации с РНК-зондами ниже, чем в слу­чае ДНК-зондов, что заставляет увеличивать либо концентрацию зонда, либо время реакции.
   Для проведения реакции гибридизации РНК-зонды требуются в меньшей концентрации, чем ДНК-зонды, что существенно сни­жает уровень фона. Они имеют определенный размер. Оптималь­ный размер зонда - 100-400 оснований. Как правило, РНК-зонды синтезируют с помощью транскрипции с кусков ДНК, внедренных в бактериальную плазм иду рядом с промотором (участком нуклео­тидной цепочки, связывающим РНК-полимеразу). Наборы с РНК-полимеразой для этой цели имеются в продаже. Если матри­ца ДНК, используемая для получения зонда, имеет большие раз­меры, то с помощью гидролиза размер получаемого зонда легко может быть уменьшен. РНК-зондам присуща высокая специфич­ность, они содержат до 80 % меченых нуклеотидов.
  

13.3.3. Олигонуклеотидные зонды

  
   Использование олигонуклеотидных зондов увеличивает до­ступность метода для исследователей, поскольку такие зонды можно легко и достаточно быстро на основе опубликованных мат­риц синтезировать в больших количествах. Эти зонды особенно применимы для маркировки семейств генов с высокогомологич­ными участками цепочек нуклеотидов. Олигонуклеотидные зонды состоят из одной цепочки ДНК. Поэтому реакции восстановления двойной цепи в растворе не происходит. Кроме того, зонд не разрушается РНКазами. Обычные размеры зонда составляют 17-150 оснований, что позволяет обходиться без процедуры пермеабилизации. Однако специфичность таких зондов существенно ни­же.
  

13.4. МАРКЕРЫ

  
   Для визуализации радиационных зондов используются прин­ципы ЭМ-АРГ. Этот довольно простой прямой метод чаще всего применяют при работе с большими по размерам объектами (це­лыми клетками на подложках, хромосомными "развертками" и т.п.). Однако степень разрешения при этом довольно низкая. Более высокое разрешение достигается при использовании для детекти­рования зонда биотин-стрептавидиновой системы, когда вначале осуществляют биотинилирование зонда, а после проведения реакции гибридизации биотин детектируют комплексом стрептавиди-на (или авидина) с КЗ, либо конъюгированными с маркером про-тивобиотиновыми антителами. Если используют неконъюгиро-ванные антитела, то их затем выявляют с помощью анти-IgG соответствующего вида или протеина А или G, конъюгированного с КЗ или ПХ.
   Такого рода зонды обычно представляют собой последователь­ность из 200-1000 нуклеотидов, причем каждое десятое основание является биотинилированным. Процесс биотинилирования прово­дится с помощью так называемой НИК-трансляции (от англий­ского nick - разрезать) с использованием биотинилированного D-уридинтрифосфата (УТФ). Биотинилированные зонды химически стабильны и сохраняют активность в течение долгого времени при t=-20®С. Перед использованием зонды, состоящие из двух цепо­чек, подвергают денатурации.

13.4.1. Процедура мечения

  
   Большинство методов мечения зондов обеспечено имеющими­ся в продаже наборами (китами) и соответствующей литературой.
  

13.4.1.1. Реакция НИК-трансляции

  
   В присутствии ДНК-полимеразы и четырех молекул нуклеотидтрифосфата (одна из которых содержит метку) в одну из цепо­чек ДНК с помощью фермента вносят разрывы. Полимераза вос­станавливает заново одну цепочку ДНК, используя неповрежден­ную цепочку в качестве матрицы. Обычно одновременно воздействуют двумя ферментами. Первый - панкреатическая ДНКаза-1, которая формирует случайным образом разрывы (ще­ли, nick) в каждой цепочке нуклеотидов вдоль молекулы ДНК. Вто­рой - ДНК-полимераза-1 из кишечной палочки, которая, опери­руя в области разрывов, в свою очередь также обладает двойной энзиматической активностью: эндонуклеазной активностью, с по­мощью которой постепенно удаляются нуклеотиды с 5'-конца ра­зорванной цепочки, и полимеразной активностью, с помощью ко­торой к 3'-концу одновременно присоединяются комплементар­ные к основаниям другой цепочки меченые нуклеотиды. В результате этого начальный разрыв перемещается вдоль молекулы ДНК в 5'?3'-направлении и при этом формирует однородно ме­ченный зонд. Субклонирования не требуется.
  

13.4.1.2. Метод удлинения ДНК-зонда от "матрицы" (primer extension)

  
   Вначале двойную молекулу ДНК денатурируют с целью полу­чения изолированных нуклеотидных цепочек, для чего лучше ис­пользовать линейную, а не кольцевидную ДНК. Затем к каждой из полученных изолированных цепочек нуклеотидов ДНК случайным образом присоединяют состоящие из шести оснований фрагмен­ты ДНК, которые используются в качестве своеобразного "запала" (матрицы). В дальнейшем с помощью фрагмента ДНК-полимера-зы-1 к 3'-концу "запала" присоединяют меченые (и немеченые) нуклеотиды. Гексануклеотидные цепочки образуются при гидро­лизе ДНК с помощью ДНКазы или посредством химического синтеза олигонуклеотидов. Наборы для проведения реакции "за­пального удлинения" имеются в продаже. Из-за перемещения це­почек нуклеотидов по отношению друг к другу возможно образова­ние сетчатых структур. Размеры зонда могут быть уменьшены в результате обработки ультразвуком.
  

13.4.1.3. Одноцепочечный однородно меченный ДНК-зонд

  
   Применение такого зонда позволяет избежать проблем, свя­занных как с восстановлением двойной цепочки ДНК зонда после денатурации, так и с действием РНКаз. ДНК-зонд, состоящий из одной цепочки нуклеотидов, получают посредством одноцепочеч-ного вектора из бактериофага М13. Вначале цепочку нуклеотидов субклонируют в М13. Затем к вектору добавляют "запал" - синте­тический олигонуклеотид, меченые нуклеотиды и фрагмент ДНК-пол имеразы-1. После синтеза зонда его вместе с матрицей отреза­ют с помощью рестрикционной эндонуклеазы, денатурируют для отделения меченого зонда от матрицы и очищают с помощью электрофореза на агарозовом геле.
  

13.4.1.4. Мечение концов олигонуклеотидных зондов

  
   Обычно для синтеза имеются фирменные наборы. Суть метода в том, что с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы к концу синтетического олигонуклеотида присоединяют не­сколько меченых нуклеотидов.
  

13.4.1.5. Транскрипция in vitro РНК-зондов

  
   Наборы для синтеза имеются в продаже. Суть метода заключа­ется в том, что РНК-полимераза катализирует синтез РНК из нук­леотидов на матрице ДНК. В плазмиду встраивается промотор, а сразу же за ним - матрица. Если "отрезать" плазмиду с помощью рестрикционной эндонуклеазы непосредственно перед промото­ром, то можно потом добиться транскрипции только зонда (без цепочки самого вектора). Биотинилированные зонды можно полу­чить с помощью биотинилированного УТФ или аллил-УТФ, кото­рый биотинилируется уже после транскрипции.
  

13.4.1.6. Прямое мечение

  
   Ковалентно связываться с нуклеиновыми кислотами могут как фотоактивируемые, так и химически реактивные группы. К при­меру, синтезирован и имеется в продаже фотоактивируемый ана­лог биотина, который может использоваться для мечения больших количеств ДНК или РНК.
  

13.4.2. Выбор меченого зонда

  
   Как уже упоминалось выше, все меченые зонды можно разде­лить на две группы: радиоактивные и нерадиоактивные. Выбор типа мечения определяет получаемое разрешение. Как правило, существует обратная зависимость между разрешением и чувстви­тельностью. На выбор типа мечения оказывают влияние также скорость проявления, необходимость в количественном анализе, стабильность зонда, безопасность, легкость использования и сто­имость реактивов. Для ЭМ можно рекомендовать только один тип изотопа - тритий. Его детектирование осуществляется в процессе ЭМ-АРГ. Экспозиция занимает в среднем 1-3 мес. Ее можно уко­ротить, если пометить зонд более чем одним меченным тритием нуклеотидом.
   Среди нерадиоактивных маркеров наиболее широко использу­ется биотин, который в дальнейшем детектируют с помощью противобиотиновых антител или стрептавидиновой системы (см. гл. 12). Мечение при помощи фотобиотина и аллил-УТФ дает боль­ший уровень фона, чем применение биотин-УТФ. Присутствие во многих тканях эндогенного биотина также резко увеличивает не­специфическое мечение. Применение нерадиоактивных маркеров дает возможность изучать строение хромосом в интерфазном ядре.
   Нерадиационные зонды имеют следующие преимущества: 1) стабильность; 2) высокий уровень разрешения; 3) безопасность для здоровья; 4) отсутствие проблем с обезвреживанием; 5) быст­рое детектирование сигнала; 6) недорогое лабораторное оборудова­ние. Главный их недостаток - низкая чувствительность [89, 99, 168, 270, 289, 360].
  

13.5. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

  
   Весь метод ГИС распадается на четыре части - получение и мечение нуклеинового зонда, гибридизация пробы на срезе и ви­зуализация гибридных молекул.
   Специфичность реакции гибридизации очень высока, если со­блюдать стандартные условия. Причем каждый из факторов может оказывать влияние на данный процесс. Мишень для гибридизации должна иметь только одну цепочку нуклеотидов. Поэтому для этих целей более подходит молекула РНК, тогда как молекула ДНК дол­жна быть денатурирована, для того чтобы цепочки нуклеотидов в двойной цепи ДНК отделились друг от друга. Температура дена­турации, выше которой связывания между парами нуклеотидов не происходит, в обычных условиях равна 90®С. Максимальная ско­рость гибридизации отмечается при температуре, которая на 25-30®С ниже температуры денатурации (плавления), при такой температуре гибридизация обычно и производится. Однако при ко­лебаниях в пределах 5®С около температуры плавления скорость существенно не изменяется. Температура денатурации может быть вычислена исходя из состава нуклеотидов. Она уменьшается при повышении процента адениновых и тимидиновых оснований или при неадекватности соотношений между парами оснований.
   Температура денатурации может быть уменьшена в щелочной среде, в растворах с низкой ионной силой или при увеличении концентрации в растворе полярных анионных молекул, например формамида. Применение формамида для снижения температуры реакции гибридизации позволяет лучше сохранить ткани. Каждый процент формамида в среде для гибридизации позволяет снизить температуру на 0.35®С для ДНК-РНК-связей и на 0.65®С для ДНК-ДНК-связей [89, 169, 270, 289, 360].
   Реакция гибридизации зависит от скорости диффузии зонда к мишени, степени законченности формирования гибридов, ста­бильности образованных двойных связей. Скорость диффузии об­ратно пропорциональна размеру зонда. Оптимальным размером зонда считается последовательность из 200-500 нуклеотидов. Ис­пользование зондов большего или меньшего размера уменьшает интенсивность получаемого сигнала. Оптимальной концентрацией радиоактивного зонда является 0.5 нг/мкл, а для нерадиоактивно­го 2.0 нг/мкл.
   Продолжительность гибридизации зависит от сложности зон­да, его длины и концентрации в растворе. Если продолжительность реакции чрезмерно увеличить, то буферный раствор, на котором готовится среда для гибридизации, будет удалять РНК из тканей. Обычно продолжительность гибридизации соответствует несколь­ким часам, в ряде случаев раствор с начавшейся реакцией оставля­ют на ночь. Гибридизации в течение 1 ч достаточно для детекти­рования 100 копий мРНК на клетку. Более длинные и менее слож­ные зонды гибридизируются быстрее. Включение полимеров в среду для гибридизации увеличивает скорость гибридизации и ко­личество связанной метки. Стабильность связывания зонда прямо пропорциональна его длине. Гибриды РНК-РНК более устойчивы к действию высокой температуры, чем ДНК-ДНК, а ДНК-РНК за­нимают промежуточное положение.
   Итак, оптимальными параметрами для реакции гибридизации являются температура на 25-30®С ниже температуры плавления, концентрация формамида около 50 % и содержание солей в преде­лах 0.75 моль/л. Реакция гибридизации оптимизируется и с по­мощью определенного микроокружения. Гибридизационные зон­ды обычно используются в растворе, который содержит физиоло­гический раствор, забуренный цитратным буфером, формамид, сульфат декстрана, неспецифические отрезки молекул ДНК и РНК. Для уменьшения фона непрореагировавшие зонды после гибридизации могут быть удалены с помощью обработки РНКа-зой [89].
  

13.5.1. Пермеабилизация

  
   Пермеабилизация, как правило, ухудшает сохранность ультра­структур и увеличивает потерю нуклеиновых мишеней. Обработка объектов с помощью протеаз (пепсина, преназы или протеиназы К) или разбавленных растворов кислот (соляной) приводит к уда­лению основных белков и увеличению уровня сигнала, несмотря на некоторую потерю мишени, особенно РНК, и повреждение, структур.
   Требуемый уровень депротеинизации определяется исходя из силы фиксации, типа ткани, размера зонда, используемого фер­мента, наличия других пермеабилизирующих процедур. Исполь­зуемые протеиназы должны быть свободны от РНКазной актив­ности. Действие протеиназ останавливается с помощью инкубации объектов в растворе глицина или посредством дофиксации, которая к тому же одновременно увеличивает проницаемость объ­екта.
   Для увеличения проницаемости объекты можно обрабатывать Тритоном Х-100. Проницаемость увеличивается при воздействии дегидратантов, при замораживании и оттаивании.
   В процессе препарирования тканей, как правило, всегда приме­няется та или иная форма их начального переваривания, чтобы сделать возможным проникновение зонда к мишени внутри клет­ки. Кроме того, необходимо освободить мишень от ассоциирован­ных белков.
  

13.5.2. Процедура постгибридизации

  
   Целью постгибридизационных процедур является удаление не­специфически связанных зондов из объектов для увеличения соот­ношения сигнал-шум. Поэтому условия промывания должны быть более жесткими, чем при гибридизации. Кроме того, требует­ся обработка с помощью нуклеаз для снижения фонового связыва­ния меченого зонда. Обычно для этих целей применяют РНКазы, которые разрушают одноцепочечные молекулы ДНК, тогда как гибридные молекулы оставляют интактными. При использовании ДНК-зондов после гибридизации ферменты обычно не применя­ют.
  

13.5.3. Детектирование радиоактивных зондов

  
   Вслед за постгибридизационными процедурами объекты обез­воживают, высушивают на воздухе и обрабатывают в соответствии с методикой ЭМ-АРГ (см. гл. 10 и Приложение, 13.2).
  

13.6. ПРОЦЕДУРА ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

  
   Для проведения ГИС необходимо сначала приготовить после­довательность нуклеотидов, комплементарную исследуемому гену. В эту цепочку и встраиваются нуклеотиды, меченные биотином или тимидином.
   ЭМ-гибридизация in situ может проводиться в режимах без за­ливки (на крио-УС фиксированных образцов), перед заливкой (преэмбеддинг), т.е. на фиксированных объектах, подвергнутых пермеабилизации, и после заливки (постэмбеддинг) [207]. В процессе подготовки образцов в большинстве случаев используется тот или иной способ фиксации. Чаще всего это ГА в различных концентрациях в смеси с ФА.
  

13.6.1. Преэмбеддинг

  
   Существует несколько вариантов препарирования объектов для их исследования в ЭМ.
      -- Культивируемые клетки вначале пермеабилизируют с помощью Тритона Х-100, фиксируют и гибридизируют in situ с помощью биотинилированных зондов; затем клетки метят антителами против биотина и визуализируют с помощью антител против иммуноглобулинов, конъюгированных с КЗ. После этого объекты в течение 18-24 ч дофиксируют в ГА, постфиксируют в 40 и готовят для ТЭМ [326, 327]. При использовании преэмбеддинга рекомендуется фиксировать образцы в чистом ФА (обычно 4 %) или с небольшим добавлением ГА; в последнем случае нет необходимости в проведении прегибридизации (энзиматического переваривания) ткани. После фиксации одним ГА из-за интенсивного образования поперечных связей ткань необходимо обработать протеазой (1 мкг/мл протеазы на каждый процент ГА). Эта процедура
    облегчает проникновение зондов в ткань.
      -- Можно вначале провести фиксацию образцов (к примеру, смесью, содержащей 3 % ГА и 3 % ФА). Затем пермеабилизиро-вать их (например, с помощью Тритона Х-100). После фиксации для обнажения мишеней - молекул РНК и ДНК - рекомендуется подвергнуть объекты перевариванию протеиназой. Для денатура­ции ДНК клетки нагреваются до t=95®С (обычно в течение 20 мин). Гибридизация проводится при t=37®С в течение 18 ч. Повторная обработка образцов с помощью Тритона Х-100 улуч­шает проникновение в ткань стрептавидина, меченного КЗ. Клетки дофиксируют в ГА, постфиксируют в ЧО и готовят для ТЭМ.
      -- После фиксации объектов (например, в смеси, содержащей 4 % ФА, 15 % пикриновой кислоты и 0.08 % ГА) можно пригото­вить на вибратоме срезы (или на криостате), которые заморажива­ют, оттаивают (либо пермеабилизируются с помощью Тритона Х-100 или сапонина) и подвергают ГИС с использованием биотинилированного зонда. Локализация зонда устанавливается с помощью антител против биотина или (стрепт) авидина, конъюги­рованных с ПХ или с КЗ. Далее следуют постфиксация в ЧО и препарирование для ТЭМ [89]. Необходимо учитывать, что обра­ботка клеток детергентом и протеазой часто ведет к потере рибо­сом.
      -- В процессе препарирования одиночных клеток осадок фиксируют, обрабатывают раствором Тритона Х-100, промывают в ФБФР, инкубируют в растворе протеиназы, вновь промывают в ФБФР, затем в цитратном физиологическом растворе, ресуспензи-руют в гибридизирующей смеси, нагревают и инкубируют в тече­ние ночи при t=37®С. Затем обрабатывают раствором Тритона Х-100, ФБФР, раствором БСА на ФБФР, раствором комплекса стрептавидина с КЗ, промывают в растворе БСА на ФБФР, фикси­руют в ГА. Далее клетки заливают в БСА, желатину или агар и препарируют для ТЭМ.
   В качестве контроля применяют, во-первых, исследование не­поврежденных (неактивированных) клеток, во-вторых, проводят инкубацию с неспецифической нуклеотидной цепочкой или с небиотинилированным зондом, в-третьих, обрабатывают клетки РНКазой или ДНКазой перед гибридизацией.
   Недостатком ГИС с помощью преэмбеддинга является плохая сохранность ультраструктуры. Кроме того, зонды и частицы КЗ, связанные с антителами или авидином (стрептавидином), плохо проникают в фиксированные целые клетки [89, 270, 289, 360].
  

13.6.2. Постэмбеддинг

  
   В большинстве случаев объекты заключают в водорастворимые заливочные смолы (см. гл. 4). При полимеризации акрилатов ре­комендуется использовать меньшую интенсивность УФО для луч­шей сохранности ДНК. УС собирают обычно на золотые или ни­келевые сеточки с углеродно-формваровой подложкой. Все проце­дуры проводят путем флотирования (плавания) сеточек УС вниз на микрокаплях.
   До гибридизации УС помещают в глицин, переваривают РНКазой, нуклеиновые кислоты в них денатурируют, проводят прегибридизацию путем обработки протеазами. Затем на каплю гибридизирующей смеси помещают сеточку с подготовленными к гибридизации УС. После гибридизации сеточки подвергают дей­ствию формамида, дважды промывают в цитратном физиологиче­ском растворе, а затем в ФБФР. Связавшиеся с мишенью биотини-лированные зонды метят противобиотиновыми антителами или стрептавидином, конъюгированным с КЗ. Неконъюгированные антитела детектируют с помощью противовидовых антител или протеина А, конъюгированных с КЗ или с другим маркером. УС обычно контрастируют с помощью УА и ЦС [207].
   Некоторые авторы рекомендуют вначале УС обработать РНКа­зой, отмыть, проинкубировать в растворе протеазы, а затем - ед­кого натра для денатурации клеток и вирусной ДНК в срезах, про­мыть водой и высушить. Вместо едкого натра можно применять соляную кислоту, которая освобождает пуриновые основания из заключенных в смолу молекул ДНК. Можно использовать кипяче­ние в воде или сухое нагревание до t=100®С. Затем сеточки с УС инкубируют в смеси для гибридизации и промывают в ФБФР [289]. Метод ГИС можно проводить и на ПС (см. Приложение, 13.1 и 13.3).
   Методы постэмбеддинга имеют ряд недостатков: 1) длительное время экспозиции; 2) ограниченное разрешение; 3) низкая чувст­вительность; 4) невысокая эффективность [270, 289, 360].
  

13.7. СИНТЕЗ ЗОНДОВ IN SITU

  
   Реакция НИК-трансляции может быть проведена непосредст­венно на акриловых УС. В реакцию вступают участки ДНК, экспо­нированные на поверхности УС и доступные ДНКазе-1. Для этого УС инкубируют в среде, содержащей ДНКазу-1, ДНК-полимеразу и четыре молекулы дезоксирибонуклеотйда, одна из которых - D-УТФ - биотинилирована. Локализация биотина, включенного во вновь синтезируемую цепочку ДНК, после завершения реакции НИК-трансляции детектируется с помощью КЗ, конъюгированного с антивидовыми IgG и антибиотиновыми антителами. С по­мощью данного метода можно выявлять компоненты ядра и яд­рышка, содержащие активную форму ДНК, митохондриальную ДНК, а также ДНК вирусов [18].
  

13.7.1. Гибридизация с использованием радиационных зондов

  
   ЭМ-гибридизация in situ при использовании тритиевой метки проводится путем помещения сеточки с УС на каплю смеси для гибридизации во влажной камере. Меченные тритием зонды дена­турируют кипячением [89].

13.8. СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТОДА

  
   Очень важно оценить, в каких структурах распределена метка. Поэтому или до, или после гибридизации при светоолтической гибридизации in situ объекты окрашивают подходящим красите­лем. Это зачастую само по себе является контролем.
   Иногда описанным выше методом обнаруживаются неожидан­ные гомологичные связи между зондом и мишенью. Для опреде­ления этих связей используют негативный контроль - реакцию с тканями, относительно которых уже известно, что молекул-мишеней нет.
   Для оценки самого метода можно провести реакцию с уже хо­рошо охарактеризованным зондом на позитивной клеточной систе­ме, например с использованием зонда к мРНК актина;
   Если имеются антитела к продукту исследуемого гена, то мож­но провести сопоставление между данными ГИС и иммуно-ЭМ на серийных срезах или на одном и том же срезе.
  
   Специфичность зонда можно проверить на блотах (Northern blot). В этом случае комплементарная зонду цепочка выступает в качестве позитивного контроля, а цепочка, полученная в результа­те транскрипции той же ориентации (sense probe), что и сам зонд, - в качестве негативного контроля.
   Очень полезным является конкурентный контроль, когда в среду для гибридизации добавляют смесь меченого и немеченого зондов. Уровень снижения сигнала должен быть пропорционален увеличению концентрации немеченого зонда.
   Для контроля самой процедуры гибридизации рекомендуется провести реакцию без добавления зонда. Результат должен быть отрицательным. Уровень сигнала снижается, если объект обрабо­тать нуклеазой до гибридизации. Степень снижения сигнала мож­но оттитровать, однако надо тщательно удалить из объекта все сле­ды нуклеазы.
   Контроли маркерных систем описаны в соответствующих раз­делах (см. гл. 10 и 12).
  

13.8.1. Неспецифическое связывание

   Уровень неспецифического связывания определяется поглоще­нием меченого зонда тканевыми компонентами, электростатиче­ским взаимодействием с белками, образованием ненасыщенных двойных связей между молекулой зонда и клеточными компонен­тами, фоном, зависящим от используемой маркерной системы.
   Для уменьшения электростатического взаимодействия между зондом, и основными протеинами объекты перед гибридизацией рекомендуется обработать 0.25%-ным раствором уксусного ангид­рида, который ацетилирует клеточные белки. Ацетилирование осо­бенно полезно при использовании длинных зондов (более 250 нуклеотидов) и зондов, меченных биотипом; оно блокирует присо­единение зонда к полилизину, применяемому в процессе препари­рования для прикрепления объектов.
   Очень часто для уменьшения неспецифического связывания используется процедура прегибридизации. Она проводится при температуре гибридизации и длится не более 2 ч. Среда для пре­гибридизации включает детергент, фикол, поливинилпирролидон, гепарин, альбумин (для снижения неспецифического связывания с белками), полисахариды и нуклеиновые кислоты (обычно ис­пользуется свежеденатурированная ДНК или тРНК - для блокиро­вания мест неспецифического связывания нуклеиновых кислот), а также пирофосфат натрия (для блокирования сайтов, соединяю­щихся с фосфатами зонда). Очень эффективна для предупрежде­ния взаимодействия нуклеиновых кислот и белков в процессе пре­гибридизации ауринтрикарбоксиловая кислота (autinthicarboxylicacid).
   Для блокирования неспецифического связывания биотинилированного зонда используется преинкубация объектов с немеченой системой маркирования (например, со стрептавидином или авидином) с последующей вторичной инкубацией со свободным биотином. Однако данный метод может быть малоэффективен, по­скольку эти вещества легко удаляются при высокой температуре гибридизации и в присутствии формамида и детергентов. Кроме того, такие условия могут обнажать в тканях новые биотиноподобные молекулы.
  

13.8.2. Интерпретация и артефакты

  
   Соотношение размеров молекул различных зондов показывает, что с одной молекулой-мишенью может связываться несколько гибридных зондов, меченных КЗ. Следовательно, к одной молеку­ле ДНК или РНК может быть прикреплено несколько частиц КЗ. Пространственная конфигурация мишени в клетке и прикреплен­ного зонда с частицами КЗ довольно сложна [121].
   В случае преэмбеддинга зонды связываются со всеми доступ­ными локусами комплементарных последовательностей нуклеоти­дов на мишени, однако визуализируются лишь те частицы КЗ, ко­торые попали в плоскость среза. При использовании постэмбеддинга гибридизация происходит только в том случае, если на срезе имеется подходящая для связывания (комплементарная) последо­вательность нуклеотидов мишени, при этом видны все частицы КЗ, связанные с одной молекулой зонда.
   Следует учитывать, что кластерное распределение частиц КЗ на препарате представляет собой двухмерную проекцию трехмерной конфигурации нуклеиновой кислоты. Однако, поскольку нуклеи­новая кислота денатурирована, эта конфигурация не всегда отра­жает нативное состояние. Сложность трехмерной конфигурации мишени ведет к тому, что частицы КЗ, специфически маркирую­щие мишень, всегда формируют агрегаты, что позволяет легко от­личать их от фонового отложения единичных частиц золота. Поэ­тому при гибридизации in situ с помощью преэмбеддинга обнару­жение кластеров частиц КЗ свидетельствует о наличии в этом месте искомых нуклеотидных цепочек [89].
  

13.8.3. Меры предосторожности

  
   При проведении гибридизации in situ необходимо пользовать­ся тщательно вымытой и простерилизованной (после споласкивания диэтилпирокарбонатом) посудой для ингибирования активно­сти загрязняющих РНКаз. Все материалы, используемые в опыте, также необходимо промывать 0.1%-ным диэтилпирокарбонатом. Работать надо в резиновых перчатках.
   Глава 14 ПРИМЕНЕНА ТРЕЙСЕРОВ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
  
   Трейсеры (tracer) - это экзогенные субстанции, использую­щиеся для получения информации о переносе веществ в биологи­ческих объектах. Данный метод часто носит название "метод моле­кулярных зондов". Применение трейсеров (Тр) позволяет изучать направленность динамических процессов в клетках и тканях с по­мощью ЭМ. Они используются для определения порозности или проницаемости физиологических барьеров, для отслеживания движения молекул в физиологических системах (например, для визуализации эндоцитоза макромолекул), для детектирования ти­пов межклеточных соединений и тд. [106, 208].
  

14.1. ВЫБОР ТРЕЙСЕРА

   Выбор трейсера (Тр) должен определяться, с одной стороны, его эффективным молекулярным диаметром, а с другой - пред­полагаемым размером и геометрией исследуемых тканевых путей. Нужно учитывать также форму молекулы Тр, гибкость или ригид­ность ее. Свойства молекул различных Тр в этом отношении варь­ируют. Например, молекула гемоглобина очень ригидна, а молеку­ла декстрана с множеством ветвей очень гибка и может проходить через поры меньшего размера, чем ее диаметр.
   Важнейшим параметром Тр является электрический заряд мо­лекулы, который влияет на взаимодействие между Тр и отрицатель­но заряженной поверхностью клеток, например, микрососудистой стенкой. Тр могут быть электронейтральными (миоглобин, нативная ПХ), заряженными отрицательно (гемипептиды, сукцинилированная ПХ, каталаза) и заряженными положительно (цитохром С, катионизированная ПХ, лактопероксидаза, миелопероксидаза).
   Наконец, движение частиц Тр в тканях и, в частности, их фильтрация через стенку капилляра и особенно через базальную мембрану определяется локальным распределением зарядов на по­верхности эндотелия. При этом Тр часто связывается с изучаемой поверхностью, маркируя анионные места (сайты) [113, 215, 325].
   Изучение внутриклеточного транспорта наиболее часто прово­дится с помощью введения во внеклеточное пространство ПХ. Ес­ли ПХ введена во внеклеточное пространство неповрежденного нейрона, то часть ее поглощается осевым цилиндром и ретроград­но транспортируется по аксону к телу клетки, что позволяет лока­лизовать тела иннервирующих данную структуру нейронов. Про­дукт реакции не виден светооптически в терминалях, но хорошо заметен в телах нейронов в виде вторичных лизосом [106].
  

14.2. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ТРЕЙСЕРЫ

  
   Вещества, используемые в качестве Тр, можно разделить на три класса: 1) небольшие неорганические молекулы в виде истин­ных растворов; 2) коллоиды; 3) крупные органические молекулы. Большинство Тр имеет заряд на своей поверхности, что нередко затрудняет их транспорт через тканевые каналы и усиливает тен­денции к связыванию с поверхностями клеток и неклеточных структур.
   В зависимости от токсичности все имеющиеся Тр можно раз­делить на пригодные для использования либо in vivo, либо в про­цессе фиксации [113, 325].
   В качестве Тр могут служить следующие субстанции: естест­венные частицы (ферритин, гликоген), искусственные частицы (декстран, коллоидный уголь, КЗ, коллоидный лантан), ферменты (ПХ, различные гемопротеины), неорганические молекулы (нит­рат лантана, рутениевый красный) и др. Их молекулярная масса варьирует от 15 тыс. до 240 тыс.
   Проницаемость сосудов можно оценивать с помощью фильт­рации антигенов (белков). При этом животному вводится специ­альный белок, который затем детектируется антителом. Ниже при­ведены молекулярные массы некоторых Тр:

Микропероксидаза

1900

Лактопероксидаза быка

82000

Цитохром С

12000

Миелопероксидаза человека

160000

Пероксидаза хрена

40000

Каталаза из печени коровы

240000

Бычий гемолобин

64500

Ферритин

500000

  
   Диаметр Тр колеблется от 2 до 300 нм и более (например, микропероксидаза 2 нм, ПХ 45 нм, ферритин 11 нм, КЗ 1-40 нм, гранулы серебра 100-300 нм).
  

14.2.1. Частицы

  
   Ферритин - это белок, содержащий железо. Его молекулярная масса колеблется от 46 тыс. до 75 тыс. Каждая молекула содержит 2000-3000 атомов железа. Ферритин может использоваться как в нативной, так и в катионизированной форме. Молекула нативного ферритина со средним диаметром 9.4 нм содержит до 40 % гидро­окиси железа, располагающейся в центре молекулы в виде элект­ронно-плотного ядра диаметром 55 нм. Катионизированный фер­ритин несет положительный заряд и поэтому связывается с отри­цательно заряженными участками клеточной поверхности. Натив-ный ферритин в большинстве случаев поглощается клетками с помощью жидкофазного эндоцитоза.
  

14.2.2. Кристаллоиды

  
   Рутениевый красный (РК) также может использоваться в каче­стве Тр. Молекула РК имеет диаметр 1.13 нм.
   Лантан имеет атомный номер 57 и характеризуется значитель­ной электронной плотностью в ТЭМ. Нитрат лантана образует трехвалентный катион, который связывается с отрицательно заря­женными участками клеточной поверхности, особенно с соответст­вующими областями гликопротеинов. При повышении рН до 7.81 раствор гидроокиси лантана образует коллоидную суспензию, ко­торая часто используется в качестве Тр (см. ниже).
   Нитрат лантана и РК, проникая между внутримембранными частицами, метят щелевые контакты и используются в виде сме­сей с фиксирующими растворами (1-2 % нитрата лантана или 0.05-0.08 % РК) и как добавка к промывочным растворам. Раство­ры РК готовят в темноте [113, 215, 325].
  

14.2.3. Ферменты

  
   Энзиматические Тр широко применяются для изучения про­ницаемости физиологических барьеров и переноса веществ в пре­делах внутри- и внеклеточного пространства. Однако при этом энзиматические Тр в используемых концентрациях не должны вызывать изменений в объеме крови, артериальном и коллоидно-осмотическом давлении.
   ПХ представляет собой молекулу фермента с молекулярной массой около 40 тыс. Ее используют для изучения проницаемости физиологических барьеров. В качестве Тр можно использовать ПХ, конъюгированную с КЗ. ПХ обнаруживает значительную аффин­ность к гликокаликсу эндотелиальных клеток. Эффект значительно возрастает, если предварительно фиксировать ткань альдегидами (см. Приложение, 14.1). ПХ обычно вводят внутривенно. Лучше всего использовать ПХ IV типа (Sigma) или ПХ, очищенную элек-трофоретически. При исследовании с ее помощью сосудистой про­ницаемости на животных предпочтительны малые дозы (10 мг на 1 кг массы тела). В случае применения ПХ фирмы Reanal (Венг­рия) наиболее оптимальной является доза в 20-30 мг на 100 г массы животного. При этом весь белок лучше растворить в объеме физиологического раствора (или раствора Хэнкса), не превышаю­щем 05 мл. Время фиксации в ГА не должно превышать 15-2 ч.
   Для визуализации пероксидазы в ТЭМ применяют обычные реакции для выявления ПХ с ДАБ и перекисью водорода, продук­ты реакции которых дополнительно осмируют с помощью ЧО. Чаще всего выявление ПХ проводят по методу Грэм и Карновски [159]. Продуктом гистохимической реакции является окисленный ДАБ, который легко детектируется в СМ, а после обработки с по­мощью ЧО - и в ЭМ. Этот хромоген представляет собой поли­мер, он гомогенен, осмиофилен, нерастворим в дегидратантах и в заливочных средах. Предложено довольно много новых хромоге­нов для выявления ПХ, но не все они применимы в ЭМ. Некото­рые хромогены, хотя и отличаются большей чувствительностью, лишены многих из указанных качеств.
   Проведение ферментативной реакции на ПХ при рН 7.6 со­провождается значительным числом неспецифических реакций, а при рН 5.6 неспецифические отложения практически отсутствуют. Оптимальным для выявления пероксидазной активности является рН 4.3, однако после фиксации в ГА этот оптимум сдвигается с 4 до 7. Введение в инкубационную среду нитрогенных лигандов, на­пример имидазола (до 0.1 М), увеличивает ферментативную ак­тивность и ПХ (почти в 2 раза), и микропероксидазы, но не вли­яет на активность цитохрома С. В случае микропероксидазы хоро­ший эффект получен при добавлении диаминопиримидина. Имеются способы выявления активности пероксидазы на залитых в эпоксидную смолу срезах [113, 215].
   Продолжительность инкубации в полной инкубационной среде может достигать 2 ч (t=37®С), при этом среду меняют каждый час. Для улучшения выявления ПХ можно рекомендовать преинкубацию (30-60 мин) объектов в среде без добавления перекиси водорода.
   Молекулы микропероксидазы с различной молекулярной мас­сой диффундируют в интерстициальном пространстве очень быст­ро, поэтому желательно подобрать такой временной интервал от введения фермента в кровоток до взятия материала, чтобы была заметна разница в концентрации между просветом микрососудов и интерстицием. Следует учитывать, что коммерческие препараты микропероксидазы в ряде случаев могут быть слегка загрязнены, а фиксация микропероксидазы с помощью ГА вызывает образова­ние относительно широкого спектра сополимеров с высокой моле­кулярной массой. Моноциты человека при инкубации с микропе-роксидазой не обнаруживают повреждений.
   Для олигопептидов (микропероксидазы) оптимум рН варьиру­ет от 12.0 (для Н8Р) до 135 (для НИР). Обычно же используют инкубационную среду с рН 7.0-7.2 и 8.6-9.0 соответственно. Для нативной ПХ оптимум рН составляет 4.3. Во время фиксации с помощью ГА рН сдвигается в нейтральную область для Н8Р и ПХ (до 7.0), но остается высоким для НИР (см. Приложение, 14.2).
   Наиболее удачные модификации инкубационной среды Грэм и Карновски [159] включают замену Трис-буфера или ФБ на 0.1 М КБ (рН 7.1-7.4), который применяется также для растворения фиксатора и для промывания объектов [106J.
   Микропероксидаза хорошо переносится плазмой; в отличие от нее ПХ при внутривенном введении не связывается с сывороточ­ными протеинами.
   Лактопероксидаза - это Тр с молекулярной массой 100 тыс., ис­пользуемый изредка для демонстрации жидкофазного эндоцитоза.
  

14.2.4. Коллоидные растворы

   Для изучения проницаемости используется коллоидный уголь (взвесь микрочастиц угля - черная тушь), который благодаря низкой токсичности можно вводить в больших количествах (до 0.5 мл на 100 г массы). Оптимальная доза 0.15-0.2 мл на 100 г. Час­тицы туши хорошо видны в ЭМ. Отрицательным свойством кол­лоидного угля является его способность агрегировать белки плаз­мы и клетки крови. Для уменьшения токсичности пробирку с тушью рекомендуется в течение 15-20 мин прогреть при темпера­туре 50-60®С, затем охладить и подвергнуть центрифугированию при 7000-8000 об./мин в течение 20-30 мин. Пользоваться жела­тельно лишь поверхностными слоями жидкости.
   Коллоидный лантан проходит через межклеточные щели и не­которые специализированные межклеточные соединения (щеле­вой и промежуточный контакты и десмосомы). Однако плотные контакты в нормальном состоянии блокируют его прохождение. Сходным образом действует коллоидный никель, который хорошо маркирует плотные контакты (см. Приложение, 14.3 и 14.4). Кол­лоидный рутений может использоваться как Тр в тех же случаях, что и коллоидный лантан. При обработке ЧО он образует четырех-окись рутения, которая хорошо видна в ЭМ [113, 215, 325].
   В последние годы в качестве Тр более широко стали применять КЗ, в частности для исследования экзо- и эндоцитоза и т.п. [235]. Для этих целей можно использовать также альбумин, конъюгиро-ванный с КЗ. Альбумин является стабилизатором частиц КЗ. Конъюгаты КЗ с белком могут использоваться при исследовании ретроградного нейронального транспорта. Для этого раствор инъе­цируют в осевые цилиндры или в нервную ткань.
  

14.3. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

  
   Использование Тр, особенно энзиматических, имеет ряд огра­ничений: 1) введенные молекулы выявляются непрямым спосо­бом, т.е. посредством многоступенчатой гистохимической реак­ции; 2) из-за амплификационного эффекта возникает несоответст­вие между выраженностью реакции и числом проникающих молекул фермента; 3) невозможна количественная оценка реак­ции; 4) при введении ПХ и цитохрома С в системный кровоток лабораторных животных часто возникает побочный повреждаю­щий эффект.
   ПХ, цитохром С и миоглобин обусловливают системные из­менения в организме: при внутривенном введении приводят к по­вреждению посткапиллярных венул и открытию плотных межэндотелиальных контактов в связи с гистаминмедиированным эффектом. При введении в кровоток ПХ увеличивает проницаемость кровеносных сосудов, вызывает дегрануляцию тучных клеток, а иногда - анафилактические реакции. В ряде случаев инкубация клеток с ПХ или с цитохромом С in vitro вызывает их гибель.
   Необходимо выполнять ряд предосторожностей (см.: [325], табл. Simionescu et al.) и знать природу как изучаемых тканей, так и возникающих системных осложнений. Например, системный побочный эффект ПХ зависит от используемой концентрации и от степени чистоты коммерческого препарата. Так, 10-4 М ПХ не вызывает повышения проницаемости, а 10-3 М вызывает. Изме­нения в объеме крови, артериальном и коллоидно-осмотическом давлении могут быть уменьшены с помощью подбора концентра­ций и объемов инъецируемых Тр или введения блокаторов гистамина. Для уменьшения повреждающего действия ПХ на эндоте­лий сосудов за 30 мин до введения ПХ следует внутрибрюшинно инъецировать раствор, содержащий 80 мг ацетилсалициловой кис­лоты в 0.2 мл стерильной воды.
   Мыши довольно резистентны к стимуляции тучных клеток с помощью ПХ, крысы очень чувствительны. Выведены специаль­ные линии крыс (Wistar-Furth), которые известны как генетически резистентные к веществам, высвобождающим гистамин. Имеются специальные особо устойчивые к ПХ линии мышей (например, СЗНеВ) [106].
   В большинстве исследований время циркуляции Тр в крови не превышает 10 мин. Это обусловлено их быстрым выведением из кровотока и связыванием с белками плазмы крови. Например, при введении в кровоток микропероксидаза уже через 10 мин связывается с протеинами плазмы на 12-16 %, а через 2 ч - на 50-100 %. Микропероксидаза после введения в кровь остается в моно­мерном состоянии не более 10 мин, а затем связывается с белками крови.
   Наличие диффузии фермента или продукта его реакции в тка­нях может быть проверено с помощью контрольного эксперимен­та, в котором фермент добавляют к фиксирующему раствору или к инкубационной среде.
   Уже сделаны первые шаги по внедрению методов количествен­ной оценки трейсерных экспериментов с помощью измерения оп­тической плотности различных участков УС, а также по использо­ванию двух и более маркеров, например вначале вводят в кровоток ферритин, а затем ПХ, либо сначала - катионизированный ферритин (см. Приложение, 14.5), а потом ПХ [6, 113, 215, 325].
   Глава 15 МЕТОД РЕПЛИК
  
   В ряде случаев при исследовании биологических препаратов, которые разрушаются под действием электронного пучка или по другим причинам, оказывается целесообразным изучать не сам объект, а слепок его поверхности - реплику. Для увеличения контрастности реплики необходимо оттенять электронно-плотным веществом (обычно металлами). Одна из разновидностей данного метода - получение реплик с предварительно оттененного препа­рата - наиболее широко используется в биологии и позволяет на­блюдать структуру оттеняемой поверхности. Метод реплик в ТЭМ имеет обычно большее разрешение (2-3 нм), чем обычный метод СЭМ. Поэтому он используется для визуализации (часто после их мечения) тонких структур на поверхности образца [9, 43, 287, 330]. Для этого метят макромолекулы на поверхности монослоя клеток (обычно после фиксации), затем препарат высушивают, на­пыляют и исследуют в СМ, после этого объекты растворяют и очищенную реплику анализируют в ТЭМ. Клеточный монослой можно также заморозить, лиофилизировать и реплицировать, а за­тем изучать реплики наружной поверхности клеток.
  

15.1. ИЗГОТОВЛЕНИЕ РЕПЛИК

   Существуют одноступенчатый и двухступенчатый методы из­готовления реплик. В первом случае исследуемый объект покрыва­ют повторяющим рельеф поверхности слоем вещества, который после отделения образует реплику. При двухступенчатом методе с объекта первоначально делают так называемый промежуточный отпечаток, с которого затем снимают вторичную реплику. Разре­шающая способность реплик, изготовленных по двухступенчатой методике, достаточно низка и составляет примерно 7.5-10 нм.
   При изготовлении реплик одноступенчатым методом исполь­зуют формвар или коллодий (если не требуется высокое разреше­ние) либо напыленные в вакууме слои углерода или кварца (если необходимо изготовить реплики с высоким разрешением).
   При двухступенчатой методике промежуточный отпечаток из­готавливается в виде прочной пленки, легко выдерживающей ме­ханическое отдирание. Материал конечной реплики не должен раз­рушаться в растворителе, предназначенном для получения проме­жуточного отпечатка. При изготовлении отпечатка из желатины на поверхность объекта наносят ее раствор в теплом виде слоем в 2-3 мм. Когда этот слой полностью высыхает, его толщина составляет 1 мм и он часто сам отделяется от образца.
   Обычная процедура изготовления реплик следующая: на по­верхность образца наносится тонкий слой 1%-ного раствора кол­лодия (целлоидина) в амилацетате. После высушивания поверх­ность покрывается еще несколькими слоями 2%-ного целлоидина. Пленку осторожно снимают (можно с помощью скотча) и высу­шивают. Та поверхность пленки, которая соприкасалась с образ­цом, напыляется платиной (обычно под острым углом) и углеро­дом (перпендикулярно поверхности). Пленку помещают на повер­хность хлороформа напыленной стороной вверх для растворения целлоидина, затем реплику вылавливают и высушивают. Если ре­плики (коллодиевые или формваровые) используют без оттенения, то их разрешение и контрастность неудовлетворительны.
   В ряде случаев электронно-плотный материал (металл) напыля­ют непосредственно на исследуемый объект. Затем наносят слой уг­лерода для образования углеродной пленки, т.е. с предварительно от­тененного препарата получают предварительно оттененную реплику. Поскольку углеродная пленка несет на себе лишь слой оттеняющего металла, то этот метод иногда называют методом "переноса теней".
   Значительно реже оттенение производится поверх нанесенного слоя углерода (или окиси кремния и др.). Этот вариант иногда применяют, если угольно-металлическая пленка плохо отстает от исследуемой поверхности. Углеродная пленка отделяется легче. Ре­же практикуется оттенение одноступенчатой реплики с той сторо­ны, которая была в контакте с образцом. Такое оттенение создает негативное изображение поверхности. В случае двухступенчатых реплик производится оттенение со стороны, которая была в кон­такте с промежуточным отпечатком [9, 43, 287, 330].
  

15.2. ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ НАПЫЛЕНИЯ

  
   Металлы и вещества, используемые для напыления, должны обладать следующими свойствами: 1) большой электронной плот­ностью; 2) небольшой величиной зерна; 3) отсутствием грануля­ции металла под воздействием электронного пучка; 4) химической стойкостью; 5) легкостью испарения.
   В биологических исследованиях чаще всего используют платину, палладий и сплав платины с палладием. Недостатком платины явля­ется то, что она сплавляется с вольфрамом, это затрудняет ее испаре­ние. Для уменьшения величины зерна рекомендуется осуществлять одновременное испарение платины и углерода. В качестве электродов применяют углеродные стержни диаметром 25 мм, содержащие платину. Для этой цели обычный графитовый стержень протачивают с одного конца до диаметра 2 мм. В сточенном участке просверли­вают отверстие длиной 2 мм и диаметром 1 мм, в которое встав­ляют платиновую проволоку. Электрод устанавливают так, чтобы был контакт с плоским торцом обычного угольного стержня. При пропускании тока происходит одновременное испарение углерода и платины. Состав напыленной пленки можно регулировать изме­нением размеров углеродного электрода и количества платины.
   Иногда вместо углеродно-платиновых электродов применяют смесь платины и кварца. Для этого порошок платиновой черни смешивают с порошком кварца (платина составляет 80 % но мас­се), прессуют в таблетки и помещают для испарения в коническую вольфрамовую спираль. Достаточно мелкогранулярные покрытия получаются при испарении жаростойких металлов: вольфрама, ниобия, тантала [9, 43, 287, 330].
  

15.3. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛЕНОК ИСПАРЕНИЕМ ВЕЩЕСТВ В ВАКУУМЕ

  
  
   Если под некоторым углом к направлению пучка распыляемых частиц поместить исследуемый объект, то на его поверхности будет осаждаться слой металла различной толщины. На участках поверх­ности, расположенных перпендикулярно к направлению полета час­тиц, образуется наиболее толстый слой. В тех местах, где объект бу­дет экранировать пучок частиц, возникают "тени". Угол между на­правлением распыляемых частиц и поверхностью объекга называется "углом оттенения" (рис. 34).
   При выборе угла оттенения руководствуются главным образом профилем объекта и его размера­ми. При оттенении небольших структур существенное искажение их размеров может произойти в результате накопления оттеняю­щего металла на стороне объекта, обращенной к испарителю.

0x01 graphic

   Рис. 34. Определение параметров ре­плики на основании характеристик тени. 1 - длина тени; 2 - источник на­пыления; а - угол оттенения.
  
   Для того чтобы обеспечить необходимую контрастность изо­бражения и высокую механиче­скую прочность, реплики обычно делают из двух слоев: напыленно­го под некоторым углом слоя ме­талла, обеспечивающего отобра­жение рельефа, и несущей этот слой пленки из аморфного веще­ства с низкой электронной плот­ностью и достаточно высокой стойкостью к воздействию элект­ронного пучка (чаще всего это уг­лерод).
  

15.3.1. Испарение углерода

  
   Углерод легко испаряется при пропускании электрического то­ка через два угольных электрода. В месте контакта двух графито­вых стержней электрическое сопротивление максимально. Именно здесь выделяется наибольшее количество тепла, происходит ин­тенсивный нагрев и испарение графита. Электроды прижимаются друг к другу с помощью пружины. Объект помещают на расстоя­нии 8-10 см от места контакта стержней (рис. 35, А и Б). Напыле­ние углерода производится перпендикулярно к поверхности образ­ца (обычно используют специальные графитовые стержни). При этом важно правильно подобрать величину тока и длительность напыления.
   В ряде случаев испарение углерода осуществляется из специ­альной угольной тесьмы. Углерод, из которого образованы угле­родные нити тесьмы, легко испаряется и соответственно требуется меньший электрический ток.
   Можно получить углеродные пленки при плазменной полиме­ризации паров нафталина на поверхности объекта. Для этого пары нафталина впускают в вакуумную камеру и несколько секунд под­вергают воздействию высоковольтного разряда. Последний вызы­вает полимеризацию газа в виде тонкой пленки на поверхности объекта (см. Приложение, 15).
  

15.3.2. Методы распыления других веществ

  
   Для распыления в вакууме других веществ и прежде всего ме­таллов разработаны следующие способы (рис. 35).
   Распыление с помощью нагревания вольфрамовой проволоки. Согнутый в виде скобки небольшой кусок проволоки или полоски металла, подлежащего испарению, помещают на V-образную воль­фрамовую проволоку в месте ее перегиба. После достижения необ­ходимого вакуума нить раскаляют электрическим током, металл расплавляется и, образовав каплю, испаряется (рис. 35, В).
   Металл, который реагирует с материалом нити, при нагрева­нии вызывает ее перегорание, поэтому для его испарения прихо­дится пользоваться специальными приемами. Например, для ис­парения веществ, сплавляющихся с вольфрамом, применяют вольфрамовую проволоку большого диаметра (более 1 мм).
   Вольфрамовая спираль может быть изготовлена в форме кону­са, для того чтобы удерживать порошок или металлические струж­ки. В последнем случае испаряемое вещество в виде гранул или ку­сочков помещают в "корзиночку", образуемую спиралью, через ко­торую пропускают электрический ток (рис. 35, Г).
   Распыление с помощью электронно-лучевой пушки. Процесс эмиссии и ускорения электронов в этом случае сходен с таковым в электронной пушке ЭМ. Ускоряемые электрическим полем элек­троны бомбардируют анод, представляющий собой испаряемый металл. Хотя данная процедура сложнее и дороже, чем обычный метод испарения в электрическом разряде, зато она позволяет получать реплики с наиболее высоким разрешением (рис. 35, Е).

0x01 graphic

   Рис. 35. Приспособления для испарения электронно-плотных металлов и графита
   в вакууме.
   А и Б - графитовые электроды разной формы; В - V-образная вольфрамовая проволока; Г - вольфрамовая спираль; Д - вольфрамовая ванночка (вид сбоку и сверху); Е - электронная пушка (схема): вольфрамовая спираль-катод (1), закру­ченная вокруг графитового электрода (2) с вставленным в него платиновым стер­жнем (3); Ж - испарение металлической проволоки (4), закрученной вокруг графитового стержня (5).
  
   Катодное распыление. Инертный газ, например аргон, ионизи­руется в присутствии электрического поля высокого напряжения, и положительные ионы используются для бомбардировки метал­лической мишени. Для фокусировки пучка применяют примитив­ные электромагнитные линзы. Под действием ионов аргона из ме­таллической мишени выбиваются частицы металла, которые осе­дают на поверхности образца, образуя металлическую пленку. Данные установки не выделяют большого количества тепла и соот­ветственно не повреждают образец. Они обычно используются при исследованиях, требующих высокого разрешения [9, 43, 287, 330].
  

15.3.3. Процессы, происходящие во время напыления

  
   Атомы металлов, падающие на подложку, склонны к агрегиро­ванию. Величина агрегатов зависит от природы атомов и поверх­ности подложки. Явление декорирования подложек представляет собой результат вторичного перераспределения атомов металла после их осаждения на напыляемой поверхности и зависит в ос­новном от заряда поверхности. Загрязняющие вакуум молекулы (пары масел, резиновых уплотнений и др.) также будут центрами агрегирования.
   Атом, который осаждается на поверхности, становится цент­ром нуклеации последующих. Если интенсивность напыления по­вышается, то число центров возрастает, следовательно, покрытие будет более мелкогранулярным. Уменьшение расстояния между образцом и мишенью приводит вследствие этого к снижению гра­нулярности образующейся пленки. Однако в этом случае объект нагревается значительно больше.
  

15.3.4. Измерение толщины пленок

  
   Толщину реплик можно определить экспериментально с по­мощью интерферометра или электронного денситометра. Толщи­ну образующейся пленки распыляемого вещества (Г) можно вы­числить по следующей формуле:

0x01 graphic
,

   где W - масса распыляемого вещества в г, ? - угол наклона на­пыления, R - расстояние между препаратом и распыляемым ве­ществом, ? - плотность вещества, k - коэффициент (обычно при­нимается равным 1). Толщина пленки контролируется визуально или с помощью специальных "толщиномеров". В первом случае рядом с пластинкой, на которую напыляется углерод или другое вещество, помещают белую фарфоровую пластинку или стекло (с кусочком белой бумаги под ним). На них наносят небольшую кап­лю диффузионного масла. Масло предотвращает образование в этом месте углеродной или металлической пленки и формирует область белого фона, которую можно сравнить с расположенной рядом углеродной или металлической пленкой. Разница в окраске позволяет судить о толщине пленки. В тот момент, когда пластин­ка приобретает легкий рыжевато-коричневый цвет, толщина плен­ки составляет 4-7 нм. Появление видимой контрастности между покрытым маслом участком и остальной поверхностью пленки со­ответствует ее толщине, равной приблизительно 10 нм. Светло-се­рый цвет пленки свидетельствует о толщине в 5 нм [9, 43, 287, 330].
  

15.3.5. Процедура получения реплик

  
   В большинстве случаев сухие объекты помещают в вакуумную камеру, вакуум доводят до 10-4 Па. Платину напыляют под углом 45®. Затем под углом 90® напыляют углерод. Далее объекты извле­кают, лезвием бритвы разрезают поверхность реплики на квадра­ты 2 х 2 см и снимают на воду (см. гл. 7). Если реплика не снима­ется, то надо объект обработать плавиковой кислотой. Иногда достаточно использовать липкую ленту, которую наклеивают на реплику. Затем липкую ленту растворяют хлороформом. Небольшие квадратики реплик проводят через нескольких смен хлороформа и помещают в чистый органический растворитель. После этого репли­ку переносят на несколько часов на поверхность раствора гипохлори-та натрия, а затем 50%-ной хромовой кислоты. Эти растворители, как правило, удаляют объект. Иногда требуется обработка реплик дополнительными растворителями или ферментами. Полностью очи­щенные реплики промывают в четырех сменах бидистиллированной воды, монтируют на сеточки и высушивают [9, 43, 287, 330].
  

15.3.6. Анализ изображений

  
   Анализировать реплики следует при больших увеличениях ЭМ. Измерив длину (L) тени и зная угол оттенения (?), можно опре­делить высоту поверхностной структуры или толщину объекта:

0x01 graphic
.

   Для сферической или цилиндрической частицы радиус (R) оп­ределяется по формуле:

0x01 graphic
.

   Для небольших углов оттенения можно использовать следую­щую формулу:

0x01 graphic
,

   где D - диаметр частицы.
  

15.3.7. Ротационное оттенение объектов

   При обычном оттенении объект и испаритель неподвижны по отношению друг к другу, при ротационном - объект во время ис­парения вращается. Последний способ используется для оттенения небольших макромолекул. При этом объект оттеняется со всех сторон, что позволяет выявить наибольшее количество деталей.
  

15.4. РЕПЛИКИ МАКРОМОЛЕКУЛ

  
   Приготовление реплик макромолекул лучше всего осуществлять на свежерасщепленной слюде с помощью напыления вольфрама, ни­обия, тантала и др. Для этого вначале проводят диализ раствора мак­ромолекул против раствора летучих веществ (ацетат аммония, гид­роокись аммония, уксусная кислота и др.), затем разводят его до оп­тимальной концентрации. Полученный раствор распыляют на пластинку слюды так, чтобы верхний конец пластинки смачивался сильнее (для создания градиента плотности фракций). Затем пла­стинку помещают в вакуумную установку, напыляют металлом под острым углом (около 10) и углеродом перпендикулярно поверхности слюды при постоянном вращении объекта. Для снятия реплики ис­пользуют раствор нитроцеллюлозы, который наносят на препарат, подсушивают и снимают. Полученные реплики разрезают на более мелкие части, которые помещают на сеточки. Слой нитроцеллюло­зы затем удаляют растворителем [9, 43, 100, 287, 330].
   Глава 16 ЗАМОРАЖИВАНИЕ-СКАЛЫВАНИЕ-ТРАВЛЕНИЕ
  
   Метод замораживания-скалывания-травления включает три обязательные процедуры: 1) быстрое замораживание; 2) раскалы­вание в замороженном состоянии; 3) изготовление реплик (как правило, углеродно-металлических) со сколотых поверхностей. В связи с тем что не всегда удается достигнуть нужных скоростей за­мораживания, в непрецизионных экспериментах объект префиксируют в альдегиде [21, 32, 152, 187, 347].

16.1. ЭТАПЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

   Раскалывание объектов может осуществляться в различных ус­ловиях: 1) в вакууме, в том числе в сверхвысоком; 2) под сжижен­ным азотом; 3) в атмосфере сухого газа [32]. Вскрытие поверхно­стей осуществляется двумя путями: разрывом и скалыванием с помощью ножа. В первом случае формируются две комплементар­ные поверхности. Этот способ оказался полезен для исследования монослойных культур и суспензий однородных по размеру сфери­ческих частиц (рис. 36).

0x01 graphic

   Рис. 36. Скалывание замороженного монослоя культуральных клеток, выращен­ных на миллипоровом фильтре, с помощью сандвич-метода.
   1 - клетки; 2 - миллипоровый фильтр; 3 - пленка поливинилового спирта; 4 - золотой держатель; 5 - пластинка слюды.
  
   Раскалывание объекта ножом получило наибольшее распрост­ранение, поскольку имеет ряд преимуществ по сравнению с разрывом. Среднее направление скола задается направлением движе­ния ножа, поверхность скола может быть сформирована в любом месте объекта. Качество получаемых при этом реплик в большин­стве случаев выше, чем при разрыве, особенно при использовании специальной микротомной техники.
   Когда суспензия клеток подвергается замораживанию-скалы­ванию обычным способом, скол идет случайным образом, что не , позволяет проводить количественный анализ структурных измене­ний биологических мембран, в частности распределение внутри-мембранных частиц (ВМЧ). Эти ограничения можно преодолеть, если сформировать монослой клеток на положительно заряженной поверхности. Поскольку последняя является достаточно плоской, то получаемые реплики имеют слабо выраженный рельеф и более удобны для анализа.
   Разработан достаточно надежный метод скалывания монослойных клеточных культур (рис. 36). Клетки выращивают на миллипоровом фильтре. Кусочек фильтра помещают на золотой держа­тель, покрытый тонким слоем поливинилового спирта, клетками наружу. Сверху наливают еще один слой поливинилового спирта, на который кладут пластинку свежеотщепленной слюды. Получен­ную систему замораживают в тающем азоте и помещают в аппа­рат для замораживания-скалывания (Balzers BAF 400Т). Нож под­водят под слюду и поднимают, что приводит к разрыву объекта. Причем линия скола, как правило, проходит по клеточному моно­слою. Далее следует обычная процедура репликации [347].
   Вместе с тем нож при своем движении может касаться поверх­ности формирующегося скола и вызывать изменения его структу­ры как в результате чисто механического воздействия, так и разо­грева. Быстрое разрушение кромки ножа, ведущее к увеличению количества артефактов, накладывает определенные ограничения на число повторных сколов с поверхности замороженного объекта, поэтому сейчас предпочитают конструкции с двумя лезвиями. Стружки, образующиеся в результате повторных скалываний, так­же ухудшают качество формирующейся поверхности, загрязняя ее. К сожалению, метод раскалывания ножом позволяет исследовать лишь одну поверхность, а в ряде случаев для адекватной интерпре­тации необходимы комплементарные поверхности.
   При использовании установок, оснащенных микротомами, замороженный объект переносят под защитой холодового экра­на в вакуумную камеру и монтируют на предварительно охлаж­денный предметный столик. Скол производится в условиях высокого вакуума с помощью металлического ножа, смонтирован­ного на микротоме, который имеет приспособления как для механической, так и для термической подачи. Резание (скалыва­ние) осуществляется при любой температуре образца вплоть до -183®С. Реплику наносят на плоскость разлома либо немедленно после последнего скалывания, либо через определенный период времени, необходимый для травления. Такого рода конструкция реализуется в большинстве существующих в настоящее время ап­паратов. Разница заключается лишь в некоторых деталях конст­рукции, например в наличии возвратно-поступательного движе­ния ножа или двух ножей (для предварительного и окончательного скалывания).
   К примеру, в рабочей камере модели BAF-301 на охлажденном столике помещается замороженный образец и под контролем мик­роскопа с помощью микротома осуществляется скол объекта. Ох­лажденный нож микротома совершает при скалывании круговое движение. После этого производится травление сколотой поверх­ности, глубина которого подбирается эмпирически. Подробнее с различными конструкциями фирменных и лабораторных устано­вок для замораживания-скалывания можно ознакомиться в специально посвященных этому вопросу монографиях и обзорных статьях [21, 32, 75, 152, 187, 347].
   Оттенение поверхности скола осуществляется или сразу по­сле ее обнажения (метод замораживания-скалывания), или по­сле проведения некоторых дополнительных операций. Наиболее распространенной из этих операций является сублимация (см. гл. 18) льда с поверхности скола, называемая "травлением". Ско­рость травления зависит от температуры образца и при -110, -100, -90, -80 и -70®С составляет соответственно 0.2, 1.5, 10, 50 и 250 нм/с при вакууме порядка Зх10-5 Па. Давление в вакуум­ной камере должно быть ниже давления насыщающих паров во­ды. Достигнуть таких условий можно с помощью низкотемпера­турных вымораживающих ловушек, располагающихся в непосредственной близости от поверхности скола. Эффективность ловушек повышается по мере приближения этих приспособле­ний к объекту и с понижением их собственной температуры. В установках фирмы "Balzers", снабженных замораживающим микротомом Мура, в качестве ловушки используется нож мик­ротома, который имеет температуру около -185®С и может быть приближен к поверхности скола на расстояние до несколь­ких микрометров.
   Заключительным этапом, общим для всех модификаций метода замораживания-скалывания-травления, является изготов­ление реплики. Визуализация деталей поверхности скола осущест­вляется путем их оттенения тяжелым металлом (см. гл. 15). Слой металла обычно чрезвычайно тонок и механически непрочен. Перпендикулярно к поверхности скола напыляют слой углерода или другого материала, обладающего достаточной прочностью и малой электронной плотностью. Второй слой закрепляет первый, инфор­мационный слой и придает всей реплике механическую прочность (см.гл.15). Разрешающая способность метода замораживания-ска­лывания-травления составляет примерно 2 нм [21, 32, 75, 152, 187,347].
  

16.1.1. Очистка реплик

   После изготовления реплики объект размораживают и извле­кают из вакуумной камеры. Реплику очищают от объекта путем его растворения в подходящем растворителе. Для этого использу­ют различные окислители (чаще всего 5%-ный гипохлорит на­трия, кислоты, например H2SO4 и хромовую кислоту, щелочи и некоторые другие вещества). Есть специальные фирменные реак­тивы для этих целей, например "Хлорокс". При их отсутствии применимы хлорсодержащие бытовые отбеливатели. Главное в этой процедуре - хорошее растворение тканей и максимальная со­хранность реплики.
   Лучшие результаты дает последовательное отмывание реплики в ряде различных растворителей. Если ткань содержит много жи­ровой клетчатки, то на первом этапе отмывания удобно использо­вать смесь спирта и эфира, смесь хлороформа и метанола (2 : 1) или диметилформальдёгид.
   После вскрытия вакуумной камеры объект с держателем по­мещают в тот раствор, из которого объекты были взяты для за­мораживания. Ткань и реплика обычно отделяются от держателя и плавают на поверхности раствора. С помощью платиновой петли объект проводят с 2-минутными интервалами через 30, 20, 10 и 5%-ный растворы глицерина и отмывают (он плавает на поверхности) в воде. Объекты можно затем (или сразу же по­сле взятия из камеры) погрузить в хромпик или раствор гипо-хлорита. После трех смен воды объект помещают в 2%-ный рас­твор гипохлорита натрия (или в 20%-ный отбеливатель) на 30 мин. Нельзя пользоваться концентрированным раствором, поскольку образующиеся пузырьки газа разрушают реплики. Далее реплики очищают в трех сменах неразбавленного отбели­вателя или гипохлорита (по 20 мин) и проводят через ряд растворов с уменьшающейся концентраций окислителя вплоть до воды. После нескольких смен воды реплики обрабатывают хро­мовой кислотой при увеличивающихся ее концентрациях (10, 20 и 30%-ный растворы, по 10 мин в каждом) и тремя порция­ми концентрированной хромовой кислоты (по 20 мин). Далее реплики отмывают в 6-10 сменах воды (по 1-5 мин) для удале­ния остатков хромовой кислоты. Чистые реплики вылавливают на опорные сеточки, так же как это принято делать с УС (см. гл. 7).
   Удовлетворительная реплика должна обладать следующими свойствами: 1) мелкогранулярность (разрешение по точкам лучше 3 нм) и стабильность оттеняющего материала; 2) доста­точная контрастность реплик; 3) хорошее совпадение компле­ментарных поверхностей мембран; 4) рандомизированный ха­рактер распределения ВМЧ на гладких сколах мембраны с мелкогранулярной текстурой поверхности (отсутствие "волн" и других артефактов). Бугристость поверхности реплики в месте прохождения ножа свидетельствует о загрязнении ее парами воды. Качество изображения реплики, получаемой при неблаго­приятном угле оттенения, может быть улучшено путем наклона сеточки с репликой в ТЭМ. В этом случае следует использовать гониометрическую приставку [21, 32, 75, 152, 187, 347].
  

16.2. МЕМБРАННЫЕ ПОВЕРХНОСТИ

  
   В соответствии с современной номенклатурой выявляемые при сколах мембран поверхности именуются PF (protoplasmic face) и EF (extracellular face). В результате вакуумного травления можно выявить две истинные поверхности: экстрацеллюлярную и про-топлазматическую. В соответствии с действующей номенклатурой, поверхность любой биологической мембраны, обращенная к ци­топлазме, обозначается символами PS (protoplasmic surface), комп­лементарная ей поверхность (extracellular surface) обозначается ES. Для оценки получаемых изображений можно использовать мате­матические методы анализа [32,197].
  

16.3. СОЧЕТАНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-СКАЛЫВАНИЯ С ДРУГИМИ МЕТОДАМИ АНАЛИЗА

16.3.1. Иммуноцитохимический анализ и использование лектинов

   Традиционные метки (ферритин, гемоцианин и др.) при ис­пользовании замораживания-скалывания оказались непригодны­ми, поскольку их очень трудно идентифицировать на репликах и отличить от ВМЧ. Кроме того, если ферритин не оттенен, то на ре­плике он практически не виден. Наибольшее применение получи­ло КЗ [62, 102].
   Мечение тканевых и клеточных компонентов во время замора­живания-скалывания может быть проведено на следующих этапах: 1) перед замораживанием; 2) сразу после скалывания (перед на­пылением платиной); 3) сразу после напыления платиной; 4) по­сле окончания процедуры репликации.
   В первом случае изолированные клетки метят лектинами или антителами, конъюгированными с КЗ или ферритином. В прин­ципе возможно проведение двух и трехэтапного мечения. Затем после замораживания и скалывания проводится глубокое травле­ние, что обусловливает обнажение Е-поверхности плазмалеммы с адгезированным на ней маркером ниже плоскости скола. Далее осуществляется репликация. Чтобы уберечь частицы КЗ от оттене­ния платиной, можно использовать метод "мечения-заморажива-ния" (lable-fracture). После обработки клеток или тканей лиганда-ми, связанными с КЗ, проводят замораживание-раскалывание-оттенение. Объект не растворяют, а интенсивно и многократно промывают водой. Анализируют в этом случае только EF-поверх­ность реплики. При этом метка наружной поверхности плазма-леммы "просвечивает" сквозь реплику. В принципе можно также выявить метку сквозь реплику Р-поверхности скола вместе с телом всей клетки. Однако это удается в крайне редких случаях. Исследо­вания с использованием стереопар показали, что частицы золота находятся на наружной стороне мембраны. Эта методика имеет су­щественные ограничения, поскольку спектр ее применения огра­ничивается субклеточными фракциями, клеточными культурами, взвесями или апикальными плазмалеммами клеток, выстилаю­щих полые органы.
   Мечение можно проводить после вскрытия клеток с помощью гипотонического раствора или другими способами (см. гл. 17), что дает возможность метить внутренние структуры, а затем исследо­вать отношение метки к интегральным структурам мембран. Для мечения внутриклеточных структур перед замораживанием-ска­лыванием клетки разрывают с помощью осмотического шока. Для иммуномечения мембран, остающихся на реплике после промы­вания в воде (метод "мечение после скалывания"), реплики инкубируют с первыми антителами, затем промывают и инкубируют с комплексом вторых антител с КЗ, вновь промывают и высушива­ют. Иммуномечение цитоскелетных белков клетки осуществляют обычно после их обработки детергентами, например раствором Тритона Х-100 [32, 75, 152, 319].
   Во втором случае объекты метят после замораживания-ска­лывания и оттаивания, которое проводят в присутствии фикса­тора. В дальнейшем возможны два пути препарирования: 1) заливка объектов и получение УС (перпендикулярно сколу) или 2) высушивание и напыление с последующим изготовлени­ем реплики [319].
   В третьем случае возможны два варианта препарирования. В первом варианте объекты замораживают, скалывают и оттеняют платиной. После оттаивания реплики не очищают от объекта, а постфиксируют и заключают в заливочную среду. Толстые УС делают параллельно оттененному сколу. Для просмотра толстых УС используют высоковольтный ТЭМ. Данный метод получил назва­ние УС-реплика. Мечение обнажающихся во время скола белков осуществляется после оттаивания образца. В качестве маркера используют КЗ.
   Если объекты вначале замораживают, скалывают и реплициру­ют, затем оттаивают и инкубируют с лигандом, оттененные репли­ки очищают и анализируют, то после оттаивания возникает пря­мой контакт гидрофобной зоны монослоя липидов с жидкостью. Это приводит к сворачиванию монослоя. Поэтому ВМЧ, как пра­вило, не выявляются. В некоторой степени этот недостаток был ус­транен путем сочетания следующих процедур: замораживания, скалывания, оттенения платиной, оттаивания и инкубации с мече­ным лигандом. Далее используют лиофилизацию или высушива­ние в критической точке (ВКТ) и напыление углеродной пленки. После растворения тканей и очистки реплики просматривают в ТЭМ. Этот метод позволяет лигандам связываться с ВМЧ. Таким образом, во втором варианте вместо заливки после мечения про­водят высушивание, напыление реплики углеродом и травление объекта.
   Наконец, мечение клеток можно осуществлять после реплика­ции. В этом случае реплики с клетками обрабатывают мечеными иммунореагентами, которые проникают между клетками и связы­ваются с молекулами на Е-поверхности плазмалеммы. Далее можно клетки заключить в заливочную среду и получить УС, парал­лельные сколу, а можно реплику просто отмыть в воде и сразу же исследовать в ТЭМ. Иногда изготавливают крио-УС после замо­раживания-скалывания (без репликации и оттаивания) с последу­ющей их обработкой мечеными иммунореагентами или лектинами [21, 32, 75, 152, 319].
  

16.3.2. Выявление липидов

   Для выявления 3?-гидроксистеролов и анионных фосфолипидов используют филипин, томатин, дигитонин. Установлено, что филипин, связываясь с 3?-гидроксисодержащими стеролами, наи­более распространенным среди которых является холестерин, об­разует молекулярные комплексы в соотношении 1:1. Эквимолярные отношения с холестерином характерны также для дигитонина и томатина [32, 319]. В результате обработки этими веществами формируются типичные деформации (дефекты) мембраны, кото­рые хорошо выявляются в ЭМ; они представляют собой агрегацию единичных молекулярных дефектов. Фиксация альдегидами, как правило, не ингибирует латерального перемещения единичных комплексов филипин-холестерин и др. [32, 319].
   Итак, при агрегации филипин-стероловых комплексов на мем­бранах образуются филипин-стероловые деформации, которые на комплементарных поверхностях имеют вид округлых выступов или ямок диаметром около 25 нм. На УС в этих случаях выявля­ется характерная картина "завитков". Число филипин-стероловых деформаций поддается количественной оценке.
   Механизмы образования деформаций не полностью выяснены. Деформации мембраны связывают с изменением ее поверхност­ного натяжения с той стороны, где образуются агрегированные филипин-стероловые комплексы. Выступы и углубления наблюда­ются на одной и той же мембране, что свидетельствует об асим­метричном распределении в ней липидов. Образование комплек­сов снижается в присутствии сфингомиелина, но возрастает с уве­личением концентрации филипина. Повышение осмотического давления в среде ингибирует этот процесс [32, 319].
   Высокоспециализированные мембраны меньше деформируют­ся под действием филипина. Это связано, по мнению ряда иссле­дователей, с присутствием большого числа интегральных протеи­нов (т.е. ВМЧ) или с жесткой стабилизацией липидного бислоя примембранными фибриллярными структурами (см. Приложе­ние, 16).
   Дигитотин и томатин при связывании с мембранными стеролами образуют длинные слегка вогнутые (на EF-поверхности) или выпуклые (на PF) округлые желобки или гребни шириной 40-60 нм. Эти складки интенсивно переплетены друг с другом, при продолжительном инкубировании они могут замыкаться и отде­ляться от мембраны с формированием дискретных внемембранных трубочек. После воздействия сапонинов, как правило, прева­лируют поперечные сколы мембран, а тангенциальные встречают­ся значительно реже. Выявляемые дефекты в случае использования сапонинов чрезвычайно вариабельны, необходима предварительная или одновременная фиксация, так как сапонины больше, чем филипин, повреждают мембраны клетки.
   Механизмы проникновения филипина и сапонинов в клетки различаются. Сапонины проникают в клетку через поврежденные участки плазматических мембран (обнаружение сапониновых де­фектов на внутриклеточных мембранах сопряжено, как правило, с сильным повреждением плазматической мембраны), а филипин связывается вначале со стеролами плазматической мембраны и, по-видимому, затем свободные молекулы филипина диффундиру­ют в клетку (в этом случае значительных повреждений плазмати­ческой мембраны может не быть).
   Обработку филипином и сапонинами производят перед замораживанием-скалыванием. Филипин практически нерастворим в воде, поэтому перед добавлением фиксатора или буфера его необ­ходимо растворить в небольшом объеме диметилсульфоксида или диметилформальдегида, при этом довольно легко достигнуть кон­центрации 50-200 мкг/мл. Чаще всего используют 0.3 М раствор филипина, приготовленный на 0.1 М какодилатном буфере. Сапо­нины обычно применяются в тех же концентрациях. Инкубация производится в темноте при комнатной температуре и при посто­янном помешивании.
   Следует помнить, что как филипин, так и сапонины проника­ют в ткани только на небольшую глубину. Наиболее подходящими объектами для анализа распределения мембранных стеролов явля­ются клеточные суспензии или монослойные клеточные образова­ния, например однослойные эпителии. Можно использовать сре­зы, сделанные на вибратоме. Лучшие результаты получаются в случае продолжительности инкубации 3-24 ч.
   Другими маркерами холестерина являются стрептолизин и F-гемолизин, образующие на мембранах дефекты в виде выступа­ющих колец или дугообразных структур диаметром 30-50 нм. К сожалению, агрегация ВМЧ при этих обработках серьезно лими­тирует их применение. Из всех описанных маркеров наиболее эф­фективен и широко распространен филипин. Он меньше всех раз­рушает мембраны. Образуемые деформации относительно невели­ки, дискретны и легко поддаются подсчету.
   Пептидный антибиотик полимиксин В селективно связывается с отрицательно заряженными группами липидов. Даже в низких концентрациях он соединяется с мембранами большинства грамотрицательных бактерий. Обработка этим антибиотиком ничем принципиально не отличается от таковой в случае филипина и сапонина. Перед фиксацией клетки инкубируют при температуре 20-30®С в забуференном растворе полимиксина В. Затем их замораживают и скалывают. Концентрация антибиотика варьирует от 1 до 300 мкг/мл, а продолжительность инкубации - от 1 до 60 мин. Препарат медленно и равномерно проникает в ткани. На PF-поверхности скола возникают деформации в виде гладких воз­вышений. Размеры и форма деформаций во многом сходны с тем, что выявляется после филипина. Некоторые мембраны также об­наруживают асимметрию в распределении дефектов [32, 319].
  

16.3.3. Криоавторадиография

   Новым направлением в развитии метода замораживания-ска­лывания-травления стало его сочетание с АРГ. Эта комбинация позволила соединить преимущества обоих методов и в настоящее время используется в ряде лабораторий. Разработаны специальные установки для проведения такого рода исследований [32, 75, 152, 338].
   Существует несколько приемов нанесения фотоэмульсии на напыленную поверхность. Лучшим способом является покрытие сколов эмульсией при низкой температуре. Поскольку при обыч­ном способе получения монослоя фотоэмульсия высыхает, а вы­сохший монослой не прикрепляется к поверхности объекта, то к эмульсии добавляют глицерин. Он медленно испаряется в вакууме и не дает высохнуть фотоэмульсии. Непосредственно перед покры­тием скола эмульсией на него или на монослой эмульсии, что проще, наносят небольшое количество (около 1 мкл) 4-пропанола или бутанола. Монослоем эмульсии с каплей пропанола покрыва­ют сколотую поверхность, имеющую температуру -130®С. Через несколько минут жидкость испаряется и монослой плотно приле­гает к сколу. Затем объекты помещают в сосуд Дьюара на плаваю­щей подставке и экспонируют при -100®С в течение 6-12 недель. После оттаивания проявляют и закрепляют автограф. Зерна сереб­ра на реплике можно стабилизировать, напыляя добавочный слой углерода. Эта процедура необходима лишь в том случае, если в по­следующем применяют сильные окислители, такие как хромпик. Следует иметь в виду, что нанесение второго слоя углерода требует повторного вакуумирования, а это может существенно повреждать реплики [32, 111].
   Для анализа монослойных клеточных культур разработан ме­тод, сочетающий крио-ЭМ с АРГ. После инкубации с мечеными зондами монослой клеток замораживают, скалывают и подвергают травлению. После этого меченые мембраны или монослои клеток высушивают и покрывают фотоэмульсией при комнатной температуре. Мембраны клеток можно вначале метить с помощью АРГ. Далее объекты подвергают замораживанию-скалыванию и отмы­вают в воде. Реплики, снятые на сеточки, покрывают фотоэмуль­сией и проявляют обычным путем [32].
  

16.4. АРТЕФАКТЫ

   В соответствии с последовательностью этапов препарирования образцов для замораживания-скалывания-травления вероятные артефакты можно разделить на следующие большие группы: 1) связанные с подготовкой образцов к замораживанию; 2) обус­ловленные процессом замораживания; 3) возникающие во время процессов раскалывания и травления; 4) возникающие в результа­те процессов оттенения; 5) обусловленные способами очистки ре­плик; 6) формирующиеся во время просмотра препаратов в ТЭМ (подробно об артефактах данного метода см.: [32]).
  
   Глава 17 СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

17.1. МАКРОМОЛЕКУЛЫ

   Для визуализации пространственной организации макромоле-кулярных комплексов на поверхности клеток часто используется метод репликации гидратированных клеток, клеточных компонен­тов и изолированных молекул после замораживания-высушива­ния или замораживания-травления [232, 280].
   При исследовании методом оттенения нуклеиновых кислот можно наносить их на гидрофильную подложку (например, све­жий скол слюды) с помощью пульверизатора. Нуклеиновую кис­лоту растворяют в буфере, составленном из легко сублимирующих компонентов, например в аммониево-ацетатном, и с помощью пульверизатора наносят на поверхность слюды. Концентрация рас­твора, его количество и расстояние до него подбирают опытным путем. Оттенение обычно производится платиной или сплавом платины с палладием. Затем наносят тонкий слой углерода. Полу­ченные реплики отделяются от поверхности слюды в воде. Таким же образом можно получать реплики с белковых кристаллов, рибо­сом, фагов и вирусов (см. Приложение, 17.1 и 17.2).
   Молекулы нуклеиновых кислот суспензируют в стабилизирую­щем растворе - гиперфазе (содержит ацетат аммония, ЭДТА, цитохром С и 0.1-0.5 мкг нуклеиновой кислоты на 100 мкл обще­го объема раствора). Гиперфаза должна свободно стекать вниз по сверхчистому предметному стеклу либо ее наслаивают на поверх­ность воды или разведенного раствора (гипофаза). Поверхность гипофазы обычно покрывают порошком талька или графита в ви­де монослойной пленки. Макромолекулы, распластываясь по ги-пофазе, оттесняют частицы талька. Сеточкой с подложкой аккурат­но прикасаются к чистым областям (именно они содержат нукле­иновую кислоту), так чтобы молекула кислоты адсорбировалась на подложке. Объекты обычно контрастируют в растворе, представля­ющем собой смесь 0.05 М УА и 0.05 М НСl в 95%-ном этаноле. После промывания в воде сеточку помещают на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Сеточки с объектами (макромо­лекулами вверх) оттеняют при вращении в условиях высокого ва­куума с помощью испарения металла (см. Приложение, 17.1 и 17.2). Молекулы ДНК можно контрастировать раствором ФВК на 70%-ном этаноле, а затем оттенять металлом при вращении. На­конец, ДНК можно негативно контрастировать в нейтральной ФВК, после чего просто адсорбировать на тонкую углеродную под­ложку - она в этом случае видна в ТЭМ.
   Гораздо реже используют двухступенчатый метод. Сеточку с формваровой подложкой смачивают в 1-2 мл ацетона в течение 1-2 мин. Прежде чем ацетон испарится, на размягченную поверх­ность формвара помещают исследуемые объекты и добавляют еще одну каплю ацетона. Пленку не менее 5 мин сушат под лампой, после чего объект снимают с пленки, на которой остается отпеча­ток. Качество отпечатка и чистоту его поверхности проверяют с помощью СМ. Замеченные остатки объекта можно удалить мягкой кисточкой. Отпечаток оттеняют металлом, а затем укрепляют с помощью напыления углеродом. Формвар растворяют с по­мощью хлороформа. Для удаления загрязнений реплику можно обработать в растворе, содержащем 1.5 г KMnO4 и 1.5 г K2CrO7 в 15 мл концентрированной серной кислоты. Реплику затем промы­вают в разбавленной соляной кислоте.
   Для исследования сложных трехмерно организованных белко­вых молекул используется метод сверхбыстрого замораживания раствора этих молекул и глубокого травления с последующей их репликацией [128, 140, 232].
   При исследовании вирусов и макромолекул часто необходимо использовать сверхтонкую (1 нм) углеродную подложку. Для этой цели вначале готовят дырчатую подложку (микросеточку) из фор­мвара, на нее в вакууме напыляют слой углерода толщиной 20 нм. Микросеточку покрывают пластиковой подложкой (3 %-ный кол­лодий). На пластиковую подложку в вакууме напыляют очень тон­кий (1 нм) слой углерода. Сеточку помещают в вакуумный пост и отжигают при температуре 420-430®С в условиях высокого вакуу­ма. При этом и формвар, и коллодий удаляются, и сверхтонкая уг­леродная пленка оказывается лежащей на дырчатой углеродной подложке (микросеточке) [288, 311].
   С помощью ЭМ можно визуализировать процесс взаимодейст­вия белков и нуклеиновых кислот [213, 229]. Углеродную Подлож­ку травят в тлеющем электрическом разряде для получения поло­жительного заряда на поверхности. Положительный заряд на по­верхности угольной подложки обеспечивает надежную связь с отрицательно заряженными молекулами ДНК, которые в растворе быстро прикрепляются к подложке, не изменяя своей трехмерной структуры [3, 36, 272, 294].
  

17.2. ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

   Особенностью прокариотов является тот факт, что их ДНК не содержит достаточного количества связанных белков, а имеющие­ся быстро теряются в начальный момент фиксации с помощью ГА. Поэтому ГА практически не фиксирует ДНК прокариотов. Для лучшей сохранности ультраструктур рекомендуется обязательная обработка прокариотов с помощью кислых растворов ЧО и УА, в большей степени стабилизирующих их ДНК (см. Приложение, 17.9 и 17.10) [9].
   Для фиксации комочков клеток из культур микроорганизмов, выращенных на твердых средах, или из осадка, полученного цент­рифугированием из жидких сред, применяют 1.5%-ный раствор KMnO4, приготовленный на вероналацетатном буфере. Значение рН раствора устанавливают в зависимости от объекта (например, кишечную палочку фиксируют при рН 7.2-7.6, дрожжевые клетки дают лучшие результаты при рН 4.5, фиксация продолжается в течение 0.5-1 ч). Растительные объекты препарируют практически так же, как и животные. Однако иногда их фиксируют 1%-ным раствором перманганата калия [9].
  

17.2.1. Тотальные препараты

   Ряд биологических объектов можно исследовать в ТЭМ тоталь­но: вирусы, бактериальные клетки и их споры, фаги, макромолеку­лы нуклеиновых кислот, кристаллы белков и других биополиме­ров. При нанесении суспензий из этих объектов на сеточки с под­ложками необходимо избегать их загрязнения. С поверхности колонии бактерий, культивируемых на твердой питательной среде, микробиологической петлей снимают верхний слой клеток, кото­рый переносят в подходящий буферный раствор, где клетки суспензируют. Полученную суспензию наносят на сеточки с пленкой. Споры актиномицетов можно получить с помощью капли воды, стекающей по поверхности воздушного мицелия и тд.
   Можно нанести исследуемый объект на сеточку с подложкой и держать во влажной камере несколько минут. В течение этого вре­мени некоторая часть веществ, клеток или макромолекул оседает на пленку и прочно к ней прилипает. Затем сеточку промывают водой, переносят на фильтровальную бумагу и высушивают. Если эту процедуру проводить при низкой температуре, то количество адсорбированных частиц увеличивается [9].
   При изучении вирусов кусочки зараженной ткани тщательно растирают, выделившуюся жидкость переносят в небольшое коли­чество раствора. Полученную суспензию наносят на сеточку с под­ложкой. Однако во взвеси могут быть обрывки ткани.
  

17.3. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ

   Возможны следующие способы очистки объектов от питатель­ной среды: центрифугирование, диализ, фильтрация в агаре.
   В первом случае осадок после центрифугирования суспензиру­ют в дистиллированной воде, в физиологическом или буферном растворах. Если однократная очистка окажется недостаточной, то следует ту же процедуру повторить еще раз. Для предохранения объекта от разрушения его фиксируют в ФА или ЧО.
   Метод капельного диализа состоит в том, что на коллодиевую подложку, плавающую на поверхности воды, наносят капли сус­пензий исследуемых объектов: бактерий, вирусов, фагов. Чашку Петри закрывают и ставят в термостат при температуре 26-30®С. Подложка в этом случае применяется в качестве диализирующей мембраны. Срок диализа - от 3 до 24 ч (в зависимости от состава среды, температуры и толщины диализирующей пленки). Очи­щенный от среды объект остается на коллодиевой пленке. По окончании диализа к нижней стороне пленки под местами локали­зации капель прикрепляют опорные сеточки.
   Во избежание морфологических изменений, связанных со ста­рением, автолизом, потерей жгутиков и другими аналогичными процессами, объекты рекомендуется фиксировать, для чего откры­тые чашки Петри с каплями на пленках помещают под стеклян­ный колпак на 15-20 мин, например в пары 40%-ного нагретого формалина.
   Можно вначале разместить на подложке опорные сеточки, на­крыть их фильтровальной бумагой и дать ей намокнуть, затем снять подложку с поверхности воды, а после высушивания на под­ложку над сеточками поместить каплю объекта; весь "бутерброд" фильтровальной бумагой вниз надо положить на поверхность диализирующей жидкости. При этом диализ идет через подложку, сеточку и фильтровальную бумагу. По окончании диализа бумагу с сеточками снимают с поверхности воды и подсушивают. Препа­раты, если необходимо, оттеняют металлом на этой же бумаге ли­бо контрастируют другими методами. Метод прост, обеспечивает стерильность и удобен для маркировки препаратов (записи можно делать на той же фильтровальной бумаге).
   Для очистки объектов путем фильтрации на поверхность 3%-ного агара наносят 2-3 капли исследуемого объекта в обычной для него среде и стеклянным шпателем осторожно распределяют их по поверхности агара. Чашку Петри закрывают, чтобы предотвратить испарение влаги, и оставляют на 10-20 мин для фильтрации сус­пензирующей среды в толщу агара. Затем на поверхность агара пипеткой наливают 0.2%-ный раствор коллодия в амилацетате и быстро и равномерно распределяют его по поверхности. После ис­парения растворителя образуется коллодиевая пленка, покрываю­щая объект. Кусочек агара с пленкой вырезают и переносят на по­верхность воды, где пленка, к нижней поверхности которой при­липла часть объекта, легко отделяется от агара. На пленку помещают сеточки и снимают их вместе с пленкой с поверхности воды с помощью фильтровальной бумаги. Однако к пленке прили­пает не все разнообразие частиц, находящихся в данном препара­те, а только случайные частицы. Недостатком является и то обсто­ятельство, что исследуемый объект длительное время находится в непосредственном соприкосновении с водой, что может вызвать его разрушение.
   С целью ликвидации указанных недостатков процедуру можно проводить в иной последовательности. Гбтовят 1.5-3.0%-ный агар с примесью солей, входящих в суспензирующую жидкость. После того как агар застынет, его поверхность промывают очищенным петролейным эфиром, чтобы удалить жировые пятна и другие за­грязнения, и подсушивают вентилятором до полного удаления влаги, после чего на подготовленную таким образом поверхность наносят 0.2-0.4%-ный раствор коллодия в амилацетате и быстро и равномерно распределяют его по поверхности агара. Чашки пере­ворачивают на бумагу и сушат в таком положении в течение 6 ч. На полученную пленку, покрывающую агар, помещают 2-4 капли суспензии исследуемого объекта и стерильным шпателем распре­деляют их по поверхности пленки, стараясь ее не повредить. Быс­тро закрывают чашку и выдерживают 10-20 мин. Скорость филь­трации зависит от органических компонентов фильтруемой сус­пензии. В частности, белки быстрее закупоривают поры агара. После фильтрации препарат фиксируют парами формалина в те­чение 7-10 мин, затем из агара вырезают маленький блок (нельзя использовать влажные участки) и переносят в 2%-ный раствор азотнокислого лантана пленкой вверх. На поверхности жидкости пленка легко отделяется от агарового блока и всплывает. Под пленку подводят опорные сеточки, вылавливают и высушивают на фильтровальной бумаге.
   Можно микроорганизмы выращивать на коллодиевой пленке. После получения коллодиевой пленки на поверхности агара, как описано выше, на нее пастеровской пипеткой наносят бактериаль­ную суспензию или суспензию бактерий, зараженных фагом. Вы­сота капель должна быть не более 1 мм, а диаметр 1-2 мм. Затем чашку Петри выдерживают в термостате при соответствующей температуре в течение требуемого промежутка времени. Когда рост колоний достигает желаемой стадии, подлежащий изучению уча­сток агара вырезают и переносят в чашку с водой - пленка легко отделяется от агара и всплывает.
   Вместо агара можно применять жидкую питательную среду. Чашку Петри заполняют стерильной водой, на поверхности кото­рой получают коллодиевую пленку. Воду из-под пленки удаляют и заменяют ее слоем питательной среды толщиной 4-5 мм. На пленку наносят суспензию бактерий и выращивают их до опреде­ленной стадии в термостате. Затем питательную среду дважды промывают водой. Выбранные участки пленки укрепляют на опор­ных стеках.
   Для уменьшения количества загрязнений подложку с сеточка­ми снимают с поверхности воды с помощью фильтровальной бу­маги и помещают на агар или питательную среду. Этот же способ удобен для изучения фаголизиса и действия различных химиче­ских агентов на бактериальные клетки. Для этого фаги или хими­ческие вещества добавляют в питательную среду.
   При работе с клеточными фракциями или микроорганизмами нельзя допускать, чтобы толщина осадка превышала 05 мм. После фиксации в ГА лучше отмыть и ресуспензировать осадок в теплом (t=45®С) агаре или агарозе на буфере. Застывшие объекты мож­но нарезать и препарировать как кусочки ткани [9, 287].
  

17.4. МЕТОД ПСЕВДОРЕПЛИК

   Данный метод является одним из способов подготовки препа­ратов для ТЭМ. Сеточкой с подложкой осторожно прикасаются к поверхности бактериальной колонии или к стерильному пятну на месте лизиса бактерий фагом, при этом бактерии или фаговые частицы прилипают к пленке.
   Можно на поверхность образца вылить 0.2%-ный раствор кол­лодия, который после испарения дает тонкую коллодиевую пленку. Кусочки агара, покрытые пленкой, вырезают и переносят на воду. Пленка легко отделяется от агара и всплывает на поверхность во­ды. К ее нижней поверхности прилипают бактерии или фаги. На поверхность пленки помещают сеточки, затем пленку с сеточками покрывают куском фильтровальной бумаги, снимают с поверхно­сти воды и высушивают.
   Для исследования ограниченных участков колонии можно с помощью стеклянного капилляра вырезать нужные участки агара и тонкой иглой протолкнуть их к другому концу капилляра. Уча­сток агара с объектом не должен выходить за пределы капилляра более чем на 1 мм. Этим концом прикасаются к коллодиевой пленке, к которой прилипают микрочастицы образца. Следует, од­нако, учитывать, что к подложке может прилипнуть только опреде­ленная часть объекта. Соответственно, информация об объекте бу­дет неполной. Кроме того, на сеточке обычно много загрязнений [9, 287].
  

17.5. ИССЛЕДОВАНИЯ ОСАДКОВ, МАЗКОВ И КЛЕТОЧНЫХ МОНОСЛОЕВ

   Предложены различные устройства для осаждения взвешенных эукариотных клеток с помощью центрифугирования непосредст­венно на предметное стекло либо осаждения и концентрирования их на миллипоровых фильтрах, которые потом готовят для иссле­дования в ТЭМ или СЭМ. Например, взвесь клеток накапывают на стекло, которое погружают в контейнер с раствором ГА. Затем на мазок накапывают раствор ЧО, инкубируют во влажной камере, обезвоживают и пропитывают в заливочной среде. Заполняют кап­сулы доверху смолой, помещают туда бумажные маркеры, переворачивают, накрывают капсулами мазки, полимеризуют в термо­стате. После затвердевания проводят локальный подогрев места, где приклеена капсула, что позволяет пальцем легко отделить кап­сулу с объектом от стекла (см. с. 54, рис. 3). Образовавшиеся мо­нослои можно использовать для дальнейших манипуляций: мар­кировать поверхности лектинами и антителами, подвергать замо­раживанию-скалыванию, репликации и т.д. Целые клетки могут быть выращены на подложке и в дальнейшем исследованы с по­мощью высоковольтной ТЭМ (ВТЭМ) или СЭМ [3].
   Для исследования осадков биологических жидкостей можно рекомендовать следующий метод. На стекло при t=60®С налива­ют 10%-ный раствор желатины и остужают, его. Лезвием бритвы на слой желатины наносят квадратную решетку. На поверхность желатины помещают большую каплю биологической жидкости (моча, слюна и др.) и выдерживают во влажной камере. На осадок осторожно наслаивают 1%-ный раствор ГА (этот этап можно иск­лючить, а вместо него зафиксировать объект в парах ЧО). Далее препарат подвергают ВКТ (можно высушить на воздухе) и про­сматривают сначала в СМ, а затем в СЭМ. Вместо желатины мож­но использовать 0.1%-ный раствор полилизина.
   Клетки могут осаждаться на миллипоровый фильтр. Нефикси­рованные клетки прочно прилипают к фильтру через 20 мин ин­кубации при t=37®С. Далее клетки окрашивают, подвергают ВКТ, исследуют в СМ, а затем напыляют металлом и изучают в СЭМ. Сам фильтр не мешает светооптическому исследованию.
   Для прикрепления клеток к субстрату можно использовать сле­дующие виды взаимодействий: 1) электростатические, например между отрицательно заряженными протеинами и положительно заряженной подложкой (угольная пленка); 2) ковалентные, напри­мер между трансмембранными протеинами и покрытой ГА под­ложкой; 3) другие типы взаимодействий, например между транс­мембранными гликопротеинами и покрытой конканавалином А подложкой (рис. 37 и 38) [271].
   Чаще всего покровные стекла, используемые для осаждения (при центрифугировании) изолированных частиц, рекомендуется обрабатывать поли-Ь-лизином (погрузить в 0.025%-ный раствор полилизина на деминерализированной воде на 10 мин, трижды промыть в той же воде и высушить на воздухе).
   Нередко возникает необходимость выбрать для исследования в СЭМ структуры (клетки), имеющие особые тинкториальные свой­ства. Для этого вначале окрашенный препарат (мазок) просматри­вают в СМ. После окрашивания препарат нельзя высушивать на воздухе - он должен быть покрыт слоем жидкости. Препарат по­мещают на рабочий столик прибора для измерения микротвердо­сти, например ПМТ-3, затем вместо объектива к интересующему объекту через слой воды подводят индентор (алмазную пирамид­ку) и вдавливают его в выбранный микроучасток подложки рядом с клеткой. Далее препарат обезвоживают и подвергают ВКТ [63]. При анализе суспензий биологических объектов в ТЭМ с по мощью УС вначале на парафильм помещают маленькую каплю расплавленного агара (t=50®С), до застывания в центр ее мик­ропипеткой инъецируют густую взвесь изолированных частиц, и всю систему быстро охлаждают на льду (5 мин). Далее следует обычная процедура фиксации и препарирования [282]. Можно по­грузить тонкую стеклянную палочку в раствор агара, охладить и застывший слой агара использовать в качестве корпуса шприца, а палочку - в качестве поршня для накачивания внутрь получив­шейся капсулы взвеси микрочастиц. Края капсулы запаивают пу­тем погружения в расплавленный агар и последующего охлажде­ния [183].

0x01 graphic

   Рис. 37. Метод мечения протоплазматической поверхности плазмалеммы. А - прикасание к поверхности культивируемых клеток (1) пластинкой (2) с нане­сенным на нее адгезивным покрытием (например, полилизин); Б - при отделении пластинки приклеившаяся к ней плазмалемма (3) отрывается от клетки; В - ме-чение структур на протоплазматической поверхности плазмалеммы с помощью лиганда (4); Г - оттенение платиной и напыление углеродом (направление пока­зано стрелками); Д - снятие реплики на поверхность жидкости (5); Е - вылавли­вание реплики на сеточку (6).

0x01 graphic

   Рис. 38. Метод приготовления реплики с поверхности изолированных клеток. А - клетки (1), осажденные на поверхности стекла (2) или культивируемые на ней; Б - напыление слоя (3) металла и углерода на поверхность клеток; В - снятие реплики (4) на поверхность воды.
  
   Если исследуют цитологические отпечатки на отмытой рентге­новской пленке, то их фиксируют в ГА и окрашивают, например по Папаниколау [38]. При заключении отпечатков, для того чтобы избежать раздавливания клеток, между пленкой и покровным стеклом помещают тонкие полоски той же пленки. Подлежащие исследованию клетки отмечают на обратной стороне рентгено­вской пленки. Покровные стекла отделяют при обработке ксило­лом. Далее объекты по 5 мин последовательно обрабатывают смесью этанола и ксилола, 100%-ным этанолом, смесью этанола и изоамилацетата, 100%-ным изоамилацетатом и подвергают ВКТ. После исследования в СЭМ объекты погружают в растворы этано­ла нисходящей концентрации, выдерживают 20 ч в ФБ и готовят для ТЭМ. Нужный участок маркируют с помощью стереомикроскопа [191, 206].
   В случае исследования в ТЭМ монослоя клеток на стекле (или пластике) его заливают с помощью капсул, заполненных заливоч­ной смолой и перевернутых на нужный участок монослоя. Стекло легко отделяется от застывшей заливочной смолы, если его локально охладить сухим льдом или жидким азотом, особенно если это сделать сразу же после нагревания препарата в кипящей воде. Удаление объектов облегчается, если стекло до начала культивиро­вания клеток покрыть коллагеном. Для получения УС, перпендикулярных монослою, объект рекомендуется перезалить в нужном положении. Если клетки выращивают на пластике, который легко режется (метакрилаты, силиконовая резина, пластинки из эпок­сидной пластмассы), то клетки можно не отделять.
   Клетки, растущие на фальконовском пластике, легко отделяют­ся от субстрата с помощью окиси пропилена. Однако растворитель не должен контактировать с пластиком более 60 с, поскольку это ведет к переносу пластификатора из пластмассы в клетки и может блокировать последующую полимеризацию заливочной смолы.
  

17.5.1. Культура ткани

   Выращивание клеток на подложке, например формваровой, по­зволяет после префиксации, постфиксации с помощью 40, гисто­логического окрашивания, обезвоживания и ВКТ исследовать одну и ту же клетку в СМ, ТЭМ, СЭМ и с помощью РМА. Однако при этом надо быть уверенным в отсутствии токсического воздействия подложки на растущие клетки.
   Исследователь, работающий с тканевыми культурами, должен помнить, что пластиковые чашки растворяются в ацетоне, а иног­да и в этаноле. Полипропиленовая посуда резистентна к этим воз­действиям. При добавлении жидкости в культуральные чашки ее надо медленно и аккуратно наслаивать, для того чтобы избежать повреждения монослоя.
   Для культивирования клеток с последующим ЭМ-анализом предложена пленка из меламиновой пластмассы (гексаметилолме-ламиновый эфир), поверхность которой содержит свободные ами­ногруппы, способные реагировать с альдегидами так же, как они реагируют с протеинами. Это позволяет плотно сшивать клетки с подложкой и использовать ее для подготовки объектов как для СМ, так и для ТЭМ и СЭМ (см. Приложение, 17.8). Подложка из меламина устойчива к стерилизации в пламени, она гладкая и гомо­генная, выдерживает дегидратацию и ВКТ [360].
   Культивируемые на пластике клетки можно окрашивать гисто­логическими красителями in situ, без изготовления ПС. Для этого после префиксации, постфиксации и обработки en bloc с помощью УА разрезать монослой на квадраты, окрасить в течение 5 с в све-жеотфильтрованном растворе, содержащем 1 % метиленового си­него, 1 % азура II и 0.5 % буры, обезводить в этаноле, а затем на дно пластиковой чашки направить струю окиси пропилена так, чтобы квадратные кусочки всплыли на поверхность жидкости. В дальнейшем объекты заключают в эпоксидную смолу с помощью метода плоскопараллельной заливки [210, 226].
   Мазки или отпечатки тканей можно зафиксировать (не следует забывать об обработке с помощью ЧО), окрасить гистологическим красителем, заключить в бальзам, изучить под СМ. Затем можно покровное стекло снять с помощью ксилола, подготовить объекты для СЭМ, исследовать, а затем заключить в смолу для изучения в ТЭМ (см. Приложение, 17.3 и 17.7). Применение стандартных концентраций ГА и ФА уменьшает окрашиваемость образцов обычными гистологическими красителями, поэтому, если желательно одновременное исследование в СМ, нужно использовать разбавленные фиксаторы [206].
   При изучении культивируемых клеток применяют метод пере­ворачивания капсул со смолой на объект. Иногда после полимери­зации заливочной смолы стекло или пластик, на котором росли клетки, отделяют с помощью погружения в жидкий азот. Пластин­ку с объектами разрезают на мелкие квадраты (4x4 мм), помеща­ют в плоские формы, заполненные смолой, и полимеризуют [226].
   Если необходимо применить сочетанное СМ- и СЭМ-исследо-вание, то вначале культуру ткани, окрашенную после фиксации ге­матоксилином, под слоем жидкости исследуют в СМ. Затем с по­мощью прибора для измерения микротвердости на подложку на­носят вдавление рядом с исследуемой клеткой, объекты обезвоживают, подвергают ВКТ и исследуют в СЭМ. Вдавление легко идентифицируется в СЭМ- Маркировка клеток возможна и после их высушивания [3, 37, 294].
  

17.6. СОЧЕТАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ СМ И ЭМ НА ОДНОМ ОБЪЕКТЕ

   В последние годы при проведении диагностических и экспери­ментальных исследований все чаще возникает потребность в привлечении для уточнения диагноза и расшифровки патогенеза заболеваний методов высокого разрешения: ТЭМ и СЭМ, замора­живания-скалывания, молекулярных зондов, иммуно-ЭМ и т.д. Вместе с тем большинство использующихся в настоящее время способов взятия и подготовки материала для патогистологичес-кого исследования исключает возможность привлечения в после­дующем для анализа ЭМ-методов высокого разрешения.
   Поэтому разработан алгоритм взятия и препарирования мате­риала, позволяющий по мере необходимости привлекать методы высокого разрешения для уточнения диагноза [3]. В зависимости от планируемого в дальнейшем (для уточнения диагноза) использования базового морфологического метода высокого разрешения выделяют следующие препаровочные группы объектов: 1) матери­ал, где основными (базовыми) станут методы ТЭМ, заморажива­ния-скалывания, иммуно-ЭМ; 2) материал, где базовым станет метод СЭМ нативных и экстрагированных препаратов; 3) матери­ал, где основным станет метод коррозионных препаратов. В каж­дой из групп схема подготовки материала имеет определенные особенности. В то же время выделение групп по методическому принципу подчеркивает лишь, что наиболее воспроизводимые ре­зультаты будут получаться по базовому методу, хотя в той же группе возможно использование и других морфологических мето­дов высокого разрешения с той лишь разницей, что воспроизводимость результатов будет хуже.
   В то же время при планировании морфологических исследова­ний необходимо четко представлять определенные ограничения в сочетаемости методов высокого разрешения. Так, при использова­нии метода СЭМ коррозионных препаратов становится невозмож­ным применение на тех же объектах метода замораживания-скалывания-травления и т.п. Например, кусочки, сосуды (или другие полости) которых заполнены застывшей инъекционной массой, могут использоваться для светооптического исследования. Для этого во время обезвоживания после 100%-ного этанола или аце­тона блоки выдерживают в течение 2 сут в трех сменах хлорофор­ма для удаления инъекционной массы (метакрилатов) и вновь по­мещают в 100%-ный этанол (ацетон). Если перед введением инъекционной массы сосуды перфузировались фиксатором на базе ГА или ФА, то такие объекты пригодны и для исследования в ТЭМ [3].
   Подготовку и выбор тканей из маленьких биопсийных проб лучше осуществлять с помощью стереомикроскопа. Например, когда разрезают биопсию почки на образцы для светооптического, иммуногистохимического и ТЭМ-исследования, необходимо, что­бы клубочки присутствовали во всех объектах.
  

17.6.1. Топическая ЭМ

   В настоящее время УС изготавливают после точной идентифи­кации окружающих структур. Для точной локализации исследуе­мых структур разработаны специальные методические приемы, которые можно обозначить термином "топическая ЭМ". После обычной фиксации в ГА или ФА, постфиксации в ЧО и дегидра­тации серийные срезы толщиной 30 мкм режут на вибратоме и заливают в аралдит в специальных прозрачных коробочках не­большой толщины. Такие плоскопараллельные пластинки со сре­зами удобны для светооптического анализа и прицельного выделе­ния нужного кусочка для ЭМ. Разработаны методы точного, стан­дартизированного иссечения объектов из плоских препаратов с последующим прецизионным монтированием их на капсуле с за-полимеризованной смолой [37]. Очень важно строго локализовать изучаемые в ТЭМ клетки по отношению к окружающим структу­рам. Перед началом съемки на ЭМ (или в конце ее) фотографиру­ется целый УС: Затем один из углов УС устанавливается в центр поля зрения, что отмечается в качестве начала оси координат. В дальнейшем для каждой фотографируемой структуры отмечаются ее координаты.
   Можно медленно (в процессе полимеризации) раздавливать заключенные в заливочную смолу образцы между стеклами, полу­чая тотальные препараты с последующим изготовлением УС.
  

17.6.2. ТЭМ после СМ

   Одной из задач, стоящих перед исследователями при сочета­нии СМ и ЭМ, является выделение индивидуальных клеток при светооптическом анализе с целью их последующей идентифика­ции в ЭМ. Известен ряд решений этой задачи. Например, живые клетки, выращенные на различных субстратах, изучают в СМ и маркируют для последующей ТЭМ с помощью рельефных меток, наносимых на субстрат механическими инструментами. Сущест­вуют методы маркирования светооптических препаратов с целью идентификации клеток, выбранных для сагиттальной ультратомии [37]. Выпускаются комбинированные оптические и ТЭМ-микро-скопы, которые позволяют исследовать тот же самый срез с по­мощью СМ и ТЭМ.
   Если начальным этапом субмикроскопического анализа явля­ется исследование ПС, то после просмотра ПС на него в нужном месте накладывают заполненную незаполимеризованной смолой капсулу (в перевернутом виде, смолой вниз). ПС с капсулой поме­щают в термостат для полимеризации. После отделения капсулы с ПС от стекла ее распиливают, и полученные половинки исследуют отдельно. Иногда поступают иначе: на ПС делают царапину, разде­ляющую две его части, которые нужно анализировать отдельно. На каждую из частей опрокидывают по капсуле со смолой и выдержи­вают их в термостате. Обе полученные капсулы можно использо­вать для приготовления УС (рис. 39). После полимеризации кап­сулы с заполимеризованными образцами легко отделяются от стекла с помощью термического шока (стекла последовательно по­мещаются в кипящую воду и в жидкий азот) [3, 37, 251, 294].
   Разработана эффективная методика перезаключения целлоиди­новых и парафиновых срезов для ТЭМ (см. Приложение, 17.4): срезы, заключенные в целлоидин, отделяют от стекла и заливают в эпоксидную смолу [288].
   Возможен также подход, основанный на комбинированном им-муноцитохимическом исследовании одного и того же участка пу­тем перезаливки ПС и получения УС. Для этого эпоксидный ПС инкубируют в насыщенном растворе этоксида натрия (см. Прило­жение, 6.6.5) или 10%-ной перекиси водорода в течение 1-10 мин, затем проводят реакцию иммуномечения и серебряного усиления. После окрашивания срезы заключают в смесь глицерина и 0.01 М раствор ФБ и фотографируют в СМ. Затем удаляют покровные стекла, срезы обезвоживают и заливают в каплю заливочной сре­ды. После полимеризации в течение 12 ч при t=60®С заключен­ные в смолу срезы отделяют от стекла. Материал вторично залива­ют в эпоксидную смолу и изготавливают УС перпендикулярно плоскости ПС (см. Приложение, 17.5).

0x01 graphic

   Рис. 39. Способ перезаливки двух структур (1 и 2) из ПС (3) в два блока с по­мощью двух заполненных смолой капсул (4 - проекции этих капсул).
  

17.6.3. СМ после ТЭМ

   С другой стороны, при бомбардировке толстых УС электрон­ным пучком в ВТЭМ (см. ниже) происходит сублимация эпоксид­ной смолы и их толщина уменьшается. Далее эти же срезы без всякой обработки или после окрашивания могут использоваться для СМ-исследований.
  

17.6.4. СЭМ после CM

   Во многих современных СЭМ имеются приставки, в которых вначале объект изучают под СМ и метят для СЭМ- или ТЭМ-ана-лиза. Для последовательного светооптического и СЭМ-исследова-ния тканевых объектов можно использовать парафиновую заливку или заключение в эпоксидные либо полиэфирные смолы. Особен­но удобно заключать их в полиэфирную восковую смесь. После изготовления микросрезов объекты обрабатывают 100%-ным эта­нолом, подвергают ВКТ и исследуют в СЭМ [272]. После заключе­ния объектов в целлоидин среду из блоков можно удалить с по­мощью ацетона. Если применялся терпинеол, то его растворяют изопропиловым спиртом (4 смены по 48 ч). Разработаны удобные для патологоанатомов методы подготовки залитых в парафин бло­ков для СЭМ.
   В ряде случаев для сочетания СМ и СЭМ клетки помещают на субстраты, на поверхности которых (еще до СМ) уже имеются маркеры. Нанесение метки на субстрат может быть осуществлено механическим способом или тушью в процессе изучения объекта в СМ [63, 64, 294]. В качестве метки может использоваться ЭМ-се­точка. Ее "тень" будет служить своеобразной системой координат. Так, для последовательного исследования изолированных клеток в СМ и СЭМ на покровное стекло приклеивают опорную сеточку. Стекло обрабатывают 0.1%-ным раствором поли-L-лизина на ФБФР (рН 7.2) и высушивают. Затем на него наносят взвесь от­мытых клеток и оставляют на 14 ч при t=4®С во влажной каме­ре для осаждения и прикрепления клеток к стеклу. Далее следует ВКТ. Перекладины сеточки позволяют при СМ-исследовании точ­но локализовать клетку и найти ее в СЭМ [283] (см. Приложение, 17.3 и 17.7).
  

17.6.5. ТЭМ после СЭМ

   Если необходимо подготовить объекты для ТЭМ после СЭМ-исследования, то их выдерживают (до 12 ч) последовательно в двух сменах пропиленоксида, а затем заливают в эпоксидную смо­лу и получают УС [3, 37, 294]. Однако при этом следует помнить, что хорошее изображение мембран можно получить только в том случае, если применялась постфиксация в ЧО. Поэтому мы реко­мендуем при подготовке объектов для СЭМ всегда использовать постфиксацию с помощью ЧО.
   Наконец, возможно параллельное препарирование объектов для ТЭМ и СЭМ. Так, после выделения изолированных клеток (например, из крови) их фиксируют в ГА или ФА, постфиксируют в ЧО, обезвоживают в дегидратанте (например, в ацетоне) и гото­вят для ТЭМ (смолу заливают непосредственно в центрифужные пробирки) или для СЭМ (из ацетона взвесь раскапывают на тща­тельно обезжиренные кусочки фольги). В процессе заливки для
   ТЭМ перед каждой сменой жидкости объекты центрифугируют и ресуспензируют в новой порции рабочей жидкости (см. Приложе­ние, 17.5).
  

17.6.6. СЭМ после ТЭМ

   Материал, залитый в эпоксидные смолы, может быть использован для анализа в СЭМ. Для этого смолу удаляют 3%-ным раствором NaOH на 100%-ном этаноле в течение 48-60 ч в зависимости от размера объектов (не более 1-7 мм) [196]. Эпон легко удаляется также с помощью насыщенного (обязательно фильтровать перед использованием) раствора NaOH в этаноле. Ра­нее считалось, что раствор должен созревать в течение 3-4 сут, од­нако специальные исследования не обнаружили изменения экс­трагирующей силы раствора в процессе созревания [108], который уже через 4 ч готов для использования. Экстрагирование эпоксид­ной смолы можно проводить дозированно, блокируя процесс путем трехкратного промывания объекта с помощью 100%-ного этанола. Скорость обнажения структур, например залитых в Эпон 812, составляет 33 мкм/ч. Перед ВКТ этанол в объектах лучше градуально заменить изоамилацетатом (см. Приложение, 17.6).
  

17.7. ВЫСОКОВОЛЬТНАЯ ЭМ

   Первый электронный микроскоп с ускоряющим напряжением 1000 кВ был построен в г. Тулузе (Франция). Несколько коммер­ческих инструментов такого типа было создано в конце 60-х годов фирмой Хитачи (Япония). В последние годы стали использовать­ся ТЭМ с ускоряющим напряжением 200-400 кВ. Эти микроско­пы дешевле и не требуют специальных помещений. С их по­мощью можно просматривать срезы толщиной до 1 мкм. Разре­шающая способность ВТЭМ достигает 0.11 нм.
   ВТЭМ позволяет проводить микроскопию живых объектов. Разработана специальная камера, в которой во влажной атмосфере могут изучаться бактерии и другие мелкие биологические объек­ты. Анализ толстых срезов и целых клеток с получением стереопар позволяет построить трехмерные изображения структурных элементов клеток и тканей. На базе ВТЭМ разработаны томогра­фические системы [149] для исследования субклеточных компо­нентов.
   Одним из существенных недостатков ВТЭМ является низкая контрастность изображений. Этот недостаток удается преодолеть за счет введения в объект электронно-плотных красителей [331].
  
  

17.7.1. Подготовка объектов для ВТЭМ

   Если исследуют фиксированные клетки, то их прикрепляют к субстрату с помощью протамина сульфата или полилизина. В ряде случаев клетки просто выращивают на данном субстрате. Однако, поскольку медные сеточки оказывают токсическое действие на клетки, последние следует выращивать на подложке, которая при­креплена к стеклу. В большинстве случаев в качестве субстрата для культивирования клеток с последующим ВТЭМ-анализом приме­няют формваровую подложку, покрытую углеродом. После фиксации и обезвоживания клеток подложку снимают со стекла. Надо стараться, чтобы искомая клетка и центр сеточки совпали. Для этого обычно используют стереомикроскоп [90].
   Одним из основных артефактов при изучении целых клеток во ВТЭМ является их растрескивание. Это связано со сжатием клеток, вызываемым обезвоживанием и высушиванием - твердые суб­страты, такие, как стекло, не сжимаются, что приводит к растре­скиванию клеток. Формвар тоже не сжимается, однако его тонкая пленка может деформироваться, а это позволяет клеткам оставать­ся целыми и не растрескиваться. То же самое происходит, если ис­пользуются органические субстраты: желатина, коллагеновый гель, белковый гель и т.д. В этом случае субстрат трескается сам, но клетки сохраняют свою целостность. Фиксацию культивируе­мых на подложке клеток осуществляют обычным способом, пре­фиксацию желательно проводить при t=37®С. При ВКТ целых клеток для предотвращения деформаций они должны быть предва­рительно обработаны таниновой кислотой (ТК) или УА. Для уменьшения сжатия можно также использовать лиофилизацию. Создание проводящего покрытия и контрастирование осуществля­ют обычным способом [90, 147]. Более качественные результаты получаются, если используют лиофилизацию вместо ВКТ.
   Следует учитывать, что морфология клеток заметно изменяет­ся при взаимодействии с субстратом [90]. Последний должен не только обеспечивать прикрепление клеток, но и быть устойчивым к процедурам препарирования. Пластмассовые субстраты очень часто коробятся во время ВКТ и при воздействии органических растворителей. Для ТЭМ-исследований субстрат должен быть электронно-прозрачным.
   Для ВТЭМ могут применяться пластиковые срезы толщиной 0.25-1.0 мкм, которые легко приготовить из залитых в смолу тка­ней. Наиболее оптимальной является смесь эпона с аралдитом, так как она более проницаема для красителей. Для получения УС не толще 0.25 мкм можно использовать алмазный нож, а для более толстых лучше применять стеклянные ножи. Срезы расправляют­ся под воздействием паров ксилола. Ленты срезов желательно монтировать на бленды, покрытые формваровыми подложками, которые приготовлены из 05%-ного раствора формвара. Срезы лучше вначале отконтрастировать, а затем покрыть стабилизирую­щим слоем угля [296].
   Можно из срезов удалить смолу, а затем подвергнуть их ВКТ. Для этих целей в качестве заливочной среды используют полиэти-ленгликоль, который легко извлекается из срезов водой. Однако получить хорошие срезы с помощью данного метода достаточно трудно. Объекты нередко заливают в полимер метилметакрилата, который обычно растворен в дихлорметане. После испарения рас­творителя при комнатной температуре получается довольно твер­дый пластик, позволяющий легко получитьУС. Пластмасса затем экстрагируется из срезов тем же растворителем. Этот метод сохра­няет ультраструктуру объектов значительно лучше [158].
   Для анализа в ВТЭМ можно использовать толстые крио-УС, которые после оттаивания подвергают ВКТ. Использование криос-резов имеет преимущества при иммуноцитохимическом анализе. Однако фиксация в этом случае должна быть мягкой, что дает воз­можность более точно локализовать антигенные детерминанты. На толстых УС, исследуемых в ВТЭМ, антигенных детерминант зна­чительно больше, чем на обычных срезах.
   Контрастирование объектов для ВТЭМ не имеет каких-либо принципиальных особенностей. Хорошие результаты достигаются при использовании в качестве контрастера 7.5%-ного раствора уранил-магнезиумацетата на воде в течение 2-4 ч при t=50®С и дальнейшем контрастировании с помощью ЦС в течение 20 мин.
   В целом можно сказать, что весь арсенал методов для ТЭМ ис­пользуют также и в ВТЭМ. Сочетание селективного окрашивания и ВТЭМ позволяет исследовать весьма толстые срезы (до 10 мкм) и получать информацию об их трехмерной организации. Окраши­вание толстых УС для ВТЭМ требует гораздо больше времени, чем в случае УС. После контрастирования сеточки с толстыми УС для ВТЭМ желательно напылить углем с двух сторон для большей ста­бильности срезов под электронным пучком [220].
   Глава 18 СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ
   Подготовка объектов для СЭМ нативных препаратов включает отмывание крови (при изучении сосудов), фиксацию препаратов, обезвоживание, высушивание, монтирование, формирование электропроводящего покрытия. Термином "нативные препараты" в СЭМ принято обозначать объекты (как свежие, так и фиксиро­ванные), поверхности которых не подвергались специальным фи­зическим и химическим воздействиям (травлению или детергент-ному, ультразвуковому и химическому экстрагированию) [29, 30, 65, 303]. Мы рекомендуем во всех случаях при подготовке объек­тов для СЭМ использовать постфиксацию в ЧО. Это позволяет впоследствии получать удовлетворительные ТЭМ-изображения с тех же самых объектов (см. гл. 17, а также Приложение, 3.72, и 18.2).
  

18.1. ПОСМЕРТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

   При исследовании секционного материала необходимо учиты­вать посмертные изменения. Так, рельеф поверхности эндотелия крупных артерий изменяется уже через 30 мин после смерти. В дальнейшем нарушения нарастают вплоть до появления к концу первых суток дефектов в эндотелиальном пласте. Процесс этот за­висит от условий хранения трупного материала и от способа обез­боливания. Ткани, взятые под эфирным и под нембуталовым нар­козом, различаются по своей структуре [2, 23]. Требования к отмыванию и фиксации для СЭМ нативных препаратов были сформулированы ранее (см. раздел 1.35.1.1).
   Для изучения в СЭМ внутренней поверхности микрососудов (и других полостей) желательно пользоваться перфузионной фикса­цией. Замораживание и скалывание (срезание) таких объектов (см. ниже) позволяет вскрывать мелкие внутриорганные полости (например, просвет микрососуда) и обнажать отмытую люминаль-ную поверхность (например, эндотелия).
  

18.1.1. Иссечение объектов

  
   Если осуществляется продольный разрез фиксированного сег­мента аорты с последующим его прикалыванием к плоской повер­хности, то в зонах входов в межреберные артерии возникают арте­факты, в частности, образуются веретенообразные эндотелиоциты. Чтобы избежать этих изменений, рекомендуется делать два про­дольных боковых разреза и не подвергать образцы распластыва­нию. Если все же имеется необходимость в развертывании сосуда, то в процессе прикрепления нельзя растягивать сосуд, так как это приводит к появлению мельчайших складок. Еще более нежела­тельно расправление кровеносных сосудов до фиксации [23].
   В отличие от крупных сосудов обнажение поверхности эндоте­лия микроциркуляторного русла сопряжено с большими трудно­стями. Наиболее простой способ - разрезание длительно фикси­рованных образцов лезвием бритвы. Однако поверхность сосуда в этом случае оказываетеся в глубине препарата. Кроме того, разрезание сопровождается образованием повреждений на линии разреза. Для получения ровного края и лучшего обнажения поверхности микрососудов предложен метод замораживания-раскалывания под жидким азотом. Как правило, для уменьшения кристаллизацион­ных повреждений применяют криопротекторы. Замороженные объекты после раскалывания или срезания рекомендуется полиро­вать с помощью мелкой наждачной бумаги [23]. Для стандартиза­ции рельефа подлежащей изучению поверхности после пропиты­вания в криопротекторе (например, растворах ДМСО возрастаю­щей концентрации) и замораживания сколотые поверхности объектов шлифуют пленкой, покрытой мелкими (0.3 мкм) части­цами оксида алюминия и помещенной на охлажденную до t=-190®С медную пластинку [98]. Можно также исследовать се­рийные срезы (например, парафиновые), из которых удалена сре­да заключения. Для вскрытия и визуализации лимфатических сосудов применяют перекись водорода и микродиссекцию с после­дующей химической диссоциацией [320] (см. Приложение, 18.3) или вакуумную инъекцию [291].
  

18.2. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ВЫСУШИВАНИЕ

  
   Обезвоживание принципиально не отличается от описанного ранее (см. гл. 3). Наиболее критическим этапом метода СЭМ на­тивных препаратов является высушивание.
  

18.2.1. Высушивание из жидкого состояния

  
   В первые годы применения СЭМ в биологических исследова­ниях этот метод использовался повсеместно. Данный метод имеет, однако, очень серьезный недостаток. В процессе испарения жидко­сти, в которую погружен биологический объект, граница раздела фаз "жидкость-воздух" проходит через объект, поэтому он подвер­гается значительному механическому натяжению. Микроскопиче­ская структура типа микроворсинки диаметром 1 х ю 5 см при высушивании на воздухе испытывает давление вдоль оси, равное примерно 28 атм [5, 65]. Даже при замене воды органическим растворителем с более низким поверхностным натяжением (ацетон, этанол и др.) действие последнего на объект при его высушивании на воздухе оказывается достаточным, чтобы обусловить, во-пер­вых, сжатие объекта до 40 % от его первоначального объема, во-вторых, сглаживание рельефа клеточной поверхности в результате "полегания" и "слипания" различных поверхностных образований (микроворсинок, ресничек и т. п.), в-третьих, формирование лож­ных морфологических структур, имитирующих истинные при­жизненные образования клеточной поверхности [23, 65].
   В связи с опасностью возникновения указанных артефактных изменений высушиванию на воздухе в настоящее время подверга­ют лишь "твердые" биологические объекты (минерализованные ткани и др.). Однако до сих пор некоторые исследователи, несмот­ря на высокую артефактогенность, используют метод высушива­ния на воздухе (из жидкости). Так, предложено увеличивать меха­ническую прочность клеток к высушиванию на воздухе путем ин­фильтрации тканей в сополимеризующейся смеси ГА и карбогидразида. Это не только улучшает выявление микрорельефа, но и позволяет получать УС. Данный метод имеет преимущества в иммуноцитохимии, катодолюминесценции, РМА [165]. Отмывать клетки в этом случае рекомендуется с помощью этанола. Неплохие результаты дает высушивание объектов из гексаметилдисилазана (коммерческое название Peldri II) и из тетраметилсилана [130].
   Мы убеждены, что данный способ можно использовать только в том случае, если не ставится задача изучения микрорельефа по­верхностей. Поэтому большей частью для высушивания тканевых объектов повсеместно используют методы, позволяющие избежать деформирующего действия поверхностного натяжения. Такими методами являются высушивание методом перехода критической точки (ВКТ) и высушивание из твердого состояния (сублимация).
  

18.2.2. Высушивание путем перехода критической точки

  
   Наиболее широкое распространение получил метод ВКТ [65], который основан на переводе жидкости, содержащейся в объекте, в газообразное состояние сразу по всему объему объекта. Для этого жидкость с погруженным объектом помещают в замкнутый сосуд и подвергают нагреванию до температуры выше критической, по­сле чего жидкость переходит в газообразное состояние и весь объ­ект оказывается в газовой среде (высушенным). Таким образом можно избежать деформирующего действия сил поверхностного натяжения, стремящихся сократить поверхность раздела жид­кость-газ, которая при высушивании на воздухе проходит как раз по поверхности образца, подлежащего исследованию в СЭМ.
   Подвергать ВКТ обводненные объекты нецелесообразно, так как для воды характерны очень высокие значения критической температуры и давления. Поэтому воду в объекте необходимо за­местить переходной жидкостью, обладающей значительно более низкими критическими параметрами. В качестве таковой исполь­зуют сжиженные газы: углекислоту, фреон 13, закись азота и др. (табл. 5). Указанные жидкости плохо смешиваются с водой и пря­мо заместить ее не удается. В связи с этим фиксированный обвод­ненный образец вначале подвергают обезвоживанию с помощью дегидратанта, который в свою очередь может замещаться проме­жуточной жидкостью, например амилацетатом, если переходная жидкость не смешивается с дегидратантом. В большинстве иссле­дований в качестве переходной жидкости применяется углекисло­та. Наличие следов воды или этанола в углекислоте при ВКТ мо­жет привести к слипанию фибриллярных структур. Кроме того, уг­лекислота не должна содержать примесей масла.

Таблица 5. Физические свойства веществ, используемых для ВКТ

  

Вещество

Критическая температура,®С

Критическое давление, атм

CO2

31.1

72.8

N20

36.5

71.4

Фреон-13

28.9

38.2

  
   В большинстве исследований в качестве дегидратанта (см. гл. 4) используют этанол, ацетон, этиленгликоль, 2,2-диметокси-пропан, а промежуточными жидкостями являются амилацетат, этанол, ацетон. Замещение воды с помощью этиленгликоля вызывает самые незначительные изменения в объеме объекта. Этанол менее токсичен и летуч, чем ацетон, удаляет меньше липидов, не так сильно изменяет объем объектов, легче смешивается с амила­цетатом.
   ВКТ осуществляют с помощью специальных аппаратов раз­личной степени сложности - от полностью автоматизированных до полукустарных. Практически процедура ВКТ заключается в сле­дующем. Объект, погруженный в промежуточную жидкость или в дегидратант, вносят в предварительно охлажденную (до 10-15®С или ниже) прочную металлическую камеру, в которую затем впу­скают газообразную переходную жидкость из баллона. Если это углекислота, то она поступает в охлажденную камеру под давле­нием около 60 атм и из-за разницы температур между баллоном и камерой происходит очень быстрое перетекание углекислого газа в камеру с мгновенным переходом в жидкое состояние внутри нее.
   Однако чаще с помощью сифона в камеру напускают сразу жид­кую углекислоту со дна баллона.
   Для того чтобы избавиться от дегидратанта или промежуточ­ной жидкости, проводят частичное "стравливание" переходной жидкости через выпускной клапан при сохранении поступления в камеру свежих порций переходной жидкости. Поступление ее в ка­меру в этот момент можно перекрыть, но в таком случае надо вни­мательно следить через окошко, чтобы уровень жидкости не опу­стился ниже поверхности образца.
   Затем камеру вновь наполняют переходной жидкостью (жид­кой углекислотой). Эту процедуру повторяют несколько раз, конт­ролируя запах газа, выходящего из камеры. Тщательное и полное удаление промежуточной жидкости или дегидратанта является очень важным моментом для ВКТ. Поэтому, если их запах не ис­чез, процедуру надо повторить еще раз. При использовании дегид­ратанта или промежуточной жидкости, не имеющих запаха, коли­чество стравливаний заведомо увеличивают. Если дегидратант или промежуточная жидкость удалены не полностью, то критическая температура смеси не будет соответствовать критической темпера­туре чистой переходной жидкости и при переходе в газообразное состояние может произойти конденсация промежуточной жидкости или дегидратанта. Существует некий минимум содержания де­гидратанта или промежуточной жидкости в переходной жидкости, ниже которого конденсация не происходит. Для смеси ацетона с жидкой углекислотой содержание ацетона не должно превышать 0.41 %, в смеси фреона-113 с фреоном-13 объемное содержание первого не должно быть выше 2.4 %. Это показывает, что при ис­пользовании комбинаций амилацетата с углекислотой или ацето­на с углекислотой число необходимых "стравливаний" должно быть значительно большим, чем при комбинации фреона-113 с фреоном-13, причем фреон-113 как промежуточная жидкость имеет преимущество, поскольку при его использовании такое тщательное замещение не требуется [23, 65].
   Большинство людей способны ощущать запах амилацетата в воздухе при концентрации 1 часть на несколько миллионов. Поэ­тому в случае амилацетата по запаху можно легко определить ко­нец процедуры замещения ("промывания"). Однако амилацетат диффундирует гораздо медленнее, чем этанол. Поэтому при заме­не им этанола минимальное время замещения должно быть более 15 мин в каждой (3 : 1, 1 : 1, 1 : 3) смеси. Последнюю порцию амилацетата, из которой образцы переносят непосредственно в ка­меру установки ВКТ, рекомендуется (вместе с объектами) охла­дить до t=0®С. Ацетон, хотя и имеет характерный запах, однако в очень малых концентрациях определяется с трудом. Практиче­ски момент окончания "промывания" можно определять следую­щим образом: у выпускного клапана надо подержать фильтроваль­ную бумагу и если после испарения сухой углекислоты она не бу­дет влажной, то "промывание" закончено.
   При использовании баллона с сифоном следует помнить, что в процессе замещения дегидратанта (или промежуточной жидкости) на переходную жидкость при закрывании выпускного клапана (при открытом напускном) и нагревании камеры жидкая переход­ная жидкость (например, углекислота) может быстро вытесняться обратно в баллон. В таком случае объекты высушиваются из жид­кого состояния, что приводит к нарушению рельефа поверхности.
   После полного удаления промежуточной жидкости (или дегид­ратанта) камеру, заполненную переходной жидкостью, герметизи­руют и нагревают до температуры, превышающей критическую. С подъемом температуры возрастает и давление в камере. По дости­жении критической температуры плотности жидкости в камере и насыщающего пара над ней становятся равными и граница между ними пропадает. Если температура поддерживается выше крити­ческой, то это состояние сохраняется, и газ может быть выпущен из камеры, причем объект останется сухим [65].
   Очень важным моментом является степень заполнения каме­ры с помощью переходной жидкости. В случае частичного запол­нения камеры жидкость при нагревании будет кипеть. А каждый пузырь, представляя собой границу раздела фаз, несет опасность повреждения объекта под воздействием поверхностного натяже­ния. При полном заполнении камеры во время нагревания давле­ние будет возрастать быстрее и превысит критическое раньше, чем это произойдет с температурой. Поэтому желательно с помощью выпускного клапана поддерживать достигнутый уровень чуть вы­ше критического давления, до тех пор пока температура тоже не превысит критическую. В этот момент камера содержит только газ, который можно выпускать. Следует избегать перегрева камеры для предотвращения растрескивания объекта [23, 65]. После высу­шивания выпуск газа из камеры должен производиться медленно. Быстрый выпуск может вызвать адиабатическое снижение темпе­ратуры до субкритической и реконденсацию газа. О конденсации газа можно судить по запотеванию окошка. То же самое наблюда­ется и в момент, когда давление падает до уровня критического, если недостаточно полно удалена промежуточная жидкость (или дегидратант). Чем медленнее выпускается газ (при условии термо-статирования камеры), тем качественнее процесс высушивания. Быстрый выпуск газа может вызвать образование в объекте тре­щин и разрывов. При ВКТ образцы лучше держать исследуемой поверхностью вниз - она будет меньше загрязняться. Однако из-за сильного движения жидкости может происходить срывание не­которых частиц с исследуемой поверхности.
   Очень ответственным является момент достижения критиче­ской температуры переходной жидкости. Если промежуточная жидкость или дегидратант удалены не полностью, то в момент до­стижения критической температуры при нагревании содержимое в камере мутнеет, а при выпуске газа в момент прохождения крити­ческого давления стекло камеры запотевает. Все это свидетельст­вует о неправильном режиме высушивания. В таком случае объект рекомендуется выбросить, поскольку рельеф поверхности будет искажен артефактным воздействием сил поверхностного натяже­ния.
   В большинстве лабораторий используют следующую схему препарирования: вначале объекты обезвоживают в этаноле или ацетоне, затем погружают в амилацетат и помещают в маленькие перфорированные контейнеры. Последние очень быстро переносят в нижнюю половину камеры аппарата для ВКТ, которую немед­ленно закрывают крышкой, плотно прижимаемой к отверстию ка­меры. В этот момент нельзя допускать конденсации паров воды на внутренней поверхности охлажденной камеры и высыхания объек­тов (поэтому желательно на дно камеры налить немного дегидра-танта или промежуточной жидкости). В этот момент оба клапана камеры должны быть закрыты. После закрывания крышки надо быстро открыть впускной клапан, при этом жидкая углекислота под давлением проникает в камеру. Прибор должен показывать давление внутри камеры от 50 до 60 атм. Если показатель ниже, то либо имеется течь, либо баллон с углекислотой пустой [5].
   Заполненную жидкой углекислотой камеру оставляют на 5-10 мин, для того чтобы амилацетат диффундировал в жидкую углекислоту. Выпускной клапан открывают, и смесь углекислоты и амилацетата выпускают в атмосферу. Процесс испарения необхо­димо контролировать через окошечко в крышке и не допускать об­нажения поверхности объектов - они должны быть покрыты сло­ем жидкой углекислоты. Затем выпускной клапан закрывают, от­крывают впускной клапан. Камеру, которая вновь заполнилась жидкой углекислотой, опять оставляют на 5-10 мин. Весь процесс "промывания" повторяют несколько раз, до тех пор пока амилаце­тат не будет удален полностью. Для того чтобы диффузия амила­цетата в углекислоту проходила быстрее, рекомендуется использо­вать магнитную мешалку [65].
   После полного удаления амилацетата все клапаны закрывают, камеру нагревают до 39-42®С. Повышение температуры должно происходить медленно - не более 2®С/мин. Поскольку объем ка­меры стабилен, происходит переход углекислоты в критическое состояние, что можно заметить по потокам газа через окошко в крышке. Давление при этом достигает почти 90 атм. Если в каме­ре перед нагреванием не осталось ни одного пузырька газа, то дав­ление может быть и больше. Если при нагревании камеры не уве­личивается давление, то это значит, что в камере находится не жидкость, а газ либо имеется течь. После достижения соответству­ющей температуры выпускной клапан чуть-чуть открывают (ско­рость выпуска не более 1-2 мл/с) и стравливают углекислый газ. Необходимо иметь возможность подогревать выпускной вентиль, в противном случае на нем может быстро нарастать сухой лед, ме­шающий градуальному выпуску газа [65].
   Метод ВКТ не свободен от недостатков. В процессе обезвожива­ния и последующего ВКТ объект претерпевает существенные из­менения в объеме. При низких концентрациях дегидратанта объект набухает, а затем прогрессивно сжимается. После завершения ВКТ сжатие может достигать значительных величин (до 60 % от первоначального объема), что иногда приводит к повреждению клеток. Метод ВКТ не только дает высокую степень усадки (до 60 % объема), но и ведет при неумелом использовании к возник­новению разрывов и трещин в объектах, особенно неоднородных по своему составу. Например, в конфлюэнтных слоях клеток на пластиковой и особенно на стеклянной подложке растрескивание обнаруживается практически всегда. Для уменьшения усадки предложено после осмирования обрабатывать препараты 1-2%-ным раствором таниновой кислоты (ТК). Степень усадки можно снизить с 58 до 5 % путем добавления в фиксатор бычьей сыво­ротки и инкубации объектов перед высушиванием в растворах ТК и УА [23].
   Перед удалением объекта из камеры надо подготовить эксика­тор с влагопоглощающим веществом и быстро перенести туда об­разец. При ВКТ лучше использовать аппараты с окном в крышке, для того чтобы осуществлять визуальный контроль за процессом ВКТ. Баллон должен быть с трубкой, доходящей до дна, для извле­чения жидкой углекислоты. В резерве необходимо иметь еще один полный баллон с углекислотой.
   Если для заполнения камеры с объектами используется метод конденсации, то, поскольку стоящий на полу баллон с углекисло­той имеет меньшую температуру, чем воздух в комнате, перед на­чалом высушивания его рекомендуется немного подогреть (осто­рожно - высокое давление!) - температура камеры обязательно должна быть ниже, чем температура баллона. Для предупреждения конденсации влаги на стенках охлажденной камеры и образце ре­комендуется всю процедуру проводить в специальной комнате с очень сухой атмосферой. При работе с аппаратом ВКТ надо быть очень осторожным. Желательно саму камеру поместить за специ­альный прочный прозрачный экран. Нельзя прямо заглядывать в окошко камеры, лучше делать это посредством металлического (а не стеклянного) зеркала. Нежелательно уходить от аппарата, до тех пор пока камера полностью не нагреется. При резком повышении давления, если температура камеры не достигла 40®С, рекомендуется посредством выпускного клапана сбросить уровень давления до 95-100 атм [5, 14, 23, 65].
  

18.2.3. Лиофильная сушка (высушивание из твердого состояния)

   Метод высушивания из твердого состояния (лиофилизация) может быть реализован в процессе замораживания-высушивания или при заливке в вещество (например, камфен) с высокой тепло­той сублимации с последующим вакуумированием. К сожалению, до сих пор методики лиофилизации страдают плохой воспроизво­димостью, что связано с тем, что при низкой температуре (ниже -100®С) лед возгоняется очень медленно и в этом случае можно I работать с очень тонкими объектами, а при t > -100®С возникает неконтролируемый рост кристаллов льда.
   Сублимация молекул воды из твердой фазы происходит в том случае, если их парциальное давление на замороженной поверхности превышает таковое в прилежащей атмосфере. Если вакуум достаточно высок, а объект окружен сухой атмосферой, то скорость сублимации определяется температурой объекта. Например, при t=0®С скорость сублимации равна 8.3•10-2 г/(см2•с), а при t=-100®С она более чем в 100 тыс. раз меньше. Давление паров насыщения воды при t=-60®С составляет 8 х 10-3Торр, а при t=-80®С уменьшается до 4х10-4 Торр [65].
   Сублимация льда в поверхностной зоне образца ведет к образованию слоя сухого материала, который тормозит дальнейшую сублимацию. Скорость сублимации экспоненциально уменьшается с увеличением толщины сухого слоя образца. Кроме того, при низкой температуре из объектов невозможно удалить связанную воду. Эта фракция воды удаляется только при повышении температуры. Поэтому для биологических образцов время лиофилизации в 20-100 раз превышает время сублимации чистой воды. В процессе лиофилизации желательно не допустить рекристаллизации воды. Критической в этом плане является t=-80®С. Быстрее подвергаются лиофилизации крио-УС, у которых очень высокая удельная поверхность [5, 14, 23, 65].
   На практике в большинстве случаев сублимацию проводят в температурном интервале между -60 и -100®С. Чтобы не загряз­нить поверхность объекта, высушивание обычно начинают при наи­более низкой температуре, на которую способен данный аппарат в течение нескольких часов, а затем медленно поднимают темпера­туру до -60®С и ждут, пока объект не высохнет. Локальное низкое давление паров воды в вакуумной камере поддерживают с по­мощью ловушки с пятиокисью фосфора или с помощью охлажде­ния металлических поверхностей, окружающих образец, жидким азотом. На них же происходит конденсация загрязняющих камеру углеводородных паров. Монослой клеток при температуре от -65 до -70®С высушивается за 72 ч.
   Часто выгоднее применить более сложный режим сублимации. Например, 6 сут объекты сушат при t=-150®С, 2 сут - при t=-100®С, затем температуру медленно поднимают до -70®С. После того как вакуум стабилизируется на уровне 1.5 х 10-6, сто­лик с объектами можно нагреть. Процесс высушивания легко контролировать посредством измерения вакуума. Если в объекте остаются следы воды, то небольшое повышение температуры немедленно приводит к ухудшению вакуума. Лиофилизацию для СЭМ можно осуществить с помощью простейших устано­вок, используя замораживание объекта в последней порции дегидратанта [219].
   Иногда применяют очень простой метод замораживания-высушивания: обезвоживание в этаноле, пропитывание 100%­-ным t-бутанолом (при температуре от 27 до 30®С), заморажива­ние в холодильнике, перенос в вакуумную камеру и сублимация. Поскольку бутанол растворяется в вакуумном масле, между каме­рой и насосом надо поставить ловушку, вымораживающую бута­нол [84]. Можно осуществлять сублимацию после замораживания в абсолютном этаноле (t=-80®С, давление 1-2 Торр) [14, 23, 65, 205]. Для этих же целей рекомендуют ацетонитрил. В этом случае после обезвоживания в ацетоне при возрастающей его концентра­ции объекты переносят в ацетонитрил. Сосуд с объектами поме­щают на термоизоляционную прокладку в вакуумную камеру с достаточно мощным вакуумным насосом. При откачивании воздуха ацетонитрил замерзает и сублимируется [3].
   Одним из методов выбора может служить замораживание и лиофилизация после дегидратации во фреоне TF, который являет­ся неполярным растворителем, замерзает при t=-35®С, не кри­сталлизуется при замораживании, легко сублимируется в вакууме. Для этого объект после фиксации обезвоживают в этаноле, кото­рый замещается фреоном TF при интенсивном перемешивании в ряду смесей фреона с этанолом (3 : 2 - 15 мин, 4 : 1 - 15 мин, в двух порциях 100%-ного фреона - по 15 мин). Затем берут алю­миниевый стакан массой не менее 90 г и охлаждают в резервуаре, заполненном жидким азотом. Объект с помощью пинцета перено­сят в алюминиевый стакан под слой жидкого азота. Стакан поме­щают в вакуумную камеру, из которой откачивают воздух. После испарения азота объект объемом 1 мм3 становится сухим через 90 мин [216]. Наконец, для высушивания из твердого состояния применима и заливка в камфен с последующей его сублимацией в вакууме [65].
   Метод лиофилизации является практически единственным ме­тодом контроля за адекватностью результатов, полученных с по­мощью ВКТ. Лиофилизация вызывает значительно меньшее сжа­тие объектов, чем ВКТ, однако во время сублимации могут проис­ходить агрегирование внутриклеточных структур и утолщение их мембран, а также разрывы ткани, вызванные рекристаллизацией воды или дегидратанта. Кроме того, во время низкотемпературной заливки наблюдаются сжатие и перераспределение структурных элементов. При сублимации воды возможно выпадение на поверх­ности клеток аморфного осадка [23].
   После высушивания сухие и гигроскопичные кусочки должны храниться в эксикаторе над пятиокисью фосфора или силикагелем либо в вакуумной камере или в атмосфере инертного газа (еще раз отметим, что силикагель при обводнении изменяет голубой цвет на желтый). После лиофилизации объекты можно подвергнуть низкотемпературной заливке. Очень часто для стабилизации высу­шенных объектов их обрабатывают в парах фиксирующего веще­ства.
  

18.3. МОНТИРОВАНИЕ

  
   Прикрепление высушенных объектов к предметному столику можно осуществлять с помощью любого клея с низкой упруго­стью паров растворителя. Важно лишь, чтобы края препарата не отставали от столика. Соприкосновение препаратов с недостаточно подсохшим клеем может привести к пропитыванию объектов рас­творителем и полеганию рельефных образований. Возникающая при этом картина сходна с наблюдаемой при высушивании объек­та на воздухе [5, 6].
   Приклеивать осмированные объекты лучше с помощью элект­ропроводящего клея, что, однако, не обязательно, если они не по­крыты электроводящим слоем. В таком случае рекомендуется пе­ред напылением сделать токопроводящие мостики с поверхности объекта из проволоки или из густого клея. После того как высу­шенные образцы приклеены к столику-подложке, а клеящее веще­ство высохло, их рекомендуется обдуть абсолютно сухим чистым воздухом, чтобы удалить пыль, налипшие крошки и тд.
  

18.3.1. Создание электропроводящего покрытия

  
   Токопроводящие покрытия наносят одним из следующих спо­собов: 1) осаждением на изучаемую поверхность металлов из рас­творов или паров; 2) обработкой поверхности антистатиками; 3) термическим распылением металлов; 4) ионным распылением металлов. Чем ниже ускоряющее напряжение микроскопа, тем меньшую толщину токопроводящего покрытия образцов нужно использовать [105, 293].
   Осмирование поверхности осуществляется следующим обра­зом: объект погружают на 10 мин в 1%-ный раствор гамма-тио-карбогидразида, промывают в воде, 20 мин обрабатывают 1%-ным раствором ЧО и подвергают дегидратации. Высущенные объекты можно дополнительно осмировать в сосуде с кристаллами ЧО в течение 24-48 ч, после чего их 1-2 ч выдерживают на воздухе для удаления избытка ЧО, затем препараты помещают над парами гидрата гидразина на 12-24 ч. Процедуру можно повторить 2-3 раза. В этом случае для приклеивания объектов необходим электро­проводящий клей [48] (см. Приложение, 18.1).
   Импрегнация солями металлов и обработка антистатиком в ряде случаев позволяют анализировать объект без напыления слоя металлов. Если объект зафиксировать в смеси, содержащей 2 % ГА и 2 % таниновой кислоты (ТК), а затем обработать ЧО, то можно получить отчетливое изображение без напыления даже при увели­чении 10 тыс. и ускоряющем напряжении 25 кВ. ТК можно при­менять и непосредственно перед осмированием. Повторные обра­ботки с помощью ТК и ЧО увеличивают электропроводность объ­екта, но могут загрязнять его поверхность. Существуют и другие способы металлизации поверхности препаратов [23, 48].
   Для создания электропроводящего покрытия объекты перед лиофилизацией 10-60 мин обрабатывают тщательно отфильтро­ванным 5%-ным водным раствором антистатика. Если будет использован метод ВКТ, то лучше применять 10%-ный раствор антистатика в этаноле или изоамилацетате. После ВКТ рекоменду­ется напылить тонкий (0.3 нм) слой золота [23, 48, 65].
   Большинство исследователей предпочитают методы распыле­ния металлов: чаще ионное и реже термическое. Проводящая пленка из благородных металлов существенно увеличивает эмис­сию электронов. Покрытие из других металлов этим свойством не обладает и быстро окисляется на воздухе. К недостаткам ионного распыления следует отнести значительное нагревание объектов. Имеются указания на образование на поверхности во время ион­ного напыления мелких ямочек. Возможно, это связано с разжи­жением липидов цитолеммы при нагревании. В качестве компро­миссного варианта можно рекомендовать дробное ионное напыле­ние. Из-за указанных недостатков некоторые исследователи рекомендуют пользоваться методом вакуумного термического рас­пыления угля или металлов в условиях многоосевого вращения образцов [23].
   При распылении сплава золота и палладия размеры гранул по­крытия оказываются меньше, чем в случае чистого золота. Если образец осмирован, то его толщина в 5-15 нм является достаточ­ной, если же нет, то толщина должна быть увеличена. Поверхность образцов можно напылять хромом. Катодное распыление металлов из-за сильного нагревания часто вызывает появление многочис­ленных трещин на поверхности образца. Возможно также загряз­нение поверхности объекта вакуумными маслами и ее травление [105]. Для высокоразрешающей СЭМ лучше напылять объекты платиной, вольфрамом или ниобием. Во время термического на­пыления лучшие результаты достигаются при вращении объекта. Так, для достижения большего разрешения в СЭМ рекомендуется проводить напыление с помощью платины и углерода в аппарате Бальцерс (Balzers, Лихтенштейн) при вращении образца. В ряде случаев объект располагается под определенным углом к источни­ку распыления [150, 280].
   На кремниевых подложках клетки заряжаются значительно слабее, чем на поверхности стекла или углерода. Поэтому толщина покрытия металлом может быть снижена до 2 нм. В некоторых случаях, когда изолированные клетки или частицы помещают на хорошо проводящую поверхность, добавочного их напыления не требуется [23, 65].
  

18.4. ПРОСМОТР ПРЕПАРАТОВ

  
   Просмотр образцов в СЭМ может оказаться источником арте­фактов. Например, длительный просмотр одного и того же участка препарата в ряде случаев приводит к появлению отверстий типа кратеров и "выжиганию" объектов. Столик микроскопа необходи­мо тщательно протирать.
   Использование поворотного устройства позволяет видеть и об­ратную сторону рельефных образований. Так, изменяя угол накло­на объектного столика по отношению к электронному пучку от О до 90® и поворачивая столик на 360®, можно изучать клетки с обе­их сторон. Применение встроенного в колонну микроскопа микро­манипулятора дает возможность обнажать скрытые участки тка­ней. Для получения стереопар и последующей реконструкции трехмерного изображения один и тот же участок препарата фото­графируют дважды с изменением угла наклона объекта по отноше­нию к электронному пучку: снимок делают сначала в одном ракур­се, а затем объект поворачивают на 8-10®. Поле зрения должно ос­таваться тем же. Микроворсинки и микрореснички объекта должны "торчать" и быть отделенными друг от друга, что можно проверить с помощью получения стереопары [4, 5, 14, 23, 181].
  

18.5. МАРКИРОВАНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ

  
   Наряду с общепринятым методом СЭМ нативных препаратов в ряде случаев используется метод маркировки межклеточных контактов с помощью импрегнации азотнокислым серебром. Им-прегнированные препараты можно проявлять обычными фотогра­фическими проявителями. При импрегнации межклеточных гра­ниц восстановленные частицы серебра дают более высокую эмис­сию электронов. Поэтому серебряные линии выглядят ярче окружающих тканей. При правильной обработке их толщина не должна превышать 30-40 нм. Импрегнация может проводиться как до фиксации, так и после нее. Следует иметь в виду, что при дофиксационной импрегнации могут повреждаться препараты. В большинстве современных работ сосуды импрегнируют после фиксации. Однако надо учитывать, что длительная фиксация зна­чительно ухудшает качество препарата [5, 23].
   Имеется обратная зависимость между длительностью фикса­ции и качеством импрегнации: с увеличением времени инкубации в фиксаторе линии серебра становятся более тонкими, затем пре­рывистыми и, наконец, совсем пропадают. Наряду с этим постепенно "проявляются" аргирофильные субэндотелиальные волокна, маскирующие межэндотелиальные границы. Так, например, фик­сация в 2-3%-ном растворе ГА, продолжающаяся более 5-10 мин, практически исключает возможность качественной импрегнации. Однако очень часто провести импрегнацию сосуда через короткое время после фиксации не представляется возможным по тем или иным причинам (например, в патологоанатомической практике в связи с необходимостью продолжения вскрытия после иссечения сосуда).
   Импрегнировать можно не только нитратом серебра, но и про-теинатом серебра. Однако если вначале зафиксировать, а затем обработать объекты протеинатом серебра, то импрегнации границ клеток не происходит. Обработка метенамином серебра не изменя­ет рельефа поверхности образца, что позволяет использовать на­блюдения одновременно как в обратно рассеянных, так и во вто­ричных электронах. Импрегнированные пленочные препараты можно освободить от целлоидина и просмотреть в СЭМ - сереб­ряные линии видны очень хорошо. [23, 31].
   Разработан метод отсроченной импрегнации межклеточных границ эндотелия. Для этого фиксированный (не более 5 мин) сегмент сосуда помещают в изотонический раствор хлорида на­трия, после чего проводят импрегнацию сосуда. Подобная инкуба­ция сосуда в растворе хлористого натрия в пределах суток практи­чески не влияет на качество препарата [31] (см. Приложение, 18.4 и 18.5).
   Механизм избирательного отложения серебра в области меж­клеточных контактов неясен. Соответственно неизвестны и причи­ны ухудшения качества импрегнации при длительной альдегидной фиксации материала. В настоящее время наиболее распространена следующая точка зрения: ионы серебра взаимодействуют с электроотрицательными участками клеток, которые сконцентрированы преимущественно в области межклеточных контактов. Отрица­тельный заряд в этих зонах обусловлен в свою очередь высокой концентрацией ионов хлора. По всей видимости, при длительной фиксации происходит "блокировка" активных центров связывания серебра в области межклеточных контактов, а инкубация в раство­ре хлорида натрия создает динамическое равновесие между нахо­дящимися в области контактов и в растворе ионами натрия и хло­ра [23, 31].
   Глава 19 МЕТОДЫ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ДИССОЦИАЦИИ
   По отношению к тканям, клеткам и субклеточным структурам необходимо различать естественные (свободные), граничащие с жидкостью или газовой средой, и искусственные (закрытые, несво­бодные) поверхности [65]. Под последними понимают клеточные и тканевые поверхности, обнажающиеся только после специальной обработки тканей, т.е. их невозможно увидеть при стандартных методах подготовки объектов для СЭМ [45].
   Для обнажений свободных тканевых поверхностей используют различные способы отмывания и перфузии полостных и трубча­тых образований [23]. Другим подходом, позволяющим визуали­зировать рельеф полостей в глубине тканей, является применение коррозионных препаратов или их слепков [19] (см. гл. 20).
   В ряду методов визуализации несвободных поверхностей осо­бое место занимают подходы, основанные на принципах физико-химической диссоциации (ФХД) и избирательного экстрагирова­ния тканевых компонентов. Общим для данной группы методов является использование таких процедур препарирования биологи­ческих образцов, при которых избирательно удаляются те или иные компоненты тканей или целенаправленно сохраняются опре­деленные структурные элементы на фоне удаления всех других. Естественно, что все эти методы не должны изменять интактную трехмерную организацию и структуру поверхности обнажаемых тканевых структур.
  

19.1. КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ФХД

  
   По принципу действия, положенному в основу препарирова­ния тканей при их ФХД, мы выделяем следующие основные груп­пы методов: 1) механофизическая диссоциация (разрыв, раскол, стирание, сдирание, трение, ультразвук, замораживание-скалыва­ние, воздействие оксигенированной плазмой, повышение темпера­туры, например автоклавирование для растворения коллагена, и т.д.); 2) химическая диссоциация (воздействие кислотами, щело­нами, ферментами, комплексонами, например ЭДТА, и т.д.); 3) физико-химическая диссоциация (воздействие неионогенными детергентами, осмотическое воздействие и др.); 4) сочетанные ме­тоды воздействия [42].
   С другой стороны, в основу классификации рассматриваемых методов подготовки образцов для СЭМ могут быть положены ха­рактер и особенности структур, визуализируемых в процессе пре­парирования: 1) методы визуализации внутриклеточных структур; 2) методы визуализации несвободных клеточных поверхностей; 3) методы визуализации поверхности неклеточных структур. При этом конечный этап подготовки образцов после реализации боль­шинства указанных методов включает их высушивание, создание электропроводного покрытия и монтирование на столики. Все эти процедуры мало отличаются от тех, которые используются для сканирующей электронной микроскопии свободных поверхностей [23].
  

19.2. МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

   Строение субклеточных структур можно исследовать как с по­мощью платиново-углеродных реплик, так и посредством СЭМ высокого разрешения. Для этих целей используют заморажива­ние-скалывание-высушивание [257] и(или) удаление эпоксидной смолы или парафина из объектов с последующим высушиванием [265]. Применяются методы замораживания-скалывания-фикса­ции-высушивания [166] и гипотонического вскрытия живых кле­ток с помощью разбавленного забуференного раствора с последу­ющей фиксацией и высушиванием [189]. После раскалывания можно в замороженном состоянии осуществлять полировку пол­ученной поверхности скола [46, 47, 344].
  

19.2.1. Вскрытие клеток

  
   Для изучения внутренних структур клеток наиболее часто ис­пользуют их вскрытие с помощью осмотического шока. Так, для исследования внутренней поверхности плазмалеммы монослой клеток, прочно прикрепленный к субстрату, промывают буфером и погружают в гипотонический раствор - клетки лизируются или отекают. Их смывают с субстрата. Оставшуюся на субстрате плаз-малемму префиксируют и метят, с нее изготавливают реплику.
   Если разрушить мембрану клеток (например, с помощью раз­веденного раствора NaOH в течение 20 мин) и струей жидкости удалить содержимое клеток, то доступными для изучения стано­вятся протоплазматическая поверхность плазмалеммы и примем-бранный цитоскелет. Для упрочения примембранного цитоскелета при препарировании клеточных монослоев посредством струи жидкости следует подложку с оставшимися клеточными мембра­нами проинкубировать в 0.01 М ФБ (рН 7.6, 20 мин) [22]. Нако­нец, если провести замораживание-скалывание, то можно исследо­вать Е-поверхность плазмалеммы [251, 271] (см. Приложение, 19.1).
   Нефиксированные клетки, выращиваемые на покровном стек­ле, промывают в буфере (лучше цитратном) и накрывают вторым покровным стеклом, обработанным раствором полилизина (кон­центрация 1 мг/мл). При этом очень быстро происходит прочное сцепление клеток и покровного стекла. Разделение стекол приво­дит к разрыву клеток и обнажению их внутренней структуры, с ко­торой можно получить реплику. После разъединения стекла с клетками помещают в фиксатор, обезвоживают и подвергают ВКТ.
   Однако если клетку просто вскрыть, то компоненты цитоплазматического матрикса, растворенные в воде, будут маскировать внутриклеточные структуры. Существуют следующие способы экс­тракции мешающих наблюдению внутриклеточных компонентов и обнажения анализируемых структур: 1) мацерация разбавлен­ными растворами 40; 2) экстрагирование неионогенными детер­гентами, например такими, как Тритон Х-100 и др.
   Доказано, что разбавленные (0.1%-ные) растворы ЧО разруша­ют и экстрагируют белки из цитозоля [212, 344]. Такое действие сходно с эффектом гипохлоритов, окисляющих ткани при мацера­ции. Сохраняются липиды, липопротеиды, нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды. С помощью ограничения скорости и глубины осмиевой мацерации или замены ее водным промыванием можно сохранить цитоскелет. Метод осмиевой мацерации основан на том, что разбавленный раствор ЧО вызывает декомпозицию "сшитых" фиксацией цитоплазматических протеинов и удаление их с повер­хности органелл. Внутримембранные белки предохраняются от мацерирующего действия раствора ЧО окружающими липидами. Однако мацерирующий эффект разбавленных растворов ЧО имеет свои пределы. Так, если ткани фиксировать 2%-ным (и более кон­центрированным) раствором альдегида достаточно продолжитель­ное время (свыше 30 мин), то цитоплазматический матрикс при последующем препаровании растворяется очень медленно [345].
   Наиболее широко в настоящее время применяется следующая схема препарирования: после кратковременной (в течение не­скольких минут) перфузионной фиксации разбавленным раство­ром ГА и(или) ФА небольшие кусочки объектов пропитывают рас­твором диметилсульфоксида, замораживают, раскалывают, отмы­вают, постфиксируют в ЧО, в течение 3-4 сут мацерируют в 0.1%-ном растворе ЧО и готовят для СЭМ; для ускорения мацера­ции применяют периодическое воздействие микроволн через 1-се-кундные интервалы в течение 30-60 мин. Матрикс при этом уда­ляется быстрее, а температура не поднимается [195]. Данный ме­тод дает возможность одновременно с анализом структур в СЭМ проводить и гистохимические реакции [195, 313, 345] (см. Прило­жение, 19.2).
   Для обнажения внутриклеточных структур применяют абра­зивную механическую обработку объектов с помощью пленки, по­крытой мелкими частицами оксида алюминия и помещенной на охлажденную жидким азотом медную пластинку. В этом случае после фиксации в ЧО объекты пропитывают криопротекторами, замораживают, шлифуют, подвергают мацерации, высушивают и анализируют в СЭМ.
   Другим способом обнажения субклеточных структур и вскры­тия нефиксированных клеток, выращиваемых на покровном стекле, является механический разрыв. Клетки промывают в цитоскелетстабилизирующем буфере и накрывают обработанным полилизином покровным стеклом так, чтобы оно контактировало с апикальными частями клеток. Через некоторое время стекла разъединяют (при этом отрывается апикальная часть плазмалем­мы) и помещаются в фиксатор. Разорванные клетки затем обезво­живают и подвергают ВКТ. Из-за того что разрыв производится перед фиксацией, возможна денатурация белков. Этот метод особенно полезен для мечения цитоплазматических компонен­тов.
   Фиксированные клетки можно вскрывать микродиссектором. Данная методика осуществляется с помощью липкой ленты. Клетки, прикрепленные к покровному стеклу или сеточке, фик­сируют и подвергают ВКТ. Затем их прижимают к липкой лен­те, которую сразу отдирают. При этом удаляется небольшая часть апикальной плазмалеммы, реже - почти вся клетка, что позволяет визуализировать внутреннюю поверхность базальной плазмалеммы с прикрепленными окаймленными везикулами и цитоскелетом.
   Наконец, клетки могут быть подвергнуты быстрому замораживанию-скалыванию-оттаиванию в присутствии цитоскелетстабилизирующего буфера или фиксатора. Одной из возникающих про­блем является кристаллизация воды. Криопротекторы в свою оче­редь оказывают токсическое действие на живые клетки.
   Альтернативный подход к визуализации внутриклеточных структур представляет собой ионное травление Срезанной поверх­ности ткани, залитой в смолу [200]. Метод базируется на факте большей устойчивости мембранных структур клеток к действию оксигенированной плазмы по сравнению с цитоплазматическим матриксом. Под действием плазмы на срезе формируется псевдо­рельеф, отражающий реальные внутриклеточные структуры, но содержащий множество артефактов. Прибор перед использовани­ем должен быть тщательно высушен, а температура плазмы не должна превышать 100®С [199]. В качестве газовой среды пред­почтительнее использовать гелий или аргон. Ионное травление дает удовлетворительные результаты только для мембранных структур, хроматин и белковые структуры разрушаются.
   Выявление фибриллярных внутриклеточных структур произ­водится с помощью неионогенных детергентов [22].
  

19.2.2. Детергентно-экстрагированные препараты

  
   Термином "неионные детергенты" (НД) обозначают поверхно­стно-активные вещества, способные осуществлять солюбилизацию компонентов цитолеммы. НД солибилизируют фосфолипиды из мультиламеллярной метафазы путем образования смешанных мицелл, которые могут включать мембранные липиды и белки. Это приводит к растворению и элиминации мембранных компо­нентов клетки [50].
   При детергентном экстрагировании удаляются мембраны и другие компоненты клеток. Остаются только ядерная оболочка (точнее, прилежащий к ней слой гетерохроматина) и компоненты цитоскелета, с которыми ассоциированы белки и рибосомы. Как правило, экстрагированию подвергаются живые клетки. Поскольку фибриллярные формы компонентов цитоскелета в живых клетках находятся в динамическом равновесии с молекулярными форма­ми, детергентное экстрагирование проводится в присутствии спе­циальных цитоскелетсохраняющих буферных растворов, повыша­ющих стабильность микротрубочек, микрофиламентов и проме­жуточных филаментов (см. Приложение, 19.3). Для стабилизации микрофиламентов к раствору ГА добавляют таниновую кислоту (ТК) [44, 237, 342].
   В данном разделе мы не анализируем процесс детергентного экстрагирования в присутствии фиксаторов из-за его чрезвычай­ной сложности и плохой воспроизводимости [93].
   В большинстве исследований в качестве НД применяется Три­тон Х-100. Контакт живой клетки с его раствором в течение не-, скольких секунд приводит к удалению липидов, содержащихся в клеточных мембранах. При этом клетка теряет цитолемму. Ее со­держимое непосредственно контактирует с окружающим раство­ром, структурно незакрепленные растворимые белки со свободны­ми концами вымываются. Предварительная фиксация клеток в ГА или других альдегидах делает цитолемму нерастворимой в раство­ре Тритона Х-100.
   Метод детергентного экстрагирования целых клеток в сочета­нии с негативным контрастированием применяется для исследо­вания цитоскелета. Комбинированная обработка клеток НД с по­следующим их ВКТ и использование ТЭМ, в том числе ВТЭМ, по­зволяют визуализировать трехмерную структуру цитоскелета. Сочетание детергентного экстрагирования со сверхбыстрым замо­раживанием, травлением и круговым напылением объектов позво­ляет исследовать цитоскелет на макромолекулярном уровне [22, 92].
   ГА даже высокой степени очистки приводит к укорочению актиновых филаментов и их искривлению. Обработка ЧО и перман-ганатом калия разрушает актиновые филаменты. Микрофиламен-ты разрушаются во время постфиксации и при дегидратации. ЧО повреждает микрофиламенты, если ее концентрация превышает 0.05 %. Диаметр актиновых микрофиламентов увеличивается, ес­ли их защитить от разрушения с помощью ТК [104]. Однако пока­зано, что система микрофиламентов легче обнаруживается при использовании ГА с низкой (0.1 %) концентрацией. Добавление ТК в префиксатор предохраняет микрофиламенты от разрушения. За­щитным эффектом обладает смесь ферроцианида калия с 40.
   Префиксация с помощью ГА-лизиновой смеси (2,5 % ГА, 50 ммоль/л лизинхлорида, 100 ммоль/л ФБ, рН 7.4, t=23®С, 45 мин) сохраняет цитоскелетные элементы после травления Три­тоном Х-100. Лучшая визуализация микрофиламентов достигает­ся при использовании гипотонического фиксатора.
   Для стабилизации микрофиламентов и микротрубочек ис­пользуют различные цитоскелетстабилизирующие буферы (ЦСБ) (см. Приложение, 19.3.2). В случае, когда величина рН приближа­ется к нейтральным значениям, а ионная сила растворов соответствует физиологической или несколько меньше, наиболее важным действующим фактором в стабилизирующем растворе является концентрация ЭГТА, которая контролирует содержание свободных ионов кальция во время детергентного экстрагирования. Высокая концентрация ЭГТА (до 10 ммоль/л) предохраняет структурные компоненты цитоскелета от разрушения [22, 69, 92].
   При экстракции в присутствии ПЭГ (молекулярная масса 20 000-40 000) сохраняются, практически все цитоскелетные структурные. В то же время экстракция в растворе, содержащем глицерин, приводит к разрушению сети микрофиламентов в активном крае и в кортикальном слое клетки, что делает доступной для изучения центральную часть клетки. Это позволяет создать условия избирательного удаления микрофиламентов, микротрубо­чек и промежуточных филаментов.
   Наиболее часто для стабилизации цитоскелетных элементов употребляется ПИПЕС-буфер. ПЭГ (молекулярная масса 20 000) стабилизирует мембраны против действия детергента Бридж-58 (Brij-58). Условия, в которых стабилизируются микротрубочки, обусловливают стабилизацию и других компонентов цитоскелета.
   Для уменьшения экстракции фибриллярных структур реко­мендуется применять гомобифункциональные эфиры N-гидроксисукцинимида. Чем длиннее молекула бифункционального сшивателя белка, тем лучше стабилизирующий эффект вещества [237].
   Среди факторов, которые определяют структуру и состав детергентно-экстрагированных клеток, следует отметить, во-первых, химическую природу детергента и состав растворителя (например, удаление кальция для стабилизации фибриллярных структур), во-вторых, обработку клеток бифункциональными сшивателями бел­ков до и во время экстрагирования [237].
   При использовании раствора Тритона Х-100, приготовленного на обычных буферах (ФБ, раствор Хэнкса, ФБФР и др.) без добав­ления тубулопротектантов, сохраняются лишь микрофиламенты, промежуточные филаменты и миозиновые фибриллы. Для сохра­нения промежуточных филаментов применяется последовательная обработка буферными растворами с низкой и высокой ионной си­лой. Можно добавить в буферный раствор с высокой ионной силой 05 % Тритона Х-100. Если же надо сохранить микротрубочки, то в раствор вводят 1 мкг/мл таксола (подробнее см.: [22]). При по­следовательном воздействии растворов с низкой и высокой ион­ной силой цитоскелет имеет тенденцию к отделению от подлежа­щего субстрата. Для сохранения Ф-актинсодержащих белков клет­ки после детергентного экстрагирования обрабатывают раствором саркозила, приготовленного на ЦСБ. Перед этим микрофиламенты дополнительно укрепляют погружением на 2-3 мин в раствор фаллоидина (10 мкг/мл). Микрофиламенты диаметром 2-3 нм удаляются как при воздействии саркозила, так и при поперемен­ной обработке буферными растворами разной ионной силы. Для избирательной экстракции микротрубочек используют не содер­жащие ЭГТА растворы с добавлением 0.5 ммоль/л кальция, либо исключают из раствора тубулопротектанты.
   Часто для анализа фибриллярных белков после детергентного экстрагирования используют специфическое маркирование. Так, микрофиламенты метят тяжелым меромиозином или раствором его субфрагмента S1 на ЦСБ. В процессе декорирования может происходить разрушение микротрубочек из нефиксированного ци­тоскелета. Однако, если обработка проводится быстро, существен­ных изменений в организации цитоскелета не наблюдается. Опи­саны методы специфического маркирования миозина с помощью антител. Разработаны методы идентификации других фибрилляр­ных внутриклеточных белков [22].
   Концентрация Тритона Х-100 варьирует в разных прописях от 0.1 до 2 % (чаще всего 0.5-1 %), время воздействия колеблет­ся от 20 с до 15 мин. Естественно, что сравнение результатов, полученных разными исследователями, затруднено. Чем мень­ше концентрация Тритона и время экстракции, тем больше фибриллярных элементов цитоскелета сохраняется на препара­тах. Не рекомендуется проводить экстракцию дольше 5 мин. Раствор Тритона Х-100 при концентрации 0.1-1 % быстро рас­творяет все липидсодержащие мембраны в клетках, хотя круп­ные цитоплазматические липидные капли не растворяются. При отсутствии добавок раствор Тритона Х-100 растворяет и белки. 8 последнее время стали использовать значительно меньшие концентрации детергентов [237].
   Детергент Бридж-58 (Brij-58) действует на мембраны мягче и в меньшей степени растворяет белки. После воздействия его 0.2%-ного раствора в течение 5 мин экстрагируется меньше бел­ков, чем при действии 0.1%-ного раствора Тритона Х-100 в тече­ние 1 мин. Для выявления цитоскелета применяются и другие НД, например из группы сапонинов (0.1 %). Последний мало по­вреждает мембраны, но способствует вымыванию из клетки рас­творенных белков, формирует отверстия в плазмалемме.
   Дальнейший ход препарирования в случае использования СЭМ не имеет существенных отличий: фиксация (фиксатор лучше готовить на ЦСБ), обезвоживание, ВКТ. Наиболее удачным мето­дом напыления является катодное распыление золота, которое не повреждает элементы цитоскелета. Хорошие результаты получа­ются при использовании осмирования с помощью тиокарбогидразида. Из-за высокой гигроскопичности препаратов цитоскелета рекомендуется хранить их под вакуумом, либо в эксикаторе с силикагелем.
   Подготовка образцов для ТЭМ после детергентного экстраги­рования включает фиксацию, обезвоживание, высушивание и кру­говое напыление платиной под углом 30-45®. Ткань удаляют рас­твором гипохлорита (подробнее см. гл. 15).
   Другой способ подготовки объектов включает в себя быстрое замораживание фиксированных или нефиксированных образцов, глубокое травление, напыление платиной при вращении объекта. Изготовленные реплики изучают в ТЭМ. После замораживания-высушивания объект можно исследовать в СЭМ высокого разре­шения [342]. При ультраструктурном анализе цитоскелета метод лиофилизации дает лучшие результаты, чем ВКТ.
   Для напыления рекомендуется использовать спуттерное напы­ление вольфрамом или ниобием с толщиной покрытия 1-3 нм [150]. Обработка препаратов с помощью 1%-ного раствора УА перед замораживанием увеличивает стабильность и контрастность клеток [22].
   Таким образом, анализ внутриклеточных структур после детер­гентного экстрагирования может осуществляться как в ТЭМ с по­мощью реплик, так и в СЭМ высокого разрешения. Однако при исследованиях в СЭМ поверхности объектов быстро загрязняются. Реплики более стабильны и загрязняются в меньшей степени. Ис­следование объектов в СЭМ высокого разрешения довольно доро­го. Реплики дешевле, а ТЭМ доступнее. СЭМ-анализ имеет пре­имущества при проведении иммуномечения, поскольку при изго­товлении реплик возможна утеря частиц маркера, особенно КЗ. Однако СЭМ-анализ позволяет исследовать объекты с очень слож­ным рельефом поверхности, которые недоступны для получения реплик. Наилучшее разрешение цитоскелета достигается при использовании метода инвертированного контраста при СТЭМ, что позволяет выявлять как адгезированные на фибриллах метал­лические частицы, например гранулы КЗ, так и электронно-плот­ный материал в ядрах и цитоплазме [91].
  

19.3. МЕТОДЫ ОБНАЖЕНИЯ НЕСВОБОДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

  
   Один из первых способов обнажения несвободных клеточных поверхностей заключался в обработке тканей раствором борной кислоты (см. Приложение, 19.4). После обработки борной кисло­той фиксированные в ЧО образцы становятся хрупкими и при ме­ханическом воздействии (растирании) раскалываются по межклеточным контактам. Однако этот эффект отсутствует после фикса­ции в ГА и ФА, которые прочно "сшивают" клетки друг с другом. В то же время было замечено, что если ткани фиксировать в рас­творе ЧО более 12 ч, то они также могут быть разделены на клетки с помощью механического воздействия, однако поверхность кле­ток при этом значительно повреждается [358].
   Значительным продвижением в развитии методов визуализа­ции в СЭМ несвободных клеточных поверхностей стала разработка [144] метода мацерации фиксированных тканей с помощью воз­действия горячего раствора НСl и с последующей ферментативной обработкой (чаще всего коллагеназой). К настоящему времени предложено довольно много модификаций метода, однако во всех сохранен главный принцип - комбинация горячей 8 М НСl с фер­ментативной обработкой (коллагеназой [143], трипсином [145], гиалуронидазой [266], эластазой [86] и др.).
   Хотя пролонгированное воздействие горячей НСl и повреждает клетки, однако указанные режимы (8 М HCl, t=60®С) являются наиболее оптимальными [86]. Следует отметить, что при данной температуре кислота действует очень быстро и сильно, разрушая некоторые мягкие элементы тканей и клеток. Поэтому время об­работки должно быть подобрано конкретно для каждой ткани и да­же ее участка. Техника "НСl + коллагеназа" наиболее эффективна для удаления соединительнотканных элементов, главным образом коллагена. Механизм гидролиза коллагена соляной кислотой еще не совсем ясен, но можно полагать, что это происходит за счет кислотного гидролиза нескольких пептидных связей в молекуле коллагена. Нефиксированные образцы мацерируются быстрее, не­сколько медленнее идет мацерация тканей, фиксированных в фор­малине, еще медленнее - в ГА [143].
   Серьезным ограничением метода остается проблема неполного удаления внеклеточного материала. Именно для этого препараты после воздействия НСl дополнительно обрабатывают одним из ферментов. Обнаружено, что неочищенная коллагеназа действует эффективнее, чем очищенная [143]. Использование эластазы улучшает качество препаратов и позволяет сократить время обработки в НСl [86]. Как и коллагеназ II типа, эластаза хорошо разрушает коллагеновые фибриллы, разрывая поперечные сшивки в молеку­ле коллагена и переводя полимер коллагена в мономерное состоя­ние. Кроме того, она удаляет базальные мембраны. Предпочти­тельнее использовать очищенную эластазу из поджелудочной же­лезы быка, которая наиболее стабильна при рН 4.0-12. Эластаза, имея малую молекулярную массу, глубоко проникает в сплетения соединительной ткани.
   Для стабилизации препаратов во время мацерации в НСl при­меняется предварительное введение в сосуды инъекционной массы [55]. Можно вначале в микрососуды ввести ГА, затем инъекцион­ную массу (см.: [19]), а после полимеризации провести коррозию в 10%-ном (реже в 20%-ном) растворе NaOH (2 ч, t=40®С) и в 8 М HCl (1 ч, t=40®С). Во многом аналогичный подход (сочета­ние целлоидиновой техники отделения эндотелия с воздействием коллагеназой) позволяет визуализировать базальнуго поверхность эндотелиоцитов [61]. В ряде случаев для визуализации и мечения базальной поверхности культивируемых клеток их монослой за­ключают в желатину при t=30®С, которую затем охлаждают, поднимают с подлежащего субстрата и переворачивают. Далее сле­дует префиксация, мечение КЗ, высушивание и напыление.
   Для обнажения скрытых клеточных поверхностей используется также ультразвуковое излучение [112], часто в сочетании с после­дующей диссоциацией соляной кислотой [321]. Кроме того, дела­лись попытки применять ферменты и некоторые другие вещества и в случае нефиксированных объектов [264], однако быстро разви­вающиеся аутолитические повреждения существенно искажают результаты [353]. Наконец, предложено обрабатывать ультразву­ком фиксированные объекты [339]. Для удаления рыхлой волок­нистой соединительной ткани используется длительное воздейст­вие раствором ЧО [322].
   Новые возможности открыла методика пролонгированной поли­ферментативной диссекции длительно фиксированных тканей [210]. Сущность метода состоит в том, что образцы продолжитель­ное время (более 8 недель) фиксируют в 10%-ном растворе ГА. Это в какой-то мере предохраняет в последующем клетки от пере­варивания ферментами. Вслед за тщательным отмыванием в воде препараты сутками инкубируют в различных ферментах (трипсин, пепсин, протеазы, проназы и т.д.). Указанная процедура оказалась эффективной для лизиса базальных мембран. Конечно, как и в других случаях, возможно образование артефактов: мелких пу­зырьков и дырочек в плазмалемме, число которых с увеличением времени воздействия возрастает [211, 212].
   Перспективным для обнажения несвободных поверхностей клеток оказался метод спиртощелочной диссоциации. Первона­чально эта техника была предложена для разделения мышечных клеток миокарда [8]. В дальнейшем она стала широко приме­няться при изучении клеточного состава сосудистой стенки [60, 277]. Для этих целей после микродиссекции фиксированные в альдегидах образцы обрабатывают раствором этоксида калия (равные объемы 30%-ного раствора КОН и 96%-ного этанола, t=37®С). Отщепление тех или иных клеток контролируют в супернатанте светооптически [59]. Обычно полная диссоциация происходит за 1.5-2 ч [277]. В последние годы для обнажения несвободных клеточных поверхностей применяют 5 М раствор КОН (t=60®С) в комбинации с методом коррозионных препа­ратов [203]. Для визуализации в СЭМ клеток костной ткани об­разцы костей декальцинируют в растворе ЭДТА и подвергают коррозии в растворе КОН [217].
  

19.4. МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ НЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

  
   Наиболее удобным для визуализации в СЭМ неклеточным ма­териалом оказался эластический каркас тканей. Химической осно­вой всех методов визуализации эластина стала его значительная химическая инертность - он слабо реагирует не только с фиксаторами, но со многими другими веществами [335]. Например, при действии 0.1 М NaOH эластин разрушается очень медленно, тогда как коллаген быстро диссоциирует [312]. Возникший на этой осно­ве метод выделения эластических структур основан на примене­нии 0.1 М раствора NaOH при температуре 60-70®С и оказался для этих целей, судя по сохранности аминокислотного состава, од­ним из лучших [42] (см. Приложение, 19.6).
   Метод мацерации в горячей щелочи позволяет удалять почти все неэластические компоненты тканей, хотя проэластин и незре­лый эластин также могут разрушаться [335]. С помощью данной методики быстрее и проще всего диссоциируют нефиксированные образцы. Фиксация альдегидами пролонгирует процедуру, хотя при использовании формалина диссоциация идет быстрее, чем в случае применения ГА [363]. Для фиксации эластина предложено обрабатывать ткани отбеливателем [355].
   Длительность воздействия горячей щелочи является наиболее сложным и неопределенным моментом методики. Так, показано, что через 2 ч мацерации ткани при t=75®С сохраняется часть коллагена, покрывающего в сосудах внутреннюю эластическую мембрану, а после 3-4-часового воздействия начинает растворять­ся сам эластин. Последний процесс резко ускоряется при повыше­нии температуры до 100®С [123]. В то же время обнаружено, что масса эластического остова после удаления (например, в стенке сосуда) коллагена и гладких мышечных клеток остается стабиль­ной в течение 7 ч. Не изменяются и размеры фенестр во внутрен­ней эластической мембране [335]. Варьирование времени и усло­вий препарирования может приводить к тому, что, например, по­ры во внутренней эластической мембране увеличиваются в размерах, число их возрастает, они могут остаться прикрытыми мембраной, либо иметь вид ямок [67]. Фиксация объектов в ФА в течение 20 мин и корродирование их в 2.5 М растворе NaOH (t=25®С) в течение 48 ч приводят к удалению клеток и обнаже­нию соединительнотканных структур [275].
   Для анализа эластических структур предпочтительнее метод замораживания-высушивания, поскольку ВКТ сопровождается значительным сжатием материала, которое для эластических во­локон может превышать 60 %. Более того, эластин не фиксируется в ГА и поэтому после удаления других тканевых компонентов он изменяет свою пространственную организацию [362]. В то же вре­мя следует помнить, что сжатие объектов одинаково во всех трех измерениях и, следовательно, существенного влияния на про­странственную упаковку эластического каркаса оно не оказывает.
   Для уменьшения сжатия объектов при дегидратации тканей мож­но использовать обработку препаратов 05%-ным растворов УА в течение 60 мин [23].
   Существует несколько модификаций метода, например кон­центрацию щелочи повышают до 05 М, используют обработку ультразвуком и автоклавирование (для лучшего удаления коллаге­на), а время реакции сокращают до 30 мин [122]. При данном ре­жиме препарирования диаметр эластических фибрилл оказался сопоставимым с размерами интактных фибрилл, определяемыми в просвечивающем ЭМ, а рельеф поверхности соответствовал кар­тинам, полученным другими методами. Использовалась также ма­церация с помощью гуанидина и раствора NaOH [174]. Перспек­тивным для паренхиматозных органов оказалось сочетание мето­дов коррозионных препаратов и горячей щелочной диссоциации. К примеру, после заполнения сосудов латексом или другой инъек­ционной массой и фиксации в ГА их мацерируют в 0.1 М NaOH, а затем в 8 М НСl и вновь в NaOH [316, 363]. Латекс в этом случае выполняет роль каркаса, препятствующего спадению эластических структур.
   При использовании данного метода следует учитывать воз­можность появления ряда артефактов. Если в нормальных услови­ях нитевидные эластические волокна анастомозируют со смежны­ми и не имеют свободных окончаний, то их появление может свидетельствовать от артефакте препарирования. Артефактом яв­ляется также складчатость эластического каркаса артерий [121, 256].
   Обработка объектов горячим раствором щелочи позволяет со­хранить эластин лишь в нефиксированной ткани, в случае фикса­ции в ГА эластин разрушается. Однако после этого, особенно при длительной экстракции, более устойчивыми к обработке горячей щелочью становятся коллагеновые фибриллы. Очень важным яв­ляется контроль специфичности диссоциации. Для этих целей ча­ще всего используют ТЭМ и ПС. Применяются также контрасти­рование эластина с помощью ТК и обработка диссоциированных препаратов эластазой [297, 323, 362].
   Указанные недостатки и определенная нестабильность метода горячей щелочной мацерации заставили исследователей искать другие пути визуализации эластических структур. Было предложе­но использовать для этой цели раствор горячей (t=60®С) концентрированной (87 %) муравьиной кислоты [366]. Данный метод позволяет мацерировать фиксированные объекты, что дает воз­можность осуществлять перфузионную фиксацию сосудов, сохра­няя прижизненную пространственную архитектонику эластина (см. Приложение, 195). Преимуществом указанной методики яв­ляется длительность процедуры: интегрированность эластической ткани в муравьиной кислоте сохраняется до 400 ч, что очень важ­но для определения оптимальных сроков, поскольку меньше опас­ность быстрого повреждения эластина. Для улучшения сохранно­сти соединительнотканных структур после химического экстрагирования муравьиной кислотой препараты желательно обработать ТК [356]. В качестве корродирующего вещества используется так­же 15%-ный раствор азотной кислоты [343].
   Для более точного топического изучения пространственной ор­ганизации диссоциированных тканей объекты заключают в ПЭГ. После отвердения их разрезают в нужном направлении и месте и полируют, затем ПЭГ растворяют в воде, а объект готовят для ис­следования в СЭМ [362].
   Техника химической диссоциации тканей быстро совершенст­вуется. Разработана методика избирательного удаления из тканей компонентов, мешающих СЭМ-анализу, с сохранением клеток, коллагена и эластина или только коллагена. Для того чтобы в тка­ни сохранился коллаген, используется обработка фиксированных в ГА объектов в 10%-ном растворе NaOH (4 сут, t=20®С) с после­дующей обработкой ТК и ЧО. Для удаления клеток из ткани и со­хранения эластина и коллагена применяется обработка объектов 0.25-1%-ным раствором отбеливателя (5 ч, t,= 20®С), а затем ок­рашивание 1%-ным основным фуксином и 1%-ным метиленовым синим (по 5 мин). Для сохранения клеток применяется последова­тельная обработка кислотой (80%-ная НСl, 30 мин, t=60 РС) и эластазой (1 мг/мл эластазы в 0.5 М какодилатном буфере, рН 7.4, 3 ч, t=20®С) [362]. Варьирование режимов и способов экстрагирования позволяет дифференцировать различные внекле­точные структуры [131].
   В настоящее время наиболее распространенным и эффектив­ным способом обнажения базальных мембран является метод ацеллюлярного препарирования, основанный на одновременной обработке тканей ЭДТА, Тритоном Х-100 и дезоксихолатом на­трия [110] (см. Приложение, 19.7).
   Глава 20 СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КОРРОЗИОННЫХ АНАТОМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
   Сущность метода СЭМ коррозионных препаратов (СЭМКП) состоит в заполнении полостей организма затвердевающими ве­ществами, коррозировании биологических тканей и просмотре получаемых слепков в СЭМ [19, 20] (см. Приложение, 20).
  

20.1. МЕТОД СЭМКП СОСУДИСТОГО РУСЛА

20.1.1. Подготовка сосудистого русла

   Заполнение кровеносных и лимфатических сосудов смолой, как правило, проводится после предварительного отмывания их от содержимого. Однако в ряде случаев, особенно при работе с аутопсийным материалом, предпочтительно вводить смолу в неотмытое сосудистое русло. Это обусловлено резко возрастающей чувствительностью переживающих эндотелиоцитов к повреждающему действию инициальной перфузии. Аутопсийный материал можно использовать, если он сохранялся при температуре 0-4®С не более суток.
   Канюлирование сосуда удобно проводить полиэтиленовой ка­нюлей, которую легко изготовить из полиэтиленового катетера пу­тем его нагревания и последующего моделирования. Канюля обычно надевается на толстую инъекционную иглу и легко присо­единяется к системе для перфузии или шприцу. В качестве про­мывающего раствора можно использовать физиологический рас­твор, растворы Тироде и Хэнкса, а также многие другие растворы внеклеточного типа. Низкое онкотическое давление подобных растворов при перфузии длительностью более 2 мин приводит к интерстициальному отеку, который мало зависит от величины перфузионного давления. Для предупреждения отека в указанные растворы рекомендуют добавлять 2-3 % декстрана, 2-5 % поливинилпирролидона или другого высокомолекулярного кровезамещающего вещества. Можно использовать коммерческие кровезамещающие растворы [10, 19].
   Применяется прединъекционная фиксация разбавленными растворами фиксаторов (например, 2%-ный ФА). Для мягкой фиксации эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов иногда вместо промывающего раствора используют 0.5%-ный раствор ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.4). Одним из условий полного и качественного отмывания сосудистого русла является добавление в растворы ге­парина (около 10 ЕД/мл). Перфузионное давление не должно пре­вышать физиологическое, характерное для изучаемого органа.
   Отмывание кровеносного русла считается полным, если цвет вытекаемой жидкости соответствует цвету перфузата. Орган при этом приобретает белесый оттенок. Однако из-за опасности разви­тия интерстициального отека не рекомендуется проводить перфу­зию дольше 10 мин. Степень отмывания также можно контроли­ровать путем экспресс-подсчета эритроцитов в оттекающем перфузате [10, 19].
  

20.1.2. Заполнение кровеносного русла инъекционной массой

  
   Немедленно после отмывания, избегая попадания в систему пузырьков воздуха, в сосуды вводят подготовленную инъекцион­ную массу (ИМ). Для введения смол имеется ряд приспособлений. Самое простое из них - это шприц, соединенный с манометром. Важным моментом в инъекции является контроль за величиной инъекционного давления. Однако в ряде случаев для контроля уровня давления достаточно пользоваться так называемым крите­рием сухого носа. Он основан на том, что в случае превышения физиологического давления из носа животного начинает выде­ляться пенистая жидкость. Инъекционное давление можно повы­шать только до момента начала транссудации в полости носа, по­сле чего повышение давления немедленно прекращают. Естествен­но, что данный критерий нельзя применять при инъецировании изолированных органов и трупного материала. Инъекция заканчи­вается после полного заполнения сосудистого русла смолой, о чем чаще всего судят по появлению непрерывного потока ИМ из венозной системы.
   Обычно инъецирование проводят через аорту под начальным давлением 200 мм рт.ст. (что на уровне почечной артерии состав­ляет 90 мм рт.ст.), до тех пор пока не появятся первые 3-4 мл ИМ из полой вены на уровне сердца. В этот момент давление снижают до 20 мм рт.ст., а полую зену зажимают. Большинство исследова­телей предпочитают введение ИМ осуществлять с помощью шприца при надавливании поршня пальцами. Давление в прокси­мальных частях системы измерять нет смысла, поскольку оно не отражает реальной ситуации на уровне микроциркуляторного рус­ла [10, 19].
   В ходе инъекции полнота заполнения микроциркуляторного русла контролируется по заполнению (изменению цвета в случае цветной ИМ) микрососудов носа, склер, кончиков ушей животного или исследуемого органа. Полноту заполнения кровеносных ка­пилляров, т.е. переход ИМ в венулы, удобнее всего наблюдать под бинокулярной лупой на выведенном сегменте брыжейки. Однако строгой корреляции между полнотой инъекции различных орга­нов нет. Так, например, при хорошем заполнении печени легкие могут быть инъецированы плохо, и наоборот. Все это требует экс­периментального подбора критериев заполнения кровеносного русла для каждого исследуемого органа.
   Для предотвращения вытекания смолы из сосудистого русла после окончания инъекции лучше всего перевязать как артери­альные, так и венозные сосуды, а при инъекции лимфоносного русла - лимфатические сосуды.
   Некоторые ИМ вызывают спазм сосудов. Для его предупреж­дения рекомендуется добавлять в отмывочные растворы различ­ные сосудорасширяющие вещества, например, 1х10-7 г/мл папа­верина, 0.5-1.0 % новокаина и др. Хорошо предупреждает сосуди­стый спазм добавление в промывающий раствор дроперидола (0.15 мг на 1 кг массы) и ионов магния. Спектр вазодилятаторов довольно широк, и необходимо подбирать препараты в зависимо­сти от конкретного органа и цели эксперимента. Предварительная перфузия органа нагретым до 50-55®С промывающим раствором решает проблему спазма, но не является физиологической (см. гл. 2).
   Предложен метод медленной инъекции смолы в условиях ох­лаждения. Для этого после отмывания крови орган охлаждают до 0®С и в течение 10 мин под небольшим давлением медленно вво­дят ИМ. Метод дает более полноценное заполнение сосудистой се­ти.
   Для большинства органов разработаны модификации метода СЭМКП с целью наилучшего заполнения микроциркуляторного русла. Быстрое окрашивание легких при наиболее низком из воз­можных инъекционном давлении - первичный критерий для успешного получения коррозионных препаратов. В мышцах лучшее заполнение кровеносного русла достигается без промывания соле­вым раствором. Сама по себе инъекция ИМ в сосуды приводит к сокращению скелетной и сердечной мышц [10, 19].
   Для заполнения кровеносного русла матки в левую маточную артерию и в левую вену вводят гибкие полиэтиленовые канюли. Правые сосуды плотно перевязывают на уровне матки. Матка дол­жна оставаться влажной. Для уменьшения нарушений микроциркуляторного русла желательно избегать механических воздействий на нее. Нельзя допускать подсыхания поверхности органа - это ведет к нарушению микроциркуляции.
   Очень важна стандартизация инъекционной техники. Лучшие результаты получены при инъекции, которая выполнена как мож­но быстрее после смерти. Например, в случае инъецирования уда­ленной во время операции человеческой матки нежелательно допускать ее охлаждения. Рекомендуется поддерживать t=37®С как самого органа, так и инъекционной массы. Наличие миом и дру­гих опухолевых структур затрудняет инъецирование. Промывание физиологическим раствором приводит к ухудшению результатов инъекции, поскольку из-за отека интерстиция происходит сдавли­вание кровеносных микрососудов. Установлено, что кровь можно вытеснять непосредственно с помощью ИМ с гораздо лучшими результатами. Нежелательно, чтобы время между наступлением смерти и началом инъекции превышало 12 ч [10, 19].
   Для выявления мест разрывов микрососудов иссеченный ор­ган можно проперфузировать разведенным раствором гематокси­лина или другого красителя. Участки окрашивания межуточного вещества указывают на локализацию разрывов в стенке сосудов.
   Направление потока крови в получаемых коррозионных препа­ратах можно определить с помощью инъекции микросфер. Сосу­дистое русло нефиксированных тканей и органов лучше заполня­ется смолой, однако в объектах, заполненных после фиксации, по­верхность слепков содержит больше деталей.
   При заполнении сосудистой системы через венозную сеть плотность получаемых слепков значительно выше, чем в случае заполнения сосудов через артерии [10, 19].
  

20.1.3. Инъекционные массы

  
   Качество препаратов, воспроизводимость результатов и появ­ление артефактов во многом определяются свойствами используе­мой ИМ. Можно сформулировать основные требования, которым должна отвечать идеальная ИМ: 1) гидрофобность; 2) низкая (5-10 сП) вязкость в мономерном состоянии и возможность ее уве­личения до 500 сП; 3) возможность ее окрашивания без сущест­венного изменения вязкости; 4) высокая скорость полимеризации при комнатной температуре, произвольно изменяемая в пределах 5-40 мин и более; 5) минимальная (до 1-2 %) усадка в процессе полимеризации; 6) резистентность получаемых слепков к дейст­вию кислот и щелочей; 7)устойчивость слепков под электронным пучком в вакууме; 8) биологическая инертность и нетоксичность; 9) возможность варьирования ригидностью полимера (от хрупко­го до пластичного состояния); 10) электропроводность.
   В зависимости от цели исследования в качестве ИМ можно ис­пользовать полиэфирные смолы (ПН-8, ПН-9 и др.), силиконо­вые резины, различного рода латексы, предполимеры метилметак-рилата (ММА), другие смолы акрилового ряда (ТГМ-3, норакрил и др.). Однако все они обладают теми или иными недостатками. В качестве ИМ используются ненасыщенные полиэфирные смолы (например, трилон, который полимеризуется при t=32®С, усадка не более 2 %). Предложена новая пластмасса Термокол [136].
   Латексы имеют вязкость около 25 сП, они коагулируют при изменении рН. Например, сдвиг рН с 8.0 до 7.4 вызывает коагуля­цию некоторых латексов. Из-за наличия в латексах частиц диамет­ром 0.1 мкм они довольно плохо выявляют внутреннюю поверх­ность сосудов. Успешно используется также полидиметилсилокса-новый каучук с вулканизатором - тетраэтоксиланом и катализато­ром холодного отвердения - октоаттом олова. На 10 мл каучука добавляют 0.3 мл тетраэтоксисилана и 0.1 мл окоата олова. Смесь перемешивают 1-2 мин. Время отвердения 20-25 мин при t=20®С.
   Прекрасные результаты дает использование коммерческих смол: Батсон-17 (Batson-17) и особенно Меркокс-С (Мегсох-С). Среди отечественных ИМ наиболее удобны предполимер ММА, латексы, ТГМ-3. Сравнение различных пластмасс показало, что ММА дает усадку 20 %, а Меркокс - до 6 %. Из-за своей меньшей гидрофобности ММА рекомендуется для репликации влажных структур. ММА более резистентен по отношению к кислотам и щелочам, чем Меркокс. ММА стабилен при нагревании до t=44®С, а Меркокс - только до 33®С. Поэтому Меркокс не реко­мендуется сильно нагревать. Обычно на 5 мл смолы Меркокс до­бавляют 0.1 мл ускорителя. Сосудистые сети типа "чудесных" (с двумя последовательными капиллярными сплетениями) хорошо наливаются, если в Меркокс добавить 20-30 % ММА. Инъекцию желательно осуществлять под умеренным давлением со скоростью 10 мл/мин.
   ИМ Батсон-17 составляют из 25 мл мономера, 7.5 мл катали­затора, 0.5 мл промотора (ускорителя) и 12 мл наполнителя. Для лучшей полимеризации коррозионный препарат рекомендуется нагреть до t=80®С. Обычная смола Батсон-17 имеет вязкость 261 сП, что слишком много для микрососудов скелетных мышц. Из-за высокой вязкости и невозможности контролировать инъек­ционное давление возникает много течей. Усадка у смолы Батсон не превышает 1 %. В ряде случаев используется другое соотноше­ние компонентов: 20 мл мономера; 4 мл катализатора; 0.3 мл ус­корителя; эту смесь затем перемешивают с 20 мл чистого ММА. Готовая смесь затвердевает через 1 ч.
   Коммерческие метакрилаты, к которым добавлен гидрохинон в качестве стабилизатора, можно хранить при комнатной температу­ре. Очищенные метакрилаты легко полимеризуются при комнат­ной температуре, поэтому их надо хранить в холодильнике в тем­ноте.
   Для приготовления предполимера ММА коммерческий моно­мер очищают от гидрохинона путем 6-кратного встряхивания в делительной воронке смеси одинаковых объемов мономера и 3%-ного раствора КОН. Далее мономер отмывают от щелочи водой до исчезновения щелочной реакции и высушивают над прокаленным хлористым кальцием.
   Если в качестве ИМ используют некоммерческий латекс, то перед началом инъекции его необходимо тщательно профильтро­вать 2-3 раза через 5-6 слоев марли [10, 19].
  

20.1.3.1. Очистка метилметакрилата

  
   ММА наливают в делительную воронку, заполняя им 1/3 сосу­да. Затем туда прибавляют такой же объем 5%-ного раствора соды или 3%-ного раствора КОН. Смесь несколько раз энергично встряхивают и оставляют в делительной воронке для отстаивания (при наличии в ММА стабилизатора - гидрохинона - раствор со­ды, скапливающийся внизу, приобретает желто-коричневый цвет). Раствор соды сливают. Добавляют новую порцию соды и повторя­ют весь процесс несколько раз, до тех пор пока отстаивающийся раствор не будет прозрачным и бесцветным. После этого ММА точно так же многократно промывают водой для удаления щелочи до нейтральной реакции последней порции воды.
   Отмытый ММА содержит до 1 % воды, которую надо удалить. Для этого ММА фильтруют через сухую фильтровальную бумагу в склянку, содержащую несколько кусочков прокаленного кальция, склянку закупоривают, ММА оставляют на 1-2 сут для извлечения воды и снова фильтруют. Можно удалять воду и путем фильтрова­ния через плотный бумажный фильтр с насыпанным в него про­каленным хлористым кальцием или сернокислым натрием. На дно сосуда также надо насыпать немного прокаленного хлористого кальция.
   Для хранения очищенного ММА лучше использовать бутылки с двойными пробками и держать их в холодильнике. Прежде чем открыть взятую из холодильника бутыль, ее надо нагреть до комнатной температуры. Непосредственно перед употреблением можно снова профильтровать метакрилат через хлористый каль­ций. Очистка ММА может быть проведена и другими более совре­менными способами в оснащенной химической лаборатории [10, 19].
  

20.1.3.2. Приготовление предполимера ММА

  
   После очистки к ММА добавляют 1 % сухой перекиси бензоила (ПБ) и смесь нагревают на водяной бане до 87®С. Как только вязкость ММА достигает вязкости 15-20%-ного глицерина, пред-полимер быстро охлаждают. Чем выше температура хранения пре-полимера, тем быстрее повышается его вязкость. При нулевой температуре этот процесс растягивается на 1-2 мес. Поэтому гото­вое вещество хранится в холодильнике при t < 0®С. Вязкость предполимера ММА может быть уменьшена путем разбавления мономером или другими акрилатами, например гидроксипропил-метакрилатом.
   Предполимеризация ММА может быть осуществлена и другим способом. ММА нагревают до вскипания (т.е. до 140-160®С). Для этого нужное количество метакрилата наливают в широкодонную колбу (столб жидкости не должен превышать 1-2 см) и нагревают на плитке. При этом происходит частичная полимеризация моно­мера, удаляются растворенные в нем газы и следы воды, которые создают серьезные помехи для перехода мономера в полимер. По­сле вскипания колбу немедленно охлаждают в ледяной воде. Пред-полимер должен легко стекать каплями с опущенной в него и из­влеченной стеклянной палочки. Перед инъекцией в нагретый по­сле взятия из холодильника предполимер добавляют 1.5 % ПБ или двухлорной ПБ и оставляют на 10-12 ч до полного ее растворения. Для более быстрого растворения инициатор растирают стеклянной палочкой.
   Согласно другой прописи в мономер добавляют 1 % ПБ и облучают УФ-светом с длиной волны 280-320 нм в течение 100-160 мин, периодически контролируя вязкость ММА. Для про­ведения предполимеризации ММА УФ-лампу помещают на рас­стоянии 3 мм от объекта. Полимеризация завершается в течение одной ночи.
   Наконец, можно с помощью УФ-облучения предполимеризовать 20 мл ММА, его вязкость должна увеличиться до 2.3-4.0 сП (необходимо постоянно контролировать вязкость жидкости). Пол­ностью ММА можно заполимеризовать с помощью УФ-облучения в течение 18 ч. В указанном количестве предполимера растворяют 250 мг ПБ. В отдельной чашке смешивают 7 мл гидроксипропилметакрилата и 0.4 мл диметиланилина. Перед самой инъекцией эти два состава смеси перемешивают.
   В качестве инициатора можно применять чистую гранулиро­ванную перекись 1,2-дихлорбензоила, либо простую ПБ. Перед употреблением ПБ надо тщательно высушить на фильтровальной бумаге в эксикаторе или термостате при t=37®С в течение 30 мин. Для удобства работы можно использовать Люперко, кото­рая представляет собой пасту, состоящую из 60 % ПБ и 40 % дибутилфталата (ДБФ) или равных их частей. Перекись бензоила должна храниться в темноте в этаноле. После добавления ПБ поли­меризация ММА может происходить и при комнатной температу­ре, однако этот процесс идет медленно (несколько суток).
   Для окрашивания ИМ обычно в нее добавляют сухие анилино­вые красители (0.1 % судана, 0.1 % генцианвиолета и др.), не обла­дающие химической активностью [10, 19].
  

20.1.4. Полимеризация

   Непосредственно перед инъекцией в предполимер ММА добав­ляют и тщательно перемешивают 1-2% ПБ и 2% диметиланилина (ДМА). Скорость полимеризации зависит от количества введенно­го ускорителя и активатора и составляет при данных условиях от 10 до 50 мин. Катализаторы отличаются от инициаторов тем, что они не входят в состав молекул образующегося полимера. Скоро­сть реакции полимеризации пропорциональна квадратному корню из концентрации ускорителя. Полимеризация смолы сопровожда­ется выделением тепла, что может служить признаком начала пол­имеризации.
   Пластичность готовых слепков можно повысить путем добав­ления в ММА до 10 % ДБФ. Для предотвращения высыхания и де­формации при этом органа полимеризацию желательно проводить под слоем жидкости. Указанное условие важно также и потому, что контакт с воздухом замедляет полимеризацию. Скорость полиме­ризации увеличивается при повышении температуры образца. Для удаления пузырьков воздуха из смолы перед началом инъекции рекомендуется помещать ее на 2-3 мин в вакуум.
   Самым существенным артефактом полимеризации является усадка, степень которой у различных смол варьирует, а у рекомен­дованного нами предполимера ММА не превышает 1-2 %. Для точного определения степени усадки проводят полимеризацию ИМ в запаянной стеклянной трубке, а размеры полученного слеп­ка сравнивают с таковым у трубки. Следует отметить, что степень усадки по всем направлениям одинакова и поэтому не нарушает топологических отношений между структурными элементами.
   Для полной полимеризации смолы надо выдержать слепок в течение 5 ч при комнатной температуре [10, 19].

20.1.5. Коррозия тканевых объектов

  
   В зависимости от используемой ИМ для растворения тканей применяют щелочи (20-30%-ные растворы КОН или NaOH), кис­лоты (HCl,H24 и др.), гипохлорит натрия, ферментативное рас­щепление и другие мацерирующие процедуры. После окончания полимеризации ИМ объект помещают в мацерирующий раствор (обычно 25%-ный раствор щелочи при 50-60®С), в случае исполь­зования в качестве ИМ латекса объект корродируют в растворе со­ляной кислоты. Время процедуры зависит от вида ткани.
   Небольшие блоки мацерируются в растворе едкой щелочи в течение 24 ч при t=40®С. Далее следуют промывание в воде в течение 12 ч и замораживание-высушивание. Особые затруднения вызывает коррозия фиксированных объектов. Для удаления нео-тмытого материала можно использовать ультразвуковые колеба­ния в присутствии слабого раствора ионного детергента или крат­ковременные (3-5-минутные) воздействия 1 М НСl сразу после извлечения объекта из щелочи. Чередование кислоты и щелочи ускоряет процесс мацерации.
   Растворение кости вокруг слепков можно производить с по­мощью 5-7%-ной трихлоруксусной кислоты, удаление возникаю­щих газовых пузырей осуществляется путем осторожного промы­вания тонкой струей воды. В противном случае пузыри увеличива­ются в размерах и могут повреждать объекты [10, 19].
   Большие возможности предоставляет метод "дозированного травления", в процессе которого происходит неполная или избира­тельная коррозия тканевых структур. Как правило, ступенчатое
   (дозированное) травление производят в растворах кислот или щелочей при возрастающей их концентрации. В каждой порции кор­родирующего раствора объект находится от нескольких минут до 2-3 ч в зависимости от его величины, вида ткани и цели исследо­вания. Помимо-обычных коррозионных и мацерирующих сред при дозированном травлении можно использовать ферменты (трипсин, панкреатин) и детергенты, растворяющие лишь мемб­ранные (липосодержащие) структуры. Можно применять не пол­ностью очищенные высушенные реплики микрососудов для ана­лиза в СЭМ. При этом создаются условия для визуализации неко­торых структурных элементов стенки сосуда - выявляются распределение гладких миоцитов, архитектоника волокнистого каркаса и т.п. [203].
   Следует помнить, что при использовании горячего раствора щелочи возможно частичное растворение плохо заполимеризованной ИМ. Разбавление же предполимера мономером может приво­дить к образованию характерного "изъеденного" рельефа поверхности.
   Высушивание препаратов, если реплики достаточно ригидны, проще всего проводить на воздухе. Напротив, если полимер пол­учился мягким, то этот метод вызывает коллапс сосудистых кон­струкций. В данном случае можно использовать ВКТ или замораживание-высушивание [10, 19].
  

20.1.6. Микродиссекция объектов

  
   Диссекция органа для обнажения внутренних структур прово­дится перед началом коррозии, после высушивания реплик, во время просмотра объекта в СЭМ с помощью встроенного в колон­ну микроманипулятора. От качества диссекции во многом зави­сит, насколько информативна будет полученная картина. Предва­рительное просветление некоррелированных тканевых блоков позволяет выбрать нужный план для среза объекта и прицельного обнажения интересующих исследователя участков органа. При изучении пространственной организации сложно устроенных кон­струкций, например клубочков почки, рекомендуется растягивать реплики под контролем микроскопа. Эта процедура облегчается после размягчения объектов. В случае ММА объекты выдерживают в 100%-ном этаноле в течение 60 мин при температуре 30-40®С или же добавляют ДБФ в предполимер ММА. Для микродиссекции применяют луч лазера и встроенные в СЭМ микроманипуля­торы. Чтобы предотвратить спадение слепков, используют метод лиофилизации.
   Микродиссекцию объектов лучше проводить под слоем жидко­сти - они меньше повреждаются. Кроме того в теплой воде корро­зионные препараты становятся более гибкими.
   При диссекции коррозионных препаратов с целью получения хорошего сечения слепка их заключают в 20%-ный раствор жела­тины, замораживают в жидком азоте и раскалывают ударом лез­вия ножа. Затем желатину, как и ткань, растворяют в 40%-ном растворе едкого натра. Можно после мацерации просто заморозить слепок в воде и с помощью микротомного ножа изготовить срезы толщиной 2-3 мм, которые затем полируют в жидком азоте на на­ждаке до получения гладкой поверхности. Наконец, коррозионные препараты можно поместить в третичный бутиловый спирт, замо­розить (t=4®С), разрезать бритвой и лиофилизировать [263].
  

20.1.7. Подготовка слепков для исследования в СЭМ

  
   Монтирование препаратов на столики осуществляется с по­мощью электропроводящих клеев. В случае слабого крепления коррозионного препарата к столику возможно движение ("кача­ние") реплики. Для анализа препаратов в СЭМ необходимо, чтобы происходило удаление накапливающихся электростатических за­рядов, т. е. требуется обеспечение электропроводности реплик (см. гл. 19).
  

20.2. СЭМ-АНАЛИЗ

  
   При изучении препаратов в микроскопе мы рекомендуем вна­чале провести обзорный анализ реплики (выбор нужных зон, об­щая оценка качества заполнения исследуемой полости, регистра­ция артефактов), затем осуществить прицельный последователь­ный анализ по сегментам, а под большим увеличением - изучение рельефа. Наконец, желательно выявить специфику ткане­вой организации или органной специализации микроциркуляторного русла.
   Следует, однако, помнить, что фотография, получаемая в СЭМ, только создает впечатление трехмерности. На самом же деле это лишь проекция трехмерного изображения на плоскость, поэтому истинные размеры и форма объекта в этом случае искажаются. Для получения трехмерной оптической модели используют мето­дику получения стереопар.
   Морфометрия трехмерных изображений может производиться только после реконструкции трехмерного объекта, что обычно за­вершается получением либо профильных диаграмм (пакет срезов, перпендикулярных поверхности объекта), либо контурных карт (серия срезов, параллельных поверхности образца). Однако техни­ческие сложности, возникающие при реализации этих способов, делают их неэкономичными для рутинных работ. Гораздо проще измерить тот или иной объект на стереопарах и по специальной формуле вычислять его реальные размеры.
   На репликах микрососудов можно проводить последователь­ный анализ "тройников" - мест ветвления сосудов (измерение уг­лов между ветвями, соотношений диаметров и т.п.), что может быть полезным при расчете гемодинамических параметров сосу­дистого русла. Можно измерять отпечатки эндотелиальных клеток: соотношение длины и ширины, угол отклонения от оси сосуда. Наконец, возможен анализ васкуляризации целостных органов пу­тем определения объема целого органа до коррозии и после, одна­ко для этого необходимо полное заполнение русла при физиологи­ческом давлении и сохранение всего слепка.

20.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ

20.3.1. Маркировка межклеточных контактов

  
   Метод основан на свойстве ионов серебра адсорбироваться на параплазмалеммальном покрытии клеток в области интерцеллюлярных стыков. Для этого после промывания органов последние перфузируют 0.05-0.1%-ным изоосмотическим раствором азотно­кислого серебра (нельзя использовать буферные растворы, содер­жащие ионы, с которыми ионы серебра образуют малораствори­мые соединения), а затем в сосуды вводят ИМ. Клеточные грани­цы выявляются в виде линейных углублений вокруг ядер эндотелиоцитов.

22.3.2. Дифференцировка сегментов микроциркуляторного русла

  
   Идентификация артериальных и венозных звеньев сосудистого русла может достигаться путем последовательной инъекции раз­лично окрашенных порций ИМ. При этом под микроскопом кон­тролируют тот момент, когда вторая порция достигает уровня артериол, после чего инъекцию прекращают. Для дифференцировки различных звеньев микроциркуляторного русла на слепках с успе­хом используют градиент формы и ориентации отпечатков ядро-содержащих зон эндотелиальных клеток или их контуров.
   В ряде органов (например, сальник) при антеградном введении ИМ не всегда происходит универсальное заполнение всех сегмен­тов сосудистого русла. В этом случае используют ретроградное введение ИМ через отводящие венозные сосуды, поскольку со сто­роны венулярного отдела практически нет сфинктеров. Однако при этом чаще возникает экстравазация ИМ.
   В некоторых случаях для выявления особенностей микроангиоархитектоники рекомендуется частичное (до уровня прекапиллярных сфинктеров) заполнение сосудистого русла. Густые капил­лярные сети при таком подходе не мешают изучению ветвления артериальных сегментов микроциркуляторного русла. Указанную цель легко реализовать, используя смолу повышенной вязкости.
   При наличии специальных задач применяется двойная инъек­ция - одновременное заполнение различных полостей одного и того же органа, например сосудистых и воздухоносных полостей легких, что позволяет изучать их пространственные взаимоотношения.
   Для выявления тканевых (интерстициальных) каналов можно рекомендовать несколько технических приемов, например введе­ние ИМ непосредственно в интерстиций и стимуляция так назы­ваемых течей из микрососудистого русла. Последнего можно добиться предварительным введением гистамина для раскрытия межэндотелиальных контактов или заполнением микрососудисто­го русла ритмично сокращающегося органа, например сердца [10,19].
  

20.3.3. Одновременный анализ микрососудов с помощью СЭМКП и ТЭМ

  
   После отмывания сосудистого русла от крови проводят кратко­временную перфузионную фиксацию 0"5%-ным раствором ГА, за­тем в сосуды вводят ИМ, ее полимеризацию осуществляют в 2%-ном растворе ГА. Перед коррозией орган разрезают (или раскалы­вают после замораживания) на две части. Одну половину объекта готовят для ТЭМ, заключая ее в ИМ (например, в предполимер ММА). ПС и УС готовят непосредственно со срезанной (сколотой) поверхности объекта. Вторая половинка подвергается коррозии, а коррозионный препарат монтируют на столике срезанной (сколо­той) поверхностью вверх. Таким образом удается проследить как пространственную архитектонику микрососудов, так и ультратон­кую организацию их стенок. Введение с ИМ электронно-плотного вещества, например взвеси благородного металла, при параллель­ной стимуляции образования "течей" дает возможность использовать маркерные свойства ИМ. При этом сочетание методов СЭМКП с ТЭМ при использовании УС позволяет не только опре­делять наличие и локализацию "течей" на слепках микрососудов, но и находить пути трансмурального транспорта маркера [3].
  

20.4. СЭМКП ДРУГИХ ПОЛОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

  
   Метод СЭМКП может быть использован для анализа и других полостей организма: воздухоносных полостей, спинномозгового канала, желудочков мозга, железистых протоков, семенных ка­нальцев и т.д. Для получения коррозионных препаратов воздухоносных путей в трахею вставляют канюлю. Из легких с помощью шприца отсасывают воздух до их максимального спадения, затем в бронхи вводят ИМ таким образом, чтобы объем легких был ра­вен прижизненному. Дальнейшие манипуляции те же. Важным применением метода СЭМКП является микроинъекция пункционных биоптатов различных органов [10, 19].
  

20.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЙ

  
   Рельефные образования на слепках классифицируются следую­щими образом: 1) продольные складки, которые, как правило, рас­полагаются на уровне мелких артериол и отражают наличие тонуса в клетках мышечной оболочки сосуда; 2) циркулярные складки к перехваты на уровне артериол чаще всего соответствуют локализа­ции сфинктеров, отдельных гладких мышечных клеток или пери­цитов; 3) петлистая сеть мелких бороздок представляет собой от­печатки границ эндотелиальных клеток (при использовании мето­да маркировки межклеточных контактов) или волокнистого каркаса сосудистой стенки; 4) овальные или округлые углубления соответствуют отпечаткам ядросодержащей зоны эндотелиоцитов; 5) почкующиеся или грыжеподобные выпячивания представляют собой так называемые течи, или экстравазаты, ИМ; 6) глубокие шароподобные вдавления соответствуют прилипшим или неотмытым клеткам крови; 7) циркулярные колечки с заостренными кон­цами, наблюдаемые обычно на слепках артериальных сосудов, соответствуют заполненным смолой ложам гладких мышечных клеток (это обусловлено тем, что течи ИМ проникают в соедини­тельнотканные влагалища гладкомышечных клеток сосудистой стенки, что и дает картину циркулярных полосок).
   Слепо оканчивающиеся концы коррозионных препаратов могут быть следствием неполного заполнения, сдавливания сосу­дов, их пролиферации или представлять собой сломанный слепок. Истинный капилляр в мышцах надо измерять на точке последнего деления артериолы, а конец его там, где он присоединяет другой капилляр и переходит в венулу или же под прямым углом входит в большую венулу.
   При визуализации тканевых каналов ИМ часто заполняет лимфатические сосуды, которые надо уметь отличать от течей, распространяющихся по тканевым каналам. Сети лимфатических сосудов имеют вид цепочек баллоноподобных уплощенных струк­тур-синусов, между которыми располагаются V-образные перетяжки, соответствующие клапанам. Кроме того, лимфатиче­ские сосуды топографически тесно связаны с венулярными сегментами микроциркуляторного русла. Основными рельефны­ми образованиями лимфатических сосудов являются отпечатки клапанов, ядерные импрессии, расположение которых хаотично, и бороздки - отпечатки окружающих соединительнотканных воло­кон [10, 19].
   Глава 21 Маркеры в электронной микроскопии (Глава подготовлена в соавторстве с М.Д.Рехтером)
   Маркер (Мр) - это вещество или частица, хорошо выявляе­мые в ЭМ. Идеальный Мр должен отвечать следующим требовани­ям: 1) быть видимым и легко идентифицироваться в ЭМ соответ­ствующего типа; 2) иметь определенный размер, форму или ком­позицию; 3) быть стабильным по отношению к агрегации или деградации в растворах, используемых в процессе препарирова­ния; 4) прочно связываться с объектом за счет сильного специфи­ческого связывания; 5) иметь минимальное неспецифическое свя­зывание с клеточной поверхностью; 6) обеспечивать возможность количественного подсчета частиц; 7) позволять проводить иссле­дования препаратов как в СМ, так и в ЭМ. Мр для СЭМ должны иметь определенные размер, форму или композицию, позволяю­щие опознать их среди других рельефных образований клеточной поверхности [182].
   Все Мр можно разделить на три группы: 1) естественные элек­тронно-плотные частицы (например, ферритин, гемоцианин, ви­русы; последние две группы Мр чаще используют в СЭМ); 2) ис­кусственные электронно-плотные частицы (обычно КЗ); 3) ферменты (чаще всего ПХ). По другой терминологии их относят к биологическим и синтетическим. Главным недостатком биологи­ческих Мр является их нестабильность при длительном хранении. Они могут быть подвержены денатурации, протеолитической деградации и агрегации. Синтетические же Мр стабильны и могут храниться длительное время.
   К настоящему времени предложено множество биологических (ферритин, гемоцианин, ПХ, вирусные частицы, бактериофаги) и синтетических (полистирольные, метакрилатные, кремниевые, железные и декстран-железные комплексы и т.п.) Мр, а также ряд радиоактивных изотопов. Однако применение каждого из них имеет существенные ограничения. Особое место в этом ряду зани­мает КЗ, которое в настоящее время используется наиболее широ­ко [62].
  

21.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

  
   Ферритин, железосодержащий белок - один из широко используемых Мр. В ЭМ частица ферритина выглядит как элект­ронно-плотная частица с диаметром 5.5 нм. При малых увеличе­ниях ферритин очень трудно идентифицировать. Увеличение его размеров и электронной плотности проводят с помощью реакции с ферроцианидом свинца или с помощью окрашивания УС суб­нитратом висмута. В последнем случае диаметр электронно-плот­ной частицы увеличивается в 2 раза за счет осаждения металличе­ского висмута в обычно невидимой протеиновой оболочке [302].
   Ферритин для маркирования ЭМ-объектов получают по следу­ющей схеме: кристаллизация белка в 5%-ном сульфате кадмия, преципитация в 50%-ном сульфате аммония и ультрацентрифуги­рование. Замороженный или лиофилизированный ферритин не может быть использован в качестве Мр. Ферритин связывают с молекулой антитела с помощью бифункциональных реагентов, на­пример толуол-2,4-диизоцианата. При высоких разрешениях ЭМ молекула ферритина выявляется в виде квадрата с уплотненными в углами [215].
   Гемоцианин - пигмент из гемолимфы морских ракообразных и моллюсков. Молекула гемоцианина имеет циллиндрическую форму (диаметр 35 нм, длина 50 нм). В зависимости от ориента­ции молекула гемоцианина имеет округлую или прямоугольную форму и может быть легко идентифицирована. Он обладает высо­кой аффинностью к конканавалину А. Вместе с тем выявлено не­большое неспецифическое связывание гемоцианина с клеточной поверхностью. Замораживание вызывает необратимую агрегацию гемоцианина. Поскольку агрегация наблюдается даже в случае хранения при t=4®С, рекомендуется проводить повторную гель-хроматографию на сефарозе-2В непосредственно перед мечением.
   Частицы комплекса декстран-железо обычно ковалентно свя­зывают с IgG. Они имеют игольчатую форму и размеры 3-12 нм. Это свойство помогает отличать их от ферритина при двойном мечении [24].
  

21.2. ВИРУСНЫЕ МАРКЕРЫ

  
   Вирусные частицы, в основном вирус табачной мозаики, ис­пользуют как Мр в СЭМ. Они имеют характерную палочковидную форму и размеры 15-25 х 300 нм.
   Бактериофаг Т-4 имеет гексагональную головку и длинный па­лочковидный хвост. Вследствие больших размеров он пригоден лишь в том случае, когда не требуется высокая разрешающая спо­собность, например при сравнении интенсивности мечения раз­личных эндотелиоцитов. Используются и другие растительные ви­русы различной формы и размеров.
  

21.3. ФЕРМЕНТЫ

  
   Применение ферментов в качестве Мр имеет определенные минусы. При этом, как правило, включаются две дополнительные обработки и соответственно два промывания, во время которых УС могут повреждаться. Кроме того, процедура окрашивания удлиняется и встает проблема блокирования эндогенной пероксидазной (или иной ферментативной) активности.
  

21.3.1. Пероксндаза хрена (ПХ)

   Молекулярная масса ПХ 40 тыс., диаметр молекулы 5 нм, под ЭМ она невидима. Вследствие высокого содержания углеводов она обладает сильным сродством к молекулам маннозоспецифичных лектйнов. С помощью ПХ можно маркировать лиганды для СМ, ТЭМ, СЭМ. В последнем случае лиганд имеет вид частичек раз­личного диаметра. Для присоединения ПХ к антителам чаще всего используют ГА (о методах конъюгации антител с ПХ см.: [66]). Для увеличения выхода продукта реакции (окисленного ДАБ) мо­жет применяться хлорид золота.
   В процессе реакции на ПХ окисление ДАБ происходит на уровне аминогрупп, и после полимеризации ДАБ-полимеры вы­являются в СМ как коричневый осадок. Для визуализации их в ЭМ аминореактивные группы используют для восстановления ЧО до осмиевой черни. Чтобы усилить реакцию на ПХ, инкубацию с ДАБ ведут в присутствии 0.01 М имидазола. Оптимум рН пероксидазной реакции около 5.0. Чувствительность метода в этой обла­сти рН действительно возрастает, однако продукт реакции может диффундировать из места своего образования и кристаллизовать­ся. В связи с этим реакцию обычно ведут при нейтральном рН. До смешивания с субстратом рН раствора имидазола доводят до ней­трального при помощи 1 М НСl.
   Использование ПХ в качестве Мр имеет определенные недо­статки: 1) продукт реакции на ПХ трудно отличить на контрасти-рованном УС; 2) он имеет тенденцию к диффундированию от ме­ста своего образования; 3) этот продукт часто маскирует окружаю­щие структуры, затрудняя идентификацию ультраструктур [325].
   Если при проведении иммуномечения наблюдается избыточ­ная диффузия продукта реакции с ДАБ, то следует увеличить раз­ведение сыворотки, сократить время обработки объектов в инкуба­ционной среде или концентрацию в ней субстрата.
   Для блокирования эндогенной ПХ применяют либо погруже­ние препарата в 0.3%-ный раствор перекиси водорода в метаноле или в буфере, либо обработку объектов периодатом, борогидридом, нитроферрицианидом натрия или фенил гидразином.
   Если перед проведением реакции на пероксидазу объекты бы­ли осмированы, то осмий желательно удалить с помощью насы­щенного раствора метапериодата натрия. Если применяется ре­жим постэмбеддинга, то после обработки в инкубационной среде и промывания УС желательно обработать в растворе 40 на биди-стиллированной воде (при такой обработке увеличивается плот­ность осадка ДАБ). Нельзя использовать буферные растворы ЧО, поскольку в этих условиях осмируются добавочные тканевые ком­поненты, что ведет к ошибкам в интерпретации результатов. По этой же причине сеточки лучше не контрастировать в УА и ЦС [116]. В процессе реакции на пероксидазу на ПС широко использу­ют никелевое усиление (см. Приложение, 21.6).
  

21.3.2. Щелочная фосфатаза и гпюкооксидаза

   Щелочная фосфатаза в качестве Мр используется редко, по­скольку этот фермент часто встречается в тканях. Эндогенную ще­лочную фосфатазу блокируют инкубацией в 20%-ной уксусной кислоте. Напротив, достоинством глюкозооксидазы является то, что она отсутствует в животных тканях и нет необходимости бло­кировать эндогенный фермент.
  

21.4. СИНТЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

   Полистирольные и метилметакрилатные микросферы, несмот­ря на ряд преимуществ (стабильность, легко распознаваемая форма), используют редко вследствие их относительно крупных размеров и слабого нековалентного связывания с лигандами (например, с лектинами). Карбоксилирование полистирольных латексовых сфер улучшает их качество.
   Сополимерные микросферы полимеризуются из ММА, гидроксиэтилметакрилата, метакриловой кислоты и этиленгликольдиметакрилатных мономеров. Размеры синтезируемых микросфер составляют от 30 до 340 нм. Поверхность сфер гидрофильна, что связано с наличием большого числа гидроксильных и карбоксиль­ных групп. Гидроксильные и карбоксильные группы микросфер могут быть использованы для их ковалентного связывания с флю­оресцирующими красителями, радиоактивными изотопами и лек­тинами. Включение коллоидной окиси железа в микросферы дела­ет их доступными для анализа в ТЭМ.
   Кремниевые микросферы со средним диаметром 13-5 нм син­тезируют путем полимеризации кремниевой кислоты. Электрон­ная плотность и форма позволяют использовать эти микросферы в качестве Мр для ТЭМ и СЭМ. С этой же целью предложены маннано- и декстран-железные комплексы. Однако значительная вариабельность размеров гранул и возможность агрегации снижают их качество как Мр. Особым родом Мр следует также считать ра­диоактивные изотопы. Выявление с их помощью лектиновых ре­цепторов строится на принципах метода ЭМ-АРГ.
   Хорошее маркирование белков может быть достигнуто включе­нием изотопов, например, 131I или 125I. Однако интенсивное иодирование ведет к быстро усиливающейся инактивации. Иммуноавторадиографические методы обеспечивают получение хоро­шей контрастности. Недостатками их являются низкая разрешаю­щая способность и необходимость больших временных затрат.
  

21.5. КОЛЛОИДНОЕ ЗОЛОТО (КЗ)

  
   Применение КЗ в качестве Мр основано на целом ряде его пре­имуществ по сравнению с другими Мр: 1) частицы КЗ имеют вы­сокую электронную плотность, что дает возможность контрастиро­вания УС, следовательно, проведение гистохимической реакции не ухудшает качества препарата; 2) мелкие частички КЗ (3 нм) не маскируют ультраструктуры; 3) частицы КЗ дискретны, поэтому поддаются количественному анализу; 4) частицы КЗ располагают­ся точно в месте локализации исследуемого лиганда; 5) можно получать гранулы КЗ заданного размера, что позволяет одновре­менно метить две молекулы или более; б) взаимодействие КЗ с макромолекулой стабильно и не влияет на активность белка; 7) не­специфическая адсорбция КЗ незначительна; 8) размер частиц КЗ можно увеличивать с помощью серебрения, что существенно рас­ширяет границы применения метода; 9) процедуры конъюгации с лигандами и мечения относительно просты; 10) КЗ обычно де­шевле других маркеров; 11) при СЭМ КЗ отличается хорошей эмиссией вторичных электронов, поэтому наложение сигналов вторичных и обратнорассеянных электронов позволяет точно соот­нести локализацию антитела с микрорельефом поверхности; 12) использование мечения КЗ и серебряного усиления на ПС обеспечивает хорошее выявление деталей и позволяет оценивать степень сохранности антигенов, что позволяет соотносить данные иммуно-ЭМ и СМ [171, 176, 191].
   При анализе частиц КЗ получаемое в обратнорассеянных элек­тронах изображение можно превратить в картину светящихся час­тиц на черном фоне [176]. С помощью КЗ метят микросферы, на­пример из агарозы или желатины, а затем изучают их фагоцитоз. Очень часто после негативного контрастирования бывает трудно различить вирусные частицы, если у них нет четко опознаваемой структуры. Мечение КЗ позволяет решить эту проблему. Частицы КЗ имеют красный цвет и могут быть полезны как краситель для ловикриловых ПС. При необходимости окраска может быть усиле­на с помощью серебряного усиления. Трудностью в исследовании ПС с меткой из КЗ даже после серебряного усиления является низкая интенсивность окрашивания. С помощью темного поля можно добиться эффекта усиления за счет отражения света части­цами металла - в этом случае объект светится. Еще большее уси­ление обеспечивает эпиполяризационная оптика [201].
  

21.5.1. Физико-химические основы получения комплексов белка с КЗ

  
   Процесс получения КЗ как Мр включает три основных этапа: приготовление КЗ, связывание золота с белком, очистку и концен­трирование продукта.
  

21.5.1.1. Получение КЗ

   Можно выделить следующие методы получения КЗ: с помощью тиоцианата, белого фосфора, цитрата и таниновой кис­лоты (ТК), борогидрида натрия, цитрата, этанола, аскорбиновой кислоты [169] (см. Приложение, 21.1).
   Чаще всего КЗ получают путем химической конденсации, ос­нованной на реакции восстановления золотохлористоводородной кислоты, например с помощью цитрата натрия. Размеры частиц КЗ и соответственно цвет раствора (от оранжево-красного до темно-бордового) зависят от количества восстановителя. Изменяя его объем, можно получить золь с диаметром частиц от 10 до 150 нм. Чем больше добавлено цитрата, тем меньше размер частиц и соот­ветственно светлее цвет коллоида. Следует отметить, что с увеличением размера растет гетерогенность частиц Мр.
   Другие восстановители (аскорбиновая кислота, ТК и др.) позволяют получать частицы КЗ одинакового размера. Особенно стабильные результаты дает метод с низкомолекулярной ТК. По­скольку в ряде случаев образуется полидисперсный золь, для получе­ния одинаковых частиц КЗ, например диаметром 8 нм, применяется центрифугирование в градиенте 10-30%-ного глицерина. Рекоменду­ется проводить фильтрацию и диализ полученного золя, что обеспе­чивает его стабильное хранение в течение нескольких месяцев. Час­тицы КЗ в коммерческих препаратах обычно монодисперсны с ко­эффициентом вариации размеров частиц не более 15 %.
   Очень важным вопросом является адекватный выбор величи­ны частиц КЗ. Частицы размером 20 нм хорошо различимы под малым увеличением, а частицы с размером 3-5 нм - только под большим. Выгоднее использовать частицы меньшего размера, так как они лучше стабилизируются белками, демонстрируют боль­шую эффективность мечения, дают более интенсивное окрашива­ние при последующем серебрении. Частицы КЗ диаметром 15 нм наиболее удобны для исследования - они легко идентифицируют­ся и не имеют недостатков, связанных с их пространственным расположением [62].
   Существуют методы получения сверхмалых частиц КЗ, кото­рые ковалентно связаны с Fab-фрагментом антител. Такая частица состоит из 11 атомов золота и имеет диаметр 0.9 нм. Расстояние от частицы до антигенного сайта около 4.5-5.0 нм. Они довольно глубоко проникают в крио-УС, однако, как правило, требуют се­ребряного усиления. Если размер частиц КЗ превышает 25 нм, то они начинают приобретать эксцентриситет и различные формы (пентагональную и гексагональную) [62].
   При каждом изготовлении КЗ, как правило, 5-8 % частиц об­разуют агрегаты. Их можно удалить с помощью короткого цент­рифугирования. Крупные агрегаты частиц КЗ отражают наличие загрязнений либо обусловлены высушиванием раствора на стен­ках во время кипячения. Обычно это происходит в том случае, ес­ли во время кипячения объем раствора уменьшается более чем на 40 %. Агрегации можно избежать, если использовать чистые реа­генты, посуду небольшого объема, во время кипячения приме­нять обратный холодильник.
   При увеличении температуры уменьшается размер частиц КЗ. Смешиваемые растворы желательно готовить ex tempore, обяза­тельно фильтровать и интенсивно перемешивать [62].
  

21.5.1.2. Измерение величины частиц КЗ

  
   Если в дальнейшем предполагается производить двойное мечение с помощью частиц КЗ разного диаметра, то точное определе­ние их размера приобретает принципиальное значение, тем более что многие коммерческие препараты КЗ значительно варьируют по размеру частиц. Для этого используют спектрофотометрию раствора или осуществляют прямое измерение в ЭМ. Каплю рас­твора КЗ наносят на сеточку, покрытую формваром, и высушива­ют. Для улучшения прикрепления мелких частиц рекомендуется покрытые формваром сеточки обработать в 0.01%-ном растворе поливинилпирролидона (ПВП) в течение 15 мин, промыть их и окунуть на несколько секунд в каплю КЗ. При негативном контр­астировании вокруг золотой гранулы наблюдается прозрачный ободок адсорбированного белка.
  

21.5.1.3. Стабилизация коллоида

  
   КЗ - это лиофобный коллоид (золь), частицы дисперсной фазы которого состоят из золотого центра (т. е. собственно гранулы золо­та), окруженного адсорбированными ионами, которые обусловлива­ют отрицательный заряд частиц. Стабильность коллоида (без добав­ления молекулярных стабилизаторов) определяется зарядом этих ионов и соответственно электростатическим отталкиванием частиц При увеличении ионной силы раствора слои гидратной оболочки сжимаются, позволяя частицам сблизиться друг с другом. Если сближение достигает критического уровня, то происходит их слия­ние и коагуляция коллоида. Добавление белка может защитить (ста­билизировать) коллоид от агрегации [62].
   Поскольку частицы КЗ не содержат на своей поверхности реак­ционных групп, белки физически адсорбируются на ней. Наиболее важную роль при этом играет электростатическое взаимодействие.
   Из общих соображений следуют по крайней мере два практически важных вывода: 1) белок не вступает в химическое взаимодействие с Мр и, следовательно, его структура и биологическая активность не нарушаются; 2) для предотвращения коагуляции коллоида электро­литами белок перед добавлением в раствор должен быть обессолен.
   Однородность частиц КЗ зависит от тщательности приготовле­ния растворов. При конъюгации КЗ с антителами последние при­соединяются к частицам золота за счет нековалентной адсорбции.
   Минимальное количество белка, необходимое для стабилиза­ции КЗ, можно установить следующим образом: к постоянному объему (1 мл) раствора КЗ с точно определенным размером час­тиц при оптимальном рН доливают 0.1 мл белка при серийных разведениях, а через несколько минут - 100 мкл 10%-ного рас­твора NaCl. Процесс флоккуляции оценивается спектрометрически (максимум поглощения 510-550 нм). Количество белка, которое способно предупредить флоккуляцию, и является искомой вели­чиной. Однако указанное количество зависит от размера частиц. Как правило, белок добавляют с избытком в 10-20 %. При конъю­гации КЗ с первыми антителами желательно использовать реаген­ты в соотношении 1:1.
   Свежеприготовленный раствор КЗ может храниться при t=4®С в стерильных условиях без потери стабильности. Мечен­ные белком частицы КЗ могут быть лиофилизированы для длительного хранения или очищены с помощью жидкостной хроматографии или путем фракционирования с помощью центри­фугирования в градиенте сахарозы.
   При работе с лектинами частицы КЗ можно вначале связать с овомукоидом (белок, специфически связывающийся с некоторы­ми лектинами, например лектином зародышей пшеницы и церулоплазмином, а также фетуином и ПХ).
   Растворы КЗ не рекомендуется хранить более года.
  

21.6. СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЗ

  
   Все реакции с использованием КЗ можно разделить на прямые и непрямые.
   Прямой метод включает лишь один этап - обработку препара­тов меченым лигандом, поэтому его основными преимуществами являются простота и быстрота проведения реакции. Недостаток его состоит в необходимости специального приготовления каждого меченого белка. Однако если конъюгация с такими Мр, как ферри­тин или ПХ, технически трудна, то связывание большого числа различных молекул с КЗ однотипным методом не представляется сложным и существенно расширяет возможности прямого выяв­ления рецепторов и макромолекул. КЗ стабильно связывается с иммуноглобулинами, гормонами, нативными и ацетилированными липопротеидами, лектинами (62, 169].
   Например, непосредственно связываются с КЗ лектины клеще­вины, арахиса, сои и улитки. Однако не все лектины способны ста­билизировать золь золота. Если это вызвано наличием в препарате белка примесей, то дополнительная его очистка может привести к положительному результату. Если же защитного действия лектина недостаточно для стабилизации коллоида, то мечение становится невозможным. Конъюгирование КЗ с различными энзимами по­зволяет выявлять локализацию специфичных для данного фермента субстратов (см. гл. 9).
   Непрямой метод состоит во взаимодействии первого немече­ного лиганда с мишенью и в последующем выявлении его с по­мощью второго меченого лиганда, специфически связывающегося с первым.
   Достоинство такого подхода заключается в возможности ис­пользования одного или нескольких меченых реагентов, что зна­чительно снижает объем подготовительных работ. Особенно широ­ко непрямой метод используется в иммуногистохимии, так как антисыворотки обычно имеют высокий титр и авидность. Кроме того, существенно повышается чувствительность реакции, так как с каждой молекулой первого антитела могут связываться две мече­ные молекулы антииммуноглобулинов [54].
  

21.6.1. Конъюгирование макромолекул с КЗ

   При конъюгировании лиганда с КЗ используют фирменные препараты либо белки диализируют против трижды дистиллиро­ванной деионизированной воды или низкомолекулярного Трис-НСl буфера. Хорошие результаты дает гель-фильтрация на сефадексе Г-25. Если происходит коагуляция золя при добавлении бел­ка или белок не соединяется с КЗ, то рекомендуется определить оптимальные условия адсорбции белка. Для адсорбции имеет зна­чение дзета-потенциал частиц, растворимость белка, рН и поверхностное натяжение на границе частиц золота и воды. Изменение рН может менять заряд белковой молекулы. Тогда как заряд частицы золота от рН не зависит. Следовательно, результирующая рН отражает изменения физических характеристик белка, что является ключевым моментом неудовлетворительной адсорбции. Максимальное связывание и наибольшая стабильность комплекса достигаются при рН, несколько превышающей изоэлектрическую точку белка. Если рН золя не подобрано тщательно, то наблюдается его флоккуляция. Это проявляется в изменении цвета раствора до пурпурно-синего и появление при центрифугировании черного налета Г на стенках пробирки без образования красного осадка [62].
   Итак, перед добавлением белка раствор КЗ доводят до нужного значения рН (рН свежеприготовленного раствора 5.5). Берут пробную порцию раствора (2-5 мл) и измеряют рН. Чтобы золото не оседало на стеклянном электроде, его стабилизируют 10%-ным раствором поливиншширролидона или 1%-ным раствором ПЭГ. Подщелачивают раствор до нужных значений с помощью 0.2 М раствора К2СО3. Затем белок в виде тщательно обессоленного вод­ного раствора добавляют к коллоиду. Белок должен стабилизиро­вать золь, сделав его соответственно устойчивым к воздействию электродов. Поэтому эффективность адсорбции белка определяет­ся добавлением к 0.5 мл полученного раствора 0.1 мл 10%-ного раствора NaCl. При этом цвет не должен меняться на фиолетовый. На последнем этапе адсорбции белка к КЗ можно для предотвра­щения агрегации добавить ПЭГ. Успешное связывание белков с КЗ возможно не только в воде, но и в различных буферах, напри­мер ФБ или Трис-HCl. Меченный золотом белок можно хранить при t=4®С с добавлением азида натрия в качестве консерванта-антисептика [62] (см. Приложение, 21.2 и 21.3).
   Для очистки и концентрирования комплекса белка с КЗ рас­твор центрифугируют со скоростью 300 об./с в течении 1 ч. Бес­цветный супернатант отсасывают, а осадок суспензируют в ФБФР в объеме, составляющем 1/10 объема исходного раствора. Непос­редственно перед употреблением раствор центрифугируют при ча­стоте вращения 33 об./с в течение 10-15 мин для удаления круп­ных агрегатов частиц КЗ и используют прозрачный супернатант. Рекомендуется освобождаться от крупных агрегатов дважды: до и после ультрацентрифугирования. С этой целью используют также фильтрование через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0.2-0.22 мкм, предварительно обработанный ПЭГ и сывороточным альбумином для снижения адсорбции белка. При этом на мембра­не должно остаться незначительное количество материала. Окрашивание фильтра в красный цвет свидетельствует об агрега­ции частиц.
   Данный способ особенно полезен в случае применения очень маленьких частиц КЗ или очень крупных белковых молекул. Кро­ме того, возможно получение нескольких хроматографических фракций и выбор лучшей из них с помощью бумажной цитохи­мической модельной системы [62].
   Раствор желательно использовать в течение нескольких суток. Его можно хранить некоторое время в пластиковых или парафи­нированных стеклянных пробирках при t=4®С. Для длительного хранения лиофилизированного комплекса к нему добавляют 1/9 часть водного раствора, содержащего 100 мг/мл ПЭГ-20000 и 5 % Твин-20. Раствор трижды по 1 ч диализируют против 1000-крат­ного объема 5%-ного раствора NH4HCO3. Затем 5 мл диализированного раствора замораживают в смеси сухого льда с этанолом, лиофилизируют в течение ночи и хранят при t=4®С в пластико­вых пробирках с силикагелем. Перед употреблением к лиофилизированным образцам добавляют исходный буфер. Для удаления аг­регатов применяют центрифугирование при 5000-8000 об./с в течение 10 мин. Замораживание-высушивание и длительное (до 6 мес) хранение не инактивируют белок в комплексе с КЗ.
   Непосредственно перед употреблением биологическая актив­ность белка может быть проверена в реакции агглютинации, при радиоиммунном анализе или с помощью простой "бумажной" ци­тохимической модельной системы. В последнем случае на лист фильтровальной бумаги наносят несколько капель раствора анти­гена. После высушивания лист фиксируют в формальдегиде. Затем проводят цитохимическую реакцию с последующим сереб­рением. Результат оценивают макроскопически. Отметим, что иммуноглобулины не всех видов животных прочно связываются с КЗ.
   Для обнаружения пектинов, которые не могут стабилизировать золь КЗ, разработаны реакции связывания с глюкопротеидами, меченными КЗ.
  

21.6.2. Особенности ЭМ-выявления КЗ

  
   Частицы КЗ диаметром от 5 до 50 нм могут быть визуализи­рованы с помощью СЭМ во вторичных электронах. Частицы диа­метром 13 нм легко идентифицируются в современных в СЭМ. С помощью СТЭМ удается визуализировать частицы золота диаметром вплоть до 0.8 нм.
   При анализе меченных КЗ объектов в СЭМ следует учитывать следующее: 1) число частиц КЗ, выявляемых с помощью обратно-рассеянных электронов, значительно больше, чем при использова­нии вторичных электронов (соответственно количественная оцен­ка должна базироваться только на обратнорассеянных электронах); 2) смешанное изображение в обратно- и вторичнорассеянных электронах позволяет наряду с анализом строения поверхности клеток оценивать количество мест связывания КЗ; 3) рельеф кле­ток сохраняется удовлетворительно при условия префиксации в 0.1%-ном ГА в течение 10 мин; 4) префиксация в ГА почти пол­ностью блокирует перераспределение и(или) интернализацию ме­ченных золотом комплексов антиген-антитело.
   Для подготовки к СЭМ при использовании КЗ вместо обычно­го осмирования предпочтительнее применять метод с многократ­ными чередующимися обработками в 40 и в тиокарбогидразине (ОТОТО-метод), поскольку в этом случае после СЭМ-анализа препараты можно исследовать в ТЭМ.
   При работе с КЗ количественный анализ сводится в основном к оценке частиц в разных участках объекта. Для этой цели удобно пользоваться отношением числа частиц золота к площади поверх­ности. Это отношение определяет плотность метки [62].
  

21.7. АРТЕФАКТЫ

  
   Слабое окрашивание (когда часть рецепторов не связывается с меченым лигандом) возможно в случае конкуренции немеченого белка с меченым, недоступности рецептора, а также при снижении биологической активности комплекса лиганда с КЗ.
   В процессе связывания КЗ с белком не исключено образование многослойной белковой "скорлупы" вокруг золотого ядра. При окрашивании тканей наружный слой белка может десорбироваться и переходить в раствор. За счет связывания возникает конкурен­ция меченых и немеченых белковых молекул. Рекомендуется до­бавлять в раствор КЗ строго определенное количество белка, необ­ходимое и достаточное для его стабилизации. При концентрирова­нии и очистке комплекса необходимо полностью удалять супернатант, так как в нем содержится немеченый лиганд. После ультрацентрифугирования в осадке остается часть немеченых молекул. Десорбция белка может обусловливаться, кроме того, из­менением рН. Действительно, адсорбция белка на частицах КЗ обычно происходит при значениях рН, близких к его изоэлектрической точке, но взаимодействие этого комплекса с клеточными структурами зачастую происходит при иной кислотности среды, осо­бенно когда изучаются живые клетки. Следовательно, связь амфотерных молекул с золотом в таких условиях может ослабнуть.
   Другой причиной недостаточно интенсивного окрашивания является недоступность рецептора. Процесс диффузии меченого лиганда при окрашивании после заливки (особенно в эпоксидные смолы) также практически не поддается контролю, поэтому метят­ся главным образом рецепторы, находящиеся на поверхности среза. Кроме того, следует учитывать повреждающее действие веществ, используемых для удаления смолы. И, наконец, малая интенсив­ность окраски может обусловливаться снижением активности ком­плекса белка (в частности, фермента) с КЗ при хранении.
   Другую группу артефактов составляют случаи неспецифиче­ского окрашивания, причины которого кроются в особенностях адгезии белка к гранулам КЗ, технике подготовки препарата и т.д. Основное допущение, на котором основывается использование КЗ в качестве Мр, состоит в том, что белок необратимо адсорбируется на поверхности частицы КЗ и полностью покрывает ее. Если эти условия не выполняются, то возможно неспецифическое взаимо­действие "обнаженных" участков с белками клеток и тканей. Час­тицы КЗ иногда не полностью покрываются белком. Для покры­тия белком этих участков поверхности добавляют ПЭГ. Однако этот способ не всегда эффективен.
   Неспецифическая адсорбция частиц КЗ может возникать при высыхании срезов во время процедуры окрашивания, что указыва­ет на необходимость постоянного контроля за наличием слоя жид­кости над поверхностью среза. Для исключения неспецифического окрашивания необходимо промывать объекты особенно тщательно и не допускать их подсыхания между процедурами инкубации [116]. При окрашивании после заливки результат в значительной степени зависит также и от качества среза. Частицы золя неспеци­фически накапливаются в складках среза и отсутствуют на сосед­них участках.
   Кроме того, обнаружено неспецифическое связывание Мр с по­гибшими клетками и продуктами их распада.
  
   Белки, меченные КЗ, могут неспецифически связываться со структурами, содержащими остатки аминокислот с высоким элек­трическим зарядом. Для снижения неспецифического окрашива­ния частицами КЗ щелочных остатков аминокислот рекомендует­ся добавлять 1-2 мг низкомолекулярного поли-Ь-лизина к каждо­му миллилитру разведенной пробы.
   Если КЗ приготовлено с помощью ТК, то неспецифическое связывание с ЦС на УС может быть обусловлено остатками ТК на частицах КЗ. Проблема решается путем разведения раствора Мр буфером, содержащим желатину (2-4 %) или смесь БСА (1 %) с Тритоном Х-100 (0.05 %), либо Твином-20 (0.5 %).
   Наконец, последняя группа артефактов включает агрегацию частиц КЗ и загрязнение срезов. Если агрегация возникает в про­цессе приготовления комплекса, то вместо ультрацентрифугирова­ния можно использовать хроматографическую очистку продукта. Если же причиной артефактов является высыхание срезов во вре­мя окрашивания, то нужно просто избегать этой ошибки. Агрега­ты могут образоваться также при хранении комплекса. Поэтому перед его употреблением рекомендуют проводить центрифугиро­вание.
   Загрязнение образцов продуктами окисления металлов возника­ет, если окрашивание срезов производят на медных сеточках. Для предупреждения этого артефакта используют никелевые или золотые сеточки. Необходимо проводить ряд контрольных реакций, обеспе­чивающих достоверность получаемых результатов [121].
  

21.8. НЕТРАДИЦИОННЫЕ СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЗ

  
   КЗ позволяет выявлять несколько рецепторов одновременно. Для достижения этой цели существует несколько подходов. Раз­личные лиганды можно метить частицами золота разного разме­ра. Если Мр значительно различаются по размеру, то рекоменду­ется сначала инкубировать препарат с более крупным Мр, иначе мелкие частицы создадут стерические препятствия для крупных. Иногда удается покрасить обе стороны одной и той же сеточки для ЭМ различными конъюгатами антител, отличающимися по диа­метру гранул золота.
   Так, можно приготовить препараты КЗ с диаметром частиц от 5 до 30 нм и проводить окрашивание одновременно по несколь­ким антигенам с последующим анализом в ЭМ. Для этого проще прямо пометить первые антитела частицами КЗ разного диаметра. При нанесении такой смеси меченых антител на УС удается про­демонстрировать присутствие разных антигенов, поскольку каждый из них будет связываться с частицами определенного диаметра.
   Применяют двойное мечение с использованием КЗ и ферри­тина. Этот метод полезен для исследования топографии и динами­ки рецепторов, но не поддается количественному анализу. При мечении используются сочетания КЗ с ПХ, КЗ с последующим серебряным усилением и ПХ, а также КЗ с рутинными гистохимиче­скими методами, например с обработкой при помощи ТК, что по­зволяет исследовать распределение антигена в клетках определен­ного типа.
   КЗ может использоваться в качестве трейсера, а также для анали­за электростатических свойств клеточной поверхности. Комплекс аг­глютинина завязи пшеницы с ПХ и КЗ с успехом был применен для изучения ретроградного нейронального транспорта. Радиоактивное КЗ различной дисперсности используют также в физиологических исследованиях при анализе проницаемости гистогематических барь­еров. Частицы КЗ диаметром 5-15 нм после инкубации в растворе полилизина при рН 7.0 покрываются слоем молекул полилизина, приобретая катионные свойства. В этом случае они связываются с анионными сайтами клеточной поверхности [62, 93].
  

21.9. СЕРЕБРЯНОЕ УСИЛЕНИЕ

  
   Величину частиц КЗ можно увеличить с помощью метода сереб­ряного усиления, который часто называют аутометаллографией. Се­ребрение основано на реакции, используемой в фотографии и назы­ваемой "физическое" проявление. Проявители, предназначенные для получения фотографического изображения за счет восстановления микрокристалов галогенида серебра, называются "химическими" (традиционный способ проявления). "Физический" проявитель со­держит помимо восстановителя ионы или комплексы металлов. Из таких растворов происходит осаждение металлов на центры скрытого изображения или на серебряное почернение. В качестве таких цент­ров выступают гранулы КЗ, которые катализируют восстановление ионов серебра до металлического серебра при использовании гидро­хинона как восстановителя. Оболочка металлического серебра вокруг частицы КЗ сама в свою очередь катализирует процесс восстановле­ния, и реакция становится аутокаталитической. Присутствие только двух атомов золота при контролируемых условиях может иницииро­вать "физическое" проявление (см. Приложение, 21.4).
   Следовательно, при добавлении проявителя к объекту, меченному КЗ, каждая золотая частица становится каталитическим центром и инкапсулируется в растущем слое металлического серебра, увеличи­ваясь в диаметре. Это дает возможность использовать очень малень­кие частицы КЗ, что позволяет добиться наиболее точной локализа­ции исследуемых молекул и большей чувствительности. Серебряное усиление рекомендуется для увеличения размеров не только мелких частиц КЗ, но и средних и даже крупных.
   Следует иметь в виду, что восстановление серебра может про­исходить не только на частицах КЗ, но и на угольных пигментах в легких и в лимфатических узлах. Наличие в образцах сульфида ртути и золотосодержащих лекарств также ведет к восстановлению ионов серебра. Серебряное усиление можно использовать при ра­боте со сверхмалыми частицами КЗ в случае преэмбеддинга.
  
   Имеется прямая зависимость между временем обработки и размерами отложений серебра вокруг золотой гранулы. Причем, для того чтобы этот процесс был контролируемым, он должен про­текать достаточно медленно. Для снижения скорости восстановле­ния серебра при физическом проявлении используют защитный коллоид. В отсутствие коллоида уже через 5 мин образуются кри­сталлы неправильной формы. При использовании ПЭГ или поли-винилпирролидона (ПВП) неконтролируемый рост кристаллов на­чинается через 10 мин проявления. Лучшим защитным коллои­дом оказался гуммиарабик. Под его воздействием диаметр частиц увеличивается медленно, но прогрессивно. Так, через 60 мин раз­мер частиц увеличивается в 15 раз при сохранении сферической формы. Гуммиарабик перед употреблением рекомендуется очи­щать с помощью ультрацентрифугирования.
   Серебряное усиление можно использовать не только при иммуномечении и обработке лектинами, но и в случае проведения реакции гибридизации in situ и двойного мечения, в том числе и при светооптических исследованиях. В СЭМ мечение КЗ с последующим серебряным усилением решает многие проблемы.
   Частицы КЗ подвергают серебряному усилению при изучении фагоцитоза (метод преэмбеддинга), что позволяет выявлять фаго­цитирующие клетки под СМ [118].
  

21.9.1. Процедура серебряного усиления

  
   После иммуномечения УС промывают в том буфере, кото­рый использовался для разведения антител, затем промывают в бидистиллированной воде или разведенном цитратном буфере, после чего вновь в бидистиллированной воде. Время проявления 10-45 мин. УС покрывают 0.05%-ным водным раствором желати­ны и высушивают. Желатина предупреждает выпадение аутоката-литических преципитатов из проявителя, уменьшает зерно. Всю процедуру желательно проводить при красном свете [318].
   После 5-минутного перемешивания проявителя сеточки, увлаж­ненные до этого водой, помещают на каплю проявителя. Рекоменду­ется использовать магнитную мешалку для вращения никелевых се­точек (оптимальное время проявления подбирают эмпирически). Для прекращения проявления сеточки надо интенсивно промыть в бидистиллированной воде. Реакцию надо вести при красном свете, комнатной температуре и постоянной влажности. После серебряного усиления реакция иммуномечения блокируется.
  

21.9.2. Используемые реактивы

  
   Для проявления имеют значение и другие факторы, например то, какая соль серебра содержится в растворе. В качестве источни­ков ионов серебра используют нитрат, ацетат или лактат серебра. В
  
   последнем варианте процесс серебряного усиления контролируется лучше. В случае нитрата реакцией довольно трудно управлять вслед­ствие высокой степени диссоциации соли и быстрого течения прояв­ления. Оптимальным считается применение лактата серебра.
   В большинстве работ в качестве восстановителя используется гидрохинон. Некоторые авторы рекомендуют заменять его бром-гидрохиноном, дающим большую контрастность и снижающим неспецифическую адсорбцию серебра. Метод позволяет проводить гистохимическую реакцию с частицами КЗ небольшого диаметра (например, 5 нм), что исключает стерические препятствия при взаимодействии рецептора с меченым лигандом. Это открывает перспективы для внедрения метода КЗ-серебрение как в СМ, так и в СЭМ.
   Итак, основными компонентами "физического" проявления являются лактат серебра (источник ионов серебра), гидрохинон или бромгидрохинон (выполняет функцию восстановителя, т.е. способствует образованию атомарного серебра из ионного) и гуммиарабик (замедляет процесс до необходимого уровня и стабили­зирует его). Для обработки ПС и УС используют проявитель. Гум­миарабик представляет собой сложный сополимер D-галактозы, L-маннозы, L-арабинозы и остатков D-глюкуроновой кислоты. Количество гуммиарабика, добавляемого в проявитель, является критическим фактором для контролирования скорости процесса усиления. Можно использовать 30%-ный раствор, но это снижает чувствительность процесса усиления. Поэтому чаще всего применяют 15%-ный раствор. Меньшая концентрация делает процесс усиления неконтролируемым. Вместо гуммиарабика можно использовать БСА, декстран, ПЭГ, ПВП, вольфрамовую кислоту, желатину и др. ПЭГ и ПВП имеют преимущества: известно их химическое строение, они быстро растворяются и могут готовить­ся ex tempore.
   Чувствительность метода с КЗ значительно увеличивается при восстановлении частицами золота лактата серебра с образованием интенсивно черного продукта. Иногда лучше применять реактивы, разведенные 1 : 1.
   Можно использовать другие проявители (см. Приложение, 21.4), которые проявляют быстрее, однако это увеличивает риск возникновения фона. Время инкубации подбирают индивидуально для каждого опыта. Оно зависит от толщины среза, длительности и последовательности процедур, использованных при проводке, плотности золотой метки. Усиление лучше всего проводить на во­дяной бане при стабильной температуре. Повышение температуры увеличивает скорость реакции, но ведет к росту фона. Во время проявления меченные КЗ участки становятся желтыми, затем ко­ричневыми, наконец, черными. Очень черные препараты маскиру­ют подлежащие структуры. Для контролирования скорости реак­ции препараты промывают бидистиллированной водой или раз­бавленным цитратным буфером, просматривают под слабым светом в темной комнате и вновь возвращают в проявитель.
  
   В качестве донора ионов серебра можно использовать фото­эмульсию (см. Приложение, 21.5.1). Для этого срезы покрывают фотоэмульсией, содержащей кристаллы бромистого серебра, а за­тем обрабатывают проявителем. При этом ионы серебра, освобож­даемые из фотоэмульсии, проникают к частице золота вместе с молекулами восстановителя и образуют слой металлического се­ребра. Увеличение гранул в 35 раза достигается после 15-минут­ного проявления.
   Слой эмульсии можно впоследствии удалить с препаратов с помощью раствора протеолитического фермента. При использова­нии в СЭМ этот метод, по нашему мнению, хуже, чем "физиче­ское" усиление, так как требует высушивания образца до и после нанесения эмульсии и более длительной инкубации.
  

21.9.3. Возможные опасности

   Раствор серебряного усилителя рекомендуется держать в тем­ноте. Любое изменение цвета раствора свидетельствует о неспеци­фической преципитации серебра. Очень важно во время реакции не допускать попадания света на УС. При потемнении раствора на препаратах резко возрастает фон. Если во время усиления прояви­тель становится серым, то его лучше заменить свежим. Это позво­ляет уменьшить фон. Для удаления фона можно применять фото­графические ослабители типа раствора Фармера. Реакцию прояв­ления останавливают погружением препарата в 20-25%-ный раствор тиосульфата натрия на 1-3 мин. Можно предварительно использовать стоп-ванну с 1%-ной уксусной кислотой в течении 1 с. Каждый этап требует промывания в бидистиллированной воде.
  

21.9.4. Преимущества и недостатки

   Метод серебряного усиления КЗ имеет ряд недостатков: 1) воз­можно аутокаталитическое серебрение, не блокирующееся коллои­дом; 2) в гуммиарабике могут быть ионы хлора, осаждающие ионы серебра; 3) кислая среда проявителя приводит к отщеплению антител с низкой авидностью. Наряду с этим метод имеет сущест­венные преимущества: 1) он в 2-5 раз более чувствителен, чем не­прямой метод с ПХ, и в 4-8 раз чувствительнее метода с ПАП; 2) его можно использовать в случае применения преэмбеддинга, например на вибратомных срезах. Однако осмирование после се­ребрения, но до заливки в эпон существенно снижает величину гранул из-за окисления 40. Для предупреждения данного недо­статка серебряные зерна покрывают золотом. Метод серебряного усиления позволяет при двойном мечении пользоваться одним и тем же Мр второго слоя. После реакции на ПХ срезы можно уси­лить серебром [339] (см. Приложение, 21.5).
   Глава 22 АНАЛИТИЧЕСКАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
  
   Когда пучок электронов, обладающий высокой энергией, взаи­модействует с образцом, атомы образца могут вызвать замедление электронов. Если это происходит, то кинетическая энергия элект­рона превращается в другие формы энергии. Электроны с умень­шенной кинетической энергией двигаются по другой траектории.
   Природа и спектр выделяемой энергии, так же как и изображе­ния, образуемые замедленными электронами, могут регистриро­ваться специальными детекторами, которыми снабжен ЭМ. Такие детекторы способны определять атомный состав объекта и количе­ство элементов, присутствующих в нем. Если ЭМ используется для идентификации химической природы компонентов объекта, то он называется аналитическим ЭМ [234, 352].
   Такие приборы позволяют определять локализацию ионов и электролитов в различных частях клеток, изучать изменения в распределении ионов во время различных физиологических про­цессов, проводить идентификацию неизвестных кристаллических включений в клетке и продуктов ферментативных реакций, иссле­довать пути проникновения токсических ионов в клетку, выявлять их, а также пути их выведения. Аналитическая ЭМ представляет собой важный инструмент в изучении распределения ионов и ре­гуляции процессов, происходящих в биологических системах [209].
   В рентгеновском микроанализаторе объект сканируется тон­ким пучком электронов (электронный зонд). Взаимодействие та­кого зонда с объектом вызывает рентгеновское излучение, позво­ляющее идентифицировать химические элементы [57, 334, 368].
  

22.1. МЕХАНИЗМЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ СИГНАЛОВ

  
   При облучении объекта электронами формируется несколько энергетически различных излучений. При упругом соударении энергия электронов практически не теряется, но меняется направ­ление их движения. Эти электроны названы упругорассеянными, или трансмиссионными, и используются в обычных ТЭМ для получения морфологической информации об объектах.
   Упругорассеянные электроны могут либо проходить сквозь объект, либо отклоняться (отбрасываться) назад в направлении пучка. Это обратнорассеянные электроны. Они регистрируются с помощью специальных детекторов как в ТЭМ, так и в СЭМ. Такие детекторы используют для картирования областей, содержащих элементы с различным атомным номером. Элементы с высоким номером дают большее число обратнорассеянных электронов и ка­жутся более яркими, чем те, которые содержат элементы с более низким атомным номером.
   Вторичные электроны, энергия которых обычно ниже 50 эВ, представляют собой один из типов неупругорассеянных электро­нов. Именно эти электроны используют для анализа клеточной поверхности в СЭМ.
   Наиболее практически важные для биологов типы рентгено­вского излучения генерируются, когда электроны с высокой энер­гией взаимодействуют в электронами, располагающимися на раз­личных энергетических орбитах атома объекта. Поскольку при этом электроны переходят на более низкий энергетический уро­вень, определенное количество энергии освобождается в виде рен­тгеновского излучения. Падающие электроны взаимодействуют с электронными оболочками атомов объекта (К-уровня) и выбива­ют электроны с соответствующей орбиты. В результате этого про­цесса создаются вакансии, для заполнения которых используются электроны с более высоких энергетических уровней (L- или М-уровни). Так как энергия у этих электронов выше, чем у выбитого электрона, то ее избыток выделяется в виде квантов рентгеновско­го излучения. Различие между двумя энергетическими уровнями является энергией, которая характеризует элемент. Поскольку каждый элемент генерирует уникальную серию пиков энергии, то спектр их может быть использован для идентификации элементов. Такое дискретное рентгеновское излучение названо характеристи­ческим.
   При взаимодействии заряженной частицы (в данном случае падающего электрона) с ядром атома происходит торможение электрона и выделение рентгеновского излучения с непрерывным (белым) спектром, т.е. со всеми возможными значениями энергии [80, 105, 334].

22.2. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЕТЕКТОРЫ

  
   Для микроанализа применяют различные типы детекторов. Энергетические полупроводниковые детекторы рентгеновского из­лучения наиболее часто используются в биологических исследова­ниях. Они состоят из полупроводника, сделанного из кристалла кремния, в который введено некоторое количество атомов лития. Когда рентгеновское излучение падает на полупроводниковый кристалл, поглощенная энергия изменяет его электропроводность. Поскольку энергия рентгеновского излучения прямо пропорциональна увеличению проводимости кремниевого кристалла, то та­ким образом можно определять интенсивность рентгеновского из­лучения. Кристалл детектора охлаждается в жидком азоте для пол­учения максимального разрешения и уменьшения шума и содер­жится в условиях сверхвысокого вакуума.
   Преимущества энергетических детекторов следующие: 1) про­стая конструкция и относительно небольшие размеры; 2) высокая чувствительность и почти 100%-ная эффективность; 3) способ­ность одновременно анализировать полный элементный спектр; 4) возможность использовать узкий электронный зонд с малыми токами пучка. Однако эти детекторы имеют и недостатки: 1) точ­ность метода при низких концентрациях элементов значительно снижается; 2) разрешение ограничено 100-120 эВ, соответственно близко расположенные энергетические пики рентгеновского излу­чения плохо различаются; 3) чувствительность для легких элемен­тов падает; 4) необходимо работать при температуре жидкого азота.
   В кристаллическом, или волновом, детекторе тормозное рент­геновское излучение отражается атомными плоскостями кристал­ла согласно уравнению Брагга. Используемые кристаллы имеют вогнутую форму для фокусировки рентгеновского излучения. Поскольку кристалл отражает относительно узкую часть спектра рен­тгеновского излучения, он может использоваться только для очень небольшого числа элементов с близкими атомными номерами. Например, гипсовый кристалл отражает волны длиной от 0.26 до 1.5 нм, что соответствует атомным номерам от 11 до 14. Кристалл хлорида натрия отражает волны длиной от 0.09 до 0.53 нм и по­зволяет детектировать элементы с атомными номерами от 16 до 37. Поэтому для анализа широкого спектра элементов необходимо использовать несколько типов кристаллов.
   Отраженные и сфокусированные рентгеновские лучи попадают в камеру, заполненную инертным газом (обычно смесь аргона с метаном), вызывая ионизацию аргоно-метановой смеси и одно­временно ионный ток. Этот электрический ток измеряется и коли­чественно оценивается во времени. Поскольку величина тока пря­мо связана с энергией падающих рентгеновских лучей, то можно определить энергию рентгеновского излучения.
   Волновой кристаллический детектор реже используется в био­логических исследованиях, так как представляет собой сложную механическую конструкцию с рядом регулировок; он осуществляет анализ в данный момент только одного элемента, менее эффекти­вен, чем детектор энергетического рассеяния, и требует более ин­тенсивного облучения объекта, что может приводить к его повреж­дению.
   Однако волновой кристаллический детектор более четко разли­чает близко расположенные энергетические пики рентгеновского излучения, лучше приспособлен для анализа следовых количеств элементов и не требует жидкого азота для своего охлаждения.
   Данные, получаемые при использовании обоих типов детекто­ров, могут быть представлены тремя способами.
      -- Точечный анализ. Тонкий электронный зонд направляется на изучаемый участок, где генерируется рентгеновский спектр. При представлении таких данных нужна фотография образца с обозначением исследуемого участка.
      -- Линейный сканирующий анализ. Электронный зонд по пря­мой линии дискретно сканирует образец, задерживаясь в каждой точке на определенное время. Кривая количественного распределе­ния накладывается на фотографию объекта.
      -- Точечное картирование. При этом пучок дискретно сканиру­ет большую площадь по точкам. Обычно картирование этим спо­собом занимает много времени (часы).
   Как правило, при анализе вторым и третьим способами произ­водится компьютерная обработка данных [244].

22.3. РЕНТГЕНОВСКИЙ МИКРОАНАЛИЗ (РМА)

  
   Для изучения локализации и концентрации элементов в клет­ках и тканях широко используется метод РМА, который имеет ряд преимуществ по сравнению с другими видами количественного анализа. Наиболее важными из них являются следующие: 1) анализ с помощью рентгеновского излучения является достаточно щадящим; 2) анализируемое вещество может находится в различ­ных агрегатных состояниях; 3) определение содержания всех при­сутствующих в объекте химических элементов можно осуществ­лять одновременно с помощью РМА, если использовать энергети­ческий детектор; 4) можно производить анализ в широком диапазоне концентраций (практически от 10-4 до 100%-ной); 5) содержание элементов можно определять в очень малом объеме (порядка нескольких пиколитров) [80].
   Особый интерес для биологов и медиков представляет возмож­ность получения количественных характеристик некоторых физи­ологически активных элементов, таких как натрий, магний, фос­фор, калий и кальций, которые играют значительную роль в протекании процессов как в норме, так и при патологии. С помощью РМА можно не только идентифицировать элементы, но и опреде­лить их количественное содержание в ядре и органеллах, в частно­сти в митохондриях, эндоплазматической сети, а также в лизосомах и цитозоле.
   Большинство биологических объектов состоит из элементов с низкими атомными номерами. По этой причине падающие элек­троны проникают глубоко в образец, где они теряют свою энергию и располагаются в пространстве, имеющем форму капли. С рос­том ускоряющего напряжения происходит увеличение глубины и диаметра этой капли [80].
   В настоящее время рентгеновскими спектрометрами оснащают как СЭМ, так и ТЭМ, создаются также специальные аналитические комплексы (ЕММА-4 и ТЕМСКАН), объединяющие большие ана­литические возможности рентгеновских спектрометров и высокое разрешение ЭМ. С помощью этих приборов можно производить анализ как объемных образцов, так и срезов тканей.
   Трансмиссионный РМА может быть проведен и в СЭМ, кото­рый снабжен детектором трансмиссионных электронов или же специальным устройством, позволяющим использовать один и тот же детектор вторичных электронов и для сканирующего, и для трансмиссионного режима работы. Хотя разрешение в СЭМ ниже, чем в ТЭМ, тем не менее исследования в трансмиссионном режи­ме сканирующего микроскопа обладает некоторыми преимущест­вами: 1) в нем можно исследовать более толстые объекты (срезы до 5 мкм), что удобно для обнаружения элементов, присутствую­щих в тканях в небольших количествах; 2) в большой камере СЭМ легче разместить устройства для анализа образцов при температу­ре жидкого азота; 3) изображение в СЭМ гораздо контрастнее, а это обстоятельство может иметь большое значение, так как уменьшение или полный отказ от использования химических веществ для контрастирования важен для корректного проведения микро­анализа [80, 365].
  

22.3.1. Возможности метода

  
   Наиболее простая задача, решаемая с помощью РМА, - это качественное определение элементного состава в объекте. Гораздо сложнее выполнить количественное исследование, т. е. определить количество различных элементов в различных участках объекта. Решению такой задачи препятствуют весьма существенные и труд­нопреодолимые сложности, связанные с препарированием и аппа­ратурным обеспечением, что приводит к тому, что довольно мало исследований выполнено с использованием количественного мик­роанализа.
   Среди многочисленных направлений применения метода мож­но выделить четыре основные группы: 1) определение неорганиче­ских веществ в тканях и клетках; 2) идентификация продуктов ги­стохимических реакций; 3) локальное определение содержания легкодиффундирующих ионов (натрия, хлора, калия) и других физиологически важных элементов (кальция, фосфора и др.); 4) оценка изменений содержания неорганических элементов в ма­лых объемах [314, 340, 365].
   К первой группе обычно относят не только изучение минераль­ных отложений в виде водонерастворимых солей, но и определе­ние внутриклеточной или внутритканевой локализации некоторых металлов. Избыточное накопление последних происходит при не­которых заболеваниях, и их исследование может иметь диагности­ческое значение. Для быстрой идентификации неорганических от­ложений в хирургических биопсиях пригодны как депарафинированные 5-10-микронные срезы (в том числе окрашенные гематоксилином и эозином), так и криостатные срезы, высушен­ные под вакуумом или на воздухе. РМА применяется для анализа состава калькулезных отложений в мочевыводящих путях, мине­ральных отложений в легочной ткани, в судебно-медицинской ди­агностике для определения ядов в тканях. В фармакологии РМА позволяет уточнять локализацию лекарств, например арилсульфонамидов, содержащих фтор, диуретиков, содержащих ртуть; и т.д. Можно внутривенно вводить частицы золота и с помощью РМА регистрировать их в макрофагах легких. Важным направлением применения РМА является его использование для определения концентрации неорганических элементов в различных биологиче­ских жидкостях. РМА с успехом применяется для идентификации продуктов гистохимических реакций. С помощью РМА можно детектировать фармакодинамику лекарств, содержащих мышьяк [351].
  

22.3.2. Подготовка объектов для РМА

  
   Самая большая проблема, возникающая у биологов, применя­ющих РМА, связана с приготовлением объекта. Для твердых био­логических объектов, таких как кость, не требуется особой подго­товки, кроме зачистки и полировки. Мягкие же ткани содержат большое количество внутриклеточной и интерстициальной воды, в которой растворены многочисленные аминокислоты, белки и электролиты. Из таких тканей воду необходимо удалить, либо объ­екты надо заморозить.
   При подготовке объектов приходится решать две взаимоиск­лючающие задачи - сохранить как интересующие нас элементы в местах их прижизненной локализации, так и ультраструктуру объ­екта. Использование нефиксированной ткани часто не дает воз­можности зарегистрировать, в каком участке клетки находится данный элемент. Наиболее подходящим методом для целей ана­литической ЭМ является сверхбыстрое замораживание, при кото­ром сохраняется структурный и элементный состав клеток [365].
   В настоящее время существуют два основных направления в препарировании объектов для РМА: 1) клетки осаждают на под­ложку или выращивают на ней; затем объекты быстро заморажи­вают и высушивают из замороженного состояния или изучают за­мороженные объекты на охлаждаемом до t=-173®С столике ЭМ; 2) проводят криоультратомию замороженных объектов; последую­щее исследование крио-УС в замороженном состоянии является наиболее адекватным подходом для РМА.
   Можно также исследовать объемные объекты - толстые срезы и кусочки расколотых образцов. Такие объекты монтируют на алюминиевые или угольные столики и покрывают проводящим покрытием. Использование РМА для замороженных гидратированных объемных биологических образцов обусловлено тем, что их легче готовить и они более стабильны [245].
   Особое внимание во время удаления воды следует уделять при­чинам, способным вызвать потерю или перераспределение эле­ментов. Единственным методом, который обеспечивает возмож­ность сохранения распределения ионов, характерного для состоя­ния in vivo, является криоультратомия. Крио-УС готовят с помощью сухого ножа. Их обычно помещают на никелевые сеточки, покрытые подложкой, а после сублимации напыляют углеродом.
   Для наблюдения замороженных объектов и исследования их с помощью РМА необходимо использовать специальную охлаждаю­щую камеру в микроскопе, способную поддерживать определен­ную температуру (обычно температуру жидкого азота) для предот­вращения сублимации льда из объекта [365].
   Преимуществом данной методики является доступность пре­паративной техники, основанной на получении гладких, плоских срезов толщиной 500 нм. Срезы изготавливают с помощью ох­лажденных бритв. Угол наклона ножа составляет 6®. Для анализа используют бериллиевые сеточки, это обусловлено тем, что берил­лий достаточно теплопроводен и дает низкий рентгеновский фон. В ряде случаев используют алюминиевые сеточки, однако рентге­новский характеристический сигнал алюминия накладывается на таковой натрия (при энергодисперсионном анализе).
   Другим способом препарирования являются лиофилизация и низкотемпературная заливка. Высушенные крио-УС очень гигро­скопичны. Для увеличения прочности и создания электропроводя­щего покрытия рекомендуется их напылить тонким слоем угля. Работать с ними желательно в атмосфере сухого азота, а хранить лучше в вакууме [365].
   Высушенные крио-УС имеют ряд преимуществ над гидратированными: 1) с ними проще манипулировать; 2) обеспечивается более высокое разрешение; 3) они более стабильны и могут хра­ниться длительное время. Однако такие крио-УС имеют и недостатки: 1) результаты могут быть выражены только в пересчете на сухую массу; 2) невозможно прямо определить содержание воды; 3) нельзя анализировать области, близкие к поверхности клеток.
   Поскольку при РМА гидратированные крио-УС очень неста­бильны под электронным лучом, исследуют гидратированные крио-ПС. Для их закрепления часто применяют раствор Рингера с добавлением декстрана (до 20 %). Другой способ прикрепления крио-ПС к держателю - придавливание ПС с помощью охлажден­ного медного полированного стержня.
   Получаемое на гидратированных срезах изображение имеет очень слабую контрастность, в связи с этим иногда осуществляют частичную сублимацию срезов в ЭМ [80, 365].
   РМА позволяет проводить элементное картирование поверхно­сти гидратированных крио-УС. Взвешивание одного и того же сре­за до и после высушивания дает возможность определить в нем количество воды и получить абсолютные значения содержания элементов.
  
   В редких случаях даже при изучении ионов применяют высу­шивание на воздухе. Это в первую очередь относится к изолиро­ванным клеткам: делают мазок взвеси клеток в подходящем буфе­ре на подложке ЭМ-сеточек, которые затем быстро высушивают на воздухе.
   Указанных проблем не возникает при использовании РМА для изучения неорганических включений в самые различные ткани. В ряде случаев для анализа элементного состава применяют вещест­ва, вызывающие преципитацию интересующих элементов. Так, для осаждения кальция применяют оксалат аммония или пироантимонат калия. Для определения содержания легкодиффундирующих ионов калия, натрия, хлора и кальция используют методику криофиксации, которая предотвращает перераспределение этих элементов. Показано, что любая другая процедура приводит или к их перераспределению, или к потере. После этого приготовление препаратов для микроанализа может быть различным [80, 105, 365].
   Удаление воды из замороженных объектов можно производить не только с помощью сублимации, но и в процессе замещения в замороженном состоянии. Однако при этом может происходить транслокация элементов.
   РМА применим также для анализа УС после заключения в аралдит. Однако лучше использовать акриловые смолы, поскольку содержащиеся в эпоксидных пластмассах сера и хлор могут уси­ливать фон и маскировать имеющиеся в образце элементы [80, 202].
  

22.3.3. Количественная оценка результатов

  
   РМА в отличие от ряда гистохимических методов не позволяет различать свободные и связанные элементы, а определяет их об­щее содержание. Предел количественной оценки элементов этим методом варьирует от 0.5 до 1 ммоль на 1 кг сухой массы. Поэто­му небольшие внутриклеточные перемещения свободных ионов в наномолярных концентрациях уловить трудно [80, 365].
   Разработаны приборы для создания карт концентраций раз­личных элементов на гидратированных (или высушенных из замороженного состояния) крио-УС в реальном времени и в срав­нении со стандартами. Это позволяет оценить содержание воды и концентрацию различных элементов в одной и той же клеточной области, определить концентрационные градиенты и гетероген­ность ответа клеток на действие одного и того же стимула [105, 230].
   Для количественного микроанализа желательно использовать эталоны, сходные с образцами по физико-химическим свойствам и составу [361].
   Существует несколько подходов для количественного микро­анализа. Выбор их зависит от толщины образца и методов его под­готовки. Для объектов толщиной до 10-15 мкм пригодна следую­щая формула:

Cx=Ix/Ixs,

   где Cx - концентрация элемента х в анализируемом микрообъеме образца (в действительности масс-фракция данного элемента); Ix - измеряемая интенсивность выбранной характеристической линии данного элемента; Ixs - интенсивность той же линии (того же ди­апазона энергий) эталона, содержащего элемент х в известной концентрации.
   Условия анализа должны быть идентичными. Однако данное уравнение неточно. Для уточнения его вводят факторы коррекции (ZAF-факторы). Тогда более точная с физической точки зрения формула соотношения масс-фракций элемента и интенсивности приобретает вид:

Cx=Ix/IxsZAF,

   где Z - фактор коррекции, учитывающий разницу среднего атом­ного номера элементов, составляющих объект и эталон; А - фак­тор коррекции, учитывающий внутреннюю адсорбцию образован­ных рентгеновских лучей объектом и эталоном; F - фактор, учи­тывающий флюоресценцию рентгеновских лучей, которые образовались не под действием электронного пучка [90, 105, 365].
   Другой подход был разработан специально для биологических объектов. Было выведено следующее уравнение:
  

Cx=KIx/Iw.

   Здесь Iw - интенсивность рентгеновского излучения вблизи от характеристической линии элемента x, где отсутствуют какие-либо пики других элементов; К - константа, определяемая по эталону.
   Близость энергий Ix и Iw делает ненужным использование А-фактора коррекции, а наличие соотношения Ix/Iw - Z-фактора коррекции. F-фактор коррекции (для флюоресценции) обычно не­значителен в случае биологических объектов [80, 105, 365].
   В настоящее время большинство аналитических методов коли­чественного анализа введены в миникомпьютеры, прилагаемые к приборам для РМА. Исследователь должен, однако, представлять себе, какие методы он использует и какие у них ограничения. В вышедшей на русском языке монографии ("Растровая электрон­ная микроскопия и рентгеновский микроанализ" [57]) все эти воп­росы тщательно разобраны.
   Для определения концентрации элементов необходимо с по­мощью соответствующих эталонов, содержащих известное количе­ство элементов в определенной пропорции, выявить соотношение между концентрацией данного элемента и интенсивностью рентге­новского излучения. При РМА биологических объектов использу­ют весьма разнообразные эталоны. Для удобства их можно разде­лить на несколько типов: неорганические, смеси неорганических веществ со смолами, смеси органических веществ с электролита­ми, макроциклические полиэфирные комплексы с неорганически­ми солями, ткани и их гомогенаты с добавлением солей или без него, растворы электролитов. Наиболее широко используют смеси органических растворов (альбумина, желатины, агар-агара, карбоксилметилцеллюлозы, декстрина и их комбинации) с неоргани­ческими или органическими солями [364]. Однако, несмотря на простоту работы с подобными стандартами и легкость их приго­товления, они недостаточно гомогенны.
   В качестве эталонов используют также органометаллические или органометаллоидные вещества, заключенные в эпон. Органи­ческие стандарты основаны на свойстве макроциклических поли­эфиров образовывать комплексы с натрием и калием. Однако оба эти метода применяют для приготовления стандартов лишь при исследовании тканей, залитых в смолу, ввиду того что одним из требований, предъявляемых к эталонам, является максимальная идентичность его матрикса по плотности с исследуемым объектом [364]. Для определения толщины среза используется фоновое рен­тгеновское излучение [303, 364].
  

22.3.4. Основные ошибки при количественной оценке

  
   Можно отметить следующие источники ошибок: 1) сложности в отделении характеристического пика от наслаивающихся пиков и от фона; 2) нарушения, вызываемые электронным пучком в эта­лоне и в объекте, приводят к изменениям как содержания элемен­тов, так и общей массы; 3) инструментальные факторы - измене­ния в калибровке рентгеновского излучения, определении ширины пиков и дрейфа объекта; 4) основные статистические ограничения обусловлены малой интенсивностью рентгеновского излучения, детектируемого как в пиках, так и в области континуума; это свя­зано в основном с практическим временем счета, используемым источником излучения, техникой анализа [80, 105, 365].
  

22.4. СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПОТЕРЬ ЭЛЕКТРОНОВ

   Этот метод используют для разделения электронов различных энергетических уровней после их прохождения через тонкий объ­ект. При этом в принципе можно определить элементный состав образца. Разделение электронов осуществляют с помощью элект­ромагнитного спектрометра, помещенного либо непосредственно за объектом, либо вслед за экраном ТЭМ или СТЭМ. Когда элект­роны попадают в электромагнитное поле спектрометра, они откло­няются в различной степени и фокусируются на некотором рас­стоянии от спектрометра. Электроны с низкой энергией отклоня­ются в большей степени, чем электроны, имеющие более высокую энергию. Тем самым точки фокусирования различных групп электронов физически разделяются. Подвижную пластинку с узким щелевидным отверстием помещают в таком положении, чтобы только электроны с определенным энергетическим уровнем про­никали в детектор; последний имеет сходную конструкцию с де­тектором вторичных электронов в СЭМ (сцинтилляционного ти­па) [105, 365].
   Типичный разброс энергетических потерь для электронов, ус­коряемых напряжением 100 кВ, занимает пределы от 100 до 1000 эВ. Современные спектрометры могут детектировать энерге­тические потери от 0 до 2000 эВ с разрешением лучше 5 эВ. Поскольку данный тип спектрометров регистрирует первичные со­бытия (потерю энергии проходящих электронов), а не вторичные (рентгеновское излучение), то он на 1-2 порядка (в 10-100 раз) бо­лее эффективен, чем РМА. Пространственное разрешение в спект­рометре энергетических потерь электронов (10 нм) сопоставимо с таковым, получаемым в РМА при изучении УС (10-50 нм). При этом возможно картирование распределения элементов по площа­ди среза.
   Количественная оценка получаемых данных проще, чем в слу­чае РМА, поскольку она не требует специальной математической коррекции результатов. Принципиальный недостаток данного ме­тода - это невозможность получения достаточно тонких (в несколько раз тоньше обычных) УС. Чем толще УС, тем выше уро­вень фона из-за многочисленности событий, обусловленных рас­сеиванием электронов.
   Система спектрометрии энергетических потерь позволяет, во-первых, увеличить контрастность изображения в светлом и тем­ном поле путем фильтрации упруго рассеянных электронов, осо­бенно при изучении толстых УС, во-вторых, составить карты рас­пределения легких и среднетяжелых элементов с высоким разрешением, в-третьих, определять следовые концентрации эле­ментов.
   Кроме изучения элементного состава объектов и подсчета их количества метод может быть использован для увеличения контр­астности и разрешения в случае более толстых объектов. Детектор обычно помещают между объектной и промежуточной линзами. ЭМ, снабженные подобной приставкой, позволяют анализировать толстые срезы, поскольку электроны с определенной длиной вол­ны могут быть удалены. Данный метод может быть использован и для получения изображения отдельных атомов тяжелых металлов, расположенных на субстрате, который изготовлен из элемента с малым атомным весом.
   Для изучения гидратированных крио-УС рекомендуется ис­пользовать спектроскопию энергетических потерь электронов в ре­жиме нулевых потерь. Данный метод не нашел еще широкого при­менения, из-за того что большинство биологических объектов слишком толстые и легко повреждаются пучком электронов при исследовании [105, 365, 375].
  
   ВМЕСТО ЗАКЛЮЧЕНИЯ
  
   Вот и прочитана (или пролистана) книга. Надеемся, что она Вам в будущем еще пригодится.
   Представленный в книге материал показывает, что в насто­ящее время электронная микроскопия обладает огромными возможностями в исследовании самых различных морфологиче­ских образований. Она постепенно становится настоящей научной дисциплиной, переходя из разряда искусства в разряд воспроизво­димых методов исследования. Однако первичные сведения о внутреннем строении самых разнообразных биологических струк­тур - супрамолекулярных образований, органелл, клеток, тканей и органов уже собраны. Получены морфологические обоснования большинства функциональных феноменов. Началось интенсивное исследование процессов гисто- и органогенеза.
   Вы ждете заключения, подводящего итоги, ставящего новые задачи, рисующего перспективы будущих открытий и разработок в области ЭМ? Мы не станем подводить итоги, поскольку время для этого уже прошло. Авторы крупнейших открытий в области ЭМ уже получили свои Нобелевские премии. Если раньше буквально каждый день выходили все новые и новые статьи, зачастую пере­ворачивающие наши представления о возможностях электронной микроскопии, то в настоящее время электронная микроскопия стала обычным методом морфологического исследования. И все же она продолжает развиваться. Мы рассматриваем наш труд всего лишь как короткий привал на длинном и трудном марше кропот­ливого изучения морфологических основ жизнедеятельности жи­вотного и растительного мира. И если нам удалось заинтересовать читателей и сообщить им хотя бы крупицу полезных для них све­дений, то мы будем считать свою задачу выполненной.
   В конце книги нам хотелось бы обратить внимание читателей на наличие значительной опасности для здоровья при работе буквально со всеми веществами, используемыми в ЭМ: они обладают сильной токсичностью, канцерогенностью, аллергизирующим влиянием и т.п. Для перечисления их вредоносных свойств не хватит еще од­ной книги. Да и сам электронный микроскоп, а также аппаратуру для препарирования объектов в ЭМ трудно отнести к полезным для здоровья устройствам: рентгеновское излучение, высокая пожароопасность, повышенное давление и т.д. и т.п. Поэтому иссле­дователь должен быть чрезвычайно внимателен к технике безопас­ности и технологии работы - иначе возможна беда.
   В заключение выражаем свою признательность всем сотрудни­кам лаборатории электронной микроскопии и кафедры анатомии Ивановского медицинского института, а также лаборатории ульт­раструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) за советы и предоставленные материалы. Они по существу являются соавторами настоящей книги. Мы осо­бенно благодарны ВАТарасову, А.Г.Богданову, А.М.Игнатьеву и Е.В.Королеву за помощь в проведении ЭМ-исследований.
   СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
   АБПХ - авидин-биотин-пероксидаза
   AT - антиген
   AT - антитело
   АРГ - авторадиография
   БВ - бидистиллированная вода
   БДМА - бензилдиметиламин
   БМ - базальная мембрана
   БСА - бычий сывороточный альбумин
   ВАТ - второе антитело
   ВКТ - высушивание в критической точке
   ВМЧ - внутримембранные частицы
   ВПЕ - масса смолы, приходящаяся на эпоксид
   ВСЭМ - высоковольтная СЭМ
   ВТЭМ - высоковольтная ТЭМ
   ГА - глютаральдегид
   ГИС - гибридизация in situ
   ГМА - гликольметакрилат
   ГМК - гладкомышечные клетки
   Д - дегидратант
   ДАВ - диаминобензидин
   ДБФ - дибутилфталат
   ДДСА - додеценилсукциниловый ангидрид
   ДМА - диметиланилин
   ДМАЭ - диметиламиноэтанол
   ДМП - диметоксипропан
   ДМСО - диметилсульфоксид
   ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
   ДСТ - дисульфосукциними-дилтартрат
   ЗС - заливочная среда
   ИМ - инъекционная масса
   ИС - инкубационная среда
   КБ - какодилатный буфер
   КЗ - коллоидное золото
   КП - коррозионный препарат
   КТ - критическая точка
   Л - лектин
   МАТ - моноклональные антитела
   МВИ - микроволновое излучение
   ММА - метилметакрилат
   МНА - метилнадикангидрид
   Мр - маркер
   МФ - микрофиламенты
   МЦ - метилцеллюлоза
   НД - неионогенный детергент
   НК - негативное контрастирование
   ПАП - пероксидаза-антипероксидаза
   ПАТ - первое антитело
   ПБ - перекись бензоила
   ПВП - поливинилпирролидон
   ПИПЕС - пиперазин - N, N-биc-2-эта-нолсульфоновая кислота
   ПС - полутонкий срез
   ПХ - пероксидаза хрена
   ПЭГ - полиэтиленгликоль
   РБНС - раствор, блокирующий неспецифическое связывание
   РК - рутениевый красный
   РМА - рентгеновский микроанализ
   РНК - рибонуклеиновая кислота
   РРА - раствор для разведения антител
   СМ - световая микроскопия
   СТЭМ - сканирующая трансмиссионная электронная микроскопия (сканирующий трансмиссионный электронный микроскоп)
   СЭМ - сканирующая электронная микроскопия (сканирующий электронный микроскоп)
   СЭМКП- СЭМ коррозионных препаратов
   ТБФР - забуференный Трис физраствор
   ТК - таниновая кислота
   Тр - трейсер
   ТС - толуидиновый синий
   ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
   УА - уранилацетат
   УС - ультрасрез (ультратонкий срез)
   УТФ - уридинтрифосфат
   УФО - ультрафиолетовое облучение
   ФА - формальдегид
   ФБ - фосфатный буфер
   ФБФР - физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером
   ФВК - фосфорно-вольфрамовая кислота
   ФМК - фосфорно-молибденовая кислота
   ФХД - физико-химическая диссоциация
   ЦС - цитрат свинца
   ЦСБ - цитоскелетстабилизирующий буфер
   ЦФР - цитратный физраствор
   ЧО - четырехокись осмия
   ЭГТА - этиленгликоль-бис-бета-амино-этиловый эфир-N, N - тетраксусной кислоты
   ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
   ЭМ - электронная микроскопия (электронный микроскоп)
   ЭОД - эффективное осмотическое давление
  
  
   Примечание:
      -- отсутствие указания на температуру предполагает, что процесс идет при ком­натной температуре (20®С);
      -- если не указана концентрация, то имеется в виду 100%-ное вещество;
      -- если в тексте не указано, какой тип раствора используется, то имеется в виду водный раствор;
      -- во всех случаях под словом вода подразумевается дистиллированная вода.
   ПРИЛОЖЕНИЕ
      -- ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
        -- Определение рН
   Вариант 1. Добавить к раствору универсальный индикатор ЗИВ-1: рН 7.4 - цвет раствора ярко-зеленый, рН 7.2 - желто-зеле­ный, рН 7.6 - синевато-зеленый.
   Вариант 2. Добавить к раствору фенолрот (феноловый крас­ный). Фенолрот изменяет свой цвет в пределах рН от 6.8 до 8.0:
   рН от 6.8 до 7.2 - цвет желтовато-оранжевый,
   рН от 7.2 до 7.4 - розовый,
   рН от 7.4 до 7.6 - красный,
   рН от 7.7 до 8.0 - слабо-фиолетовый.
   Вначале приготовить 0,2%-ный раствор красителя, который и добавить к используемому раствору (конечная концентрация дол­жна быть 0,02-0,002%).

1.2 Расчет осмолярности

   Пусть приготовлено 100 мл изотонического какодилатного бу­фера (рН 7.4), для этого к 50 мл 0,2 М какодилата натрия добав­лено 8 мл 0,1 М НСl и объем доведен водой до 100 мл. Какодилат натрия диссоциирует в растворе на две частицы. Осмолярность в 100 мл конечного раствора равна сумме осмолярностей какодила­та и соляной кислоты. Осмолярность какодилата составляет
   0,2?2?50100=0,2
   где 0,2 - исходная молярность какодилата, 2 - число диссоцииро­ванных частиц, 50 - исходный объем 0,2 М раствора, 100 - объем готового раствора.
   Осмолярность НСl, диссоциирующей на 2 частицы, равна
   0,1?2?8100=0,016
   Тогда осмолярность общей смеси будет 0,2 + 0,016=0,216.
  
   При работе с тканями млекопитающих осмолярность раство­ров должна быть равна 0,3. Повысить осмолярность можно с по­мощью 2 М сахарозы. Ее количество должно быть таким, чтобы осмолярность 100 мл 0,216 М раствора довести до 0,3, т.е.
   0,3--0,216=0,084
   Зная, что сахароза не диссоциирует, составляем уравнение:
   2?1???100=0,084
   Отсюда обьем раствора сахарозы (Y) равен 4.2 мл. Итак, для получения 100 мл изотонического тканям млекопитающих какодилатного буфера (рН 7.4) к 50 мл 0,2 М какодилата натрия сле­дует добавить 8 мл 0,1 М НСl, 4.2 мл 0,2 М раствора сахарозы и объем довести водой до 100 мл.

2. РАСТВОРЫ

2.1. Солевые растворы

2.1.1. Молярность изотонических растворов [253]

NaCl 0,16 М MgCl2 0,11 М

КCl 0,16 М Na2HP04 0,13 М

Na2HPO4 0,16 М Глюкоза 0,30 М

СаCl2 0,12 М Сахароза 0,29 М

2.1.2. Забуференный фосфатным буфером физраствор (ФБФР) [253]

   Состав: 8.0 г NaCl, 1.0 г Na2HPO4 и 0,2 г КСl; долить водой до 1 л; рН довести до 7.4 с помощью 1 М раствора НСl.

2.1.3. Физиологический раствор, забуференный Трис-буфером

   Приготовить 0,15 М раствор NaCl на 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 7.4) (см. Приложение, 2.2.6.)

2.1.4. Раствор Рингера для млекопитающих [253]

   Состав: 0,9 г NaCl, 0,42 г КСl, 0,24 г СаСl2"6Н20, 0,05 г NaHCO3, 0,05 г глюкозы и 0,025 г MgCl2-6H20; долить водой до 100 мл.
  

2.1.5. Раствор Рингера для амфибий [253]

   Состав: 0,65 г NaCl, 0,02 г КCl, 0,02 г СаСl2"6Н20; долить во­дой до 100 мл.

2.1.6. Раствор Тироде [253]

   Раствор А: 20,0 г NaCl, O,5 г KCl, 0,05 г СаСl2"6Н20, 0,25 г MgCl2"6Н20; долить водой до 100 мл.
   Раствор Б: 5,0 г NaНСО3, 0,25 г NaН24; долить водой до 100 мл.
   Смешать 40 мл раствора А, разведенных 460 мл воды, и 20 мл раствора Б, разведенных 480 мл воды, и добавить 1,0 г глюкозы.
  

2.2. Буферные растворы

2.2.1. Na-K-фосфатный буфер (ФБ) Соренсена [253]

   Раствор А: 0,066 М КН2РО4 (= 0,908% КН2РО4).
   Раствор Б: 0,066 М Na2НPО4 (= 1.188% Na2НPО4 "2Н2О),
   (= 1.786% Na2НPО4"7H2О),
   (= 2.387% Na2НPО4"12Н2О).
   Слить соответствующие объемы растворов А и Б.
   рН
   6.0
   6.8
   7.0
   7.2
   7.4
   7.6
   7.8
   8.0
   А, мл
   87.7
   50,8
   39.2
   28.5
   19.6
   13.2
   8.6
   5.5.0
   Б, мл
   12.3
   49.2
   60,8
   71.5
   80,4
   86.8
   91.4
   94.5
  

2.2.2. Изотонический Na-ФБ [253]

   Вариант 1. Приготовить растворы А и Б.
   Раствор А: 0,164 М Na2НPО4 (= 2.26% NaН242О),
   (= 2.56% NaН24"2Н2О).
   Раствор Б: 0,63 М NaOH (= 2.52% NaOH).
   Слить соответствующие объемы растворов А и Б.
  
   рН
   6.0
   6.2
   6.4
   6.8
   7.0
   7.2
   7.4
   7.6
   7.8
   А, мл
   Б, мл
   96.2
   3.8
   94.7
   5.3
   92.5
   7.5
   87.9 12.1
   85.8 14.2
   83.9 16.1
   82.5 17.5
   81.6 18.4
   80,8
   19.2
  
   Вариант 2. Взвесить указанное число граммов веществ А и Б, растворить в 100 мл воды.
   рН
   6.6
   6.8
   7.0
   7.2
   7.4
   7.6
   7.8
   A: Na2Н242О, г
   1.30
   0,90
   0,70
   0,51
   0,34
   0,25
   0,16
   Б: Na2НPО4"7Н2О, г или NaН24 "12Н2О, г
   0,90 1.20
   1.72 2.30
   2.10 2.80
   2.50 3.33
   2.82 3.77
   3.00 4.03
   3.19 4.26
  

2.2.3. Растворы Na-ФБ разной молярности [253]

   Вариант 1. Приготовить растворы А и Б нужной молярности.
  
  
   Раствор А: 0,02 М NaН24
  
   Раствор Б: 0,02 М Na2НPО4
  
  
  
   Раствор А: 0,1 М NaН24
  
   Раствор Б: 0,1 М Na2НPО4
  
  
  
   Раствор А: 0,2 М NaН24
  
   Раствор Б: 0,2 М Na2НPО4
  
   (= 0,276% NaН242О),
   (= 0,31% NaН24 "2Н2О),
   (= 0,36% Na2НPО42О),
   (= 0,54% Na2НPО4 "7Н2О),
   (= 0,72% Na2НPО4 "12Н2О).
  
   (= 1,38% NaН242О),
   (= 1,56% NaН24 "2Н2О),
   (= 1,78% Na2НPО42О),
   (= 2,68% Na2НPО4 "7Н2О),
   (= 3,58% Na2НPО4 "12Н2О),
  
   (= 2,76% NaН242О),
   (= 3,12% NaН24 "2Н2О),
   (= 3,56% Na2НPО42О),
   (= 5,37% Na2НPО4 "7Н2О),
  
  
   Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

pH

6,0

6,2

6,4

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

А, мл

87,7

81,6

73,5

51,0

39,0

28,0

19,0

13,0

8,5

5,30

Б, мл

12,3

18,4

26,5

49,0

61,0

72,0

81,0

87,0

91,5

94,7

  
   Вариант 2. Взвесить указанное под нужным значением pH количество граммов вещества А и Б, растворить для получения 0,5М раствора в 20 мл воды, 0,2М - в 50 мл, 0,1М - в 100 мл, 0,05М - в 200 мл, 0,02 М - в 500 мл соответственно.

pH

6,4

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

А: NaН242О, г

1,0

0,7

0,54

0,39

0,26

0,18

0,12

0,07

Б: Na2НPО42О

или

Na2НPО4 "12Н2О, г

0,71

0,95

1,31

1,75

1,63

2,18

1,93

2,58

2,17

2,9

2,32

3,1

2,46

3,28

2,54

3,39

  

2.2.4. Какодилатный буфер (КБ) [253]

   Раствор А: 0,2 М какодилат натрия (= 4.28% NA(CH3)2As"ЗН2О).
   Раствор Б: 0,2 М НСl - 1.66 мл концентрированной (36-38%) НСl долить водой до 100 мл.
   0,2 М буфер: слить 25 мл раствора А с соответствующим объе­мом раствора Б.
  

рН

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

Б, мл

9.2

6.7

4.7

3.2

2.1

1.4

   0,1 М буфер: слить 10 мл буфера и 10 мл воды.
   0,05 М буфер: слить 10 мл буфера и 30 мл воды.
   0,4 М буфер с сахарозой (рН 7.4): 34.2 г сахарозы и 21.4 г ка­кодилата натрия растворить в 300 мл воды; добавить 3 мл 1 М раствора НСl; долить водой до 500 мл; отъюстировать рН с по­мощью 0,1 М раствора NaOH.
  

2.2.5. 0,2 М коллидиновый буфер (рН 7.4)

  
   Растворить 26.7 мл S-коллидина в 500 мл воды; добавить 90 мл 1.0 М раствора НСl; долить водой до 1000 мл.

2.2.6. Трис-HCI буфер

   Раствор А: 0,2 М Трис (24.2 г Трис долить водой до 1000 мл).
   Раствор Б: 0,1 М НСl.
   Слить 25 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 100 мл.
  

РН

7.19

7.36

7.54

7.66

7.77

7.87

7.96

8.05

8.14

Б, мл

45.0

42.5

40,0

37.5

35.0

32.5

30,0

27.5

25.0

  

рН

8.23

8.32

8.41

8.51

8.62

8.74

8.92

9.10

Б, мл

22.5

20,0

17.5

15.0

12.5

10,0

7.5

5.0

  

2.2.7. 0,2 М Трис-малеатный буфер

   Раствор А: 24.2 г Трис и 232 г малеиновой кислоты (или 19.6 г малеинового ангидрида) растворить в воде; объем довести до 1000 мл.
   Раствор Б: 0,2 М раствор NaOH.
   Слить 25 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 100 мл.
  

рн

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

Б, мл

10,3

13.0

15.8

18.5

21.3

22.5

24.0

25.5

  

рН

7.4

7.6

7.8

8.0

8.2

8.4

8.6

Б, мл

27.0

29.0

31.8

34.5

37.5

40,5

43.3

  

2.2.8. Натрий-малеатный буфер [253]

   Раствор А: 1.96 г малеинового ангидрида (или 2.32 г малеиновой кислоты) и 0,8 г едкого натра растворить в воде, объем довести до 100 мл.
   Раствор Б: 0,2 М раствор NaOH (= 0,8%). 0,2 М буфер: слить 50 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 200 мл.

рН

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.8

Б, мл

7.2

10,5

15.3

10,8

26.9

33.0

38.0

41.6

44.4

   0,05 М буфер: слить 10 мл 0,2 М буфера и 30 мл воды.
  

2.2.9. Вероналовый буфер [253]

  
   Раствор А: 0,1 М веронала натрия (= 2.06%).
   Раствор Б: 0,1 М HCI - 0,83 мл концентрированной НСl рас­творить в 100 мл Н2О.
   Взять соответствующее количество раствора А и долить рас­твором Б до 100 мл.

рН

6.8

7.0

7.2

7.4

7.6

А, мл

52.2

53.6

55.4

58.1

61.5

  

2.2.10. 0,028 М вероналацетатный буфер [253]

  
   Вариант 1. Приготовить растворы А-В.
   Раствор А: взвесить 2.95 г веронала натрия и 1.17 г ацетата на­трия (или 1.94 г CH3COONa"3Н2О), долить водой до 100 мл; вы­держать 24 ч.
   Раствор Б: 0,1 М НСl. Раствор В: 85%-ный раствор NaCl.
   Слить соответствующие объемы растворов А, Б, и В, долить водой до 100 мл.

рН

3.0

4.0

5.0

6.0

6.8

7.0

7.2

7,4 1

А, мл

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

Б, мл

61.6

50,2

35.2

28.4

25.6

24.2

22.6

20,2

В, мл

8.0

8.0

8.0

8.0

8.0

8.0

8.0

8.0

  
   Вариант 2 (рН 7.2). Растворить в воде 1.493 г ацетата натрия и 2.943 г веронала натрия, объем довести до 100 мл; слить 5 мл это­го раствора и 5.5 мл 0,1 М НСl, долить водой до 25 мл.
   Вариант 3 (рН 7.2). Слить 10 мл раствора Г, 3.4 мл раствора Рингера, 25 мл воды и 11 мл раствора Б.
  

2.2.11. 0,3 М пиперазиновый буфер [253]

  
   0,3 М буфер: 9.0 г ПИПЕС растворить в 50 мл воды, оттитро­вать рН с помощью 0,1 М раствора NaOH (= 0,4%), долить водой до 100 мл.
   0,2 М буфер: слить 20 мл 0,3 М раствора и 10 мл воды.
   0,1 М буфер: слить 10 мл 0,3 М раствора и 20 мл воды.
   0,08 М буфер: слить 8 мл 0,3 М раствора и 22 мл воды.
   Использование: для животных тканей - префиксация 3%-ным раствором ГА на 0,1 М пиперазиновом буфере (рН 8.0), постфик­сация 2%-ным раствором ЧО на 0,08 М пиперазиновом буфере (рН 6.8); для растительных тканей - префиксация 5%-ным раствором ГА на 0,08 М пиперазиновом буфере (рН 8.0), постфиксация 2%-ным раствором ЧО на 0,2 М пиперазиновом буфере (рН 6.8). Раствор ГА стабилен на протяжении 1 мес. Раствор ЧО портится в течение 1 ч.
  

2.2.12. Ацетатный буфер [253]

  
   Раствор А: 0,2 М уксусная кислота (= 1.2%) - 12.0 г уксусной кислоты развести водой до 1000 мл.
   Раствор Б: 0,2 М раствор ацетата натрия (= 1.64% CH3COONa или 2.74% CH3COONa"3Н2О) - 16.4 г ацетата натрия раство­рить в воде, объем довести до 1000 мл.
   0,1 М буфер: слить соответствующие объемы растворов А и Б, долить водой до 1000 мл.

рн

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

А, мл

46.3

44.0

41.0

36.8

30,5

25.5

20,0

14.8

10,5

8.8

4.8

Б, мл

3.7

6.0

9.0

13.2

19.5

24.5

30,0

35.2

39.5

41.2

45.2

  

2.2.13. Буфер Мак-Ильвейна (Na-фосфатцитратный)

  
   Раствор А: 0,2 М раствор Na2HP04 (см. Приложение, 2.2.3).
   Раствор Б: 0,1 М раствор лимонной кислоты.
   Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

рн

4.0

4.2

4.4

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

А, мл

7.7

8.3

8.8

9.4

10,3

10,7

11.2

11.6

12.1

12.6

Б, мл

12.3

11.7

11.2

10,6

9.7

9.3

8.8

8.4

7.9

7.4

  
  

рн

6.2

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

7.6

7.8

8.0

А, мл

13.2

13.9

14.6

15.5

16.5

17.4

18.2

18.7

19.2

19.5

Б, мл

6.8

6.1

5.4

4.5

3.5

2.6

1.8

1.3

0,8

0,5

  

2.2.14. 0,2 М хроматный буфер

  
   рН 6.2: 0,40 г бихромата калия и 2.79 г хромата натрия раство­рить в 100 мл бидистиллированной воды.
   рН 7.2: 2.23 г бихромата калия и 0,79 г хромата натрия раство­рить в 100 мл бидистиллированной воды.
  

3. ФИКСАЦИЯ

3.1. Схема препарирования объектов для ТЭМ [253]

  

Процедура

Длительность процедуры, мин

минимум

оптимум

максимум

   ГА

10-60

90

24 ч

   Промывание

10

30

24 ч

   ЧО

60

90

24 ч

   Промывание

10

30

24 ч

   Дегидратант (Д):
   30%-ный (можно исключить)

1

5

30

   50%-ный

1

5

30

   70%-ный

1

5

На ночь

   96%-ный

1

5

-"-

   100%-ный

5 раз по 3

5 раз по 6

-"-

   Смесь (1 : 2) 100%-ного Д с ЗС

5

10

-"-

   ЗС

5

10

-"-

   Полимеризация

24-48 ч

  

3.1. Агаровый гель для контроля за температурой фиксации

   Смешать 100 мл 0,9%-ного раствора NaCl и 29 мл агара, на­греть до расплавления, добавить 0,5 мл красителя Гимза, охладить и нарезать блоками.
  
  

3.2. Очистка ГА

   К 200 мл 25%- или 50%-ного раствора ГА добавить активиро­ванный уголь (30,0 г), встряхивать 1 ч, отфильтровать под вакуу­мом (фильтр - Ватман N 42), жидкость вновь смешать с такой же свежей порцией активированного угля и все повторить еще раз. Выход составляет 20-30 мл очищенного ГА. В процессе фильтра­ции концентрация и объем ГА снижаются, а рН повышается: 1-я фильтрация - объем уменьшается с 200 до 150 мл, концентрация ГА падает с 25 до 22%, рН повышается до 5.8; 2-я фильтрация - объем снижается до 95 мл, концентрация - до 18%, рН возрастает до 6.9. Конечная концентрация ГА составляет 8-12%, рН 8.0 (по­скольку ГА в щелочной среде быстро полимеризуется, надо немед­ленно добавить несколько капель НСl).
   При дистилляции под атмосферным давлением дистиллят со­бирают при t=100®С порциями по 50 мл, в которых определяют рН. Если рН < 3.4, то порцию выбрасывают.
   Дистилляция под слабым вакуумом проводится в колбах путем их нагревания до t=65®С. После снятия вакуума дистиллят (вяз­кая прозрачная жидкость) разводят таким же количеством свежепрокипяченной деминерализованной воды путем медленного добавления последней (t=75®С) к дистилляту на магнитной ме­шалке под азотом.
  

3.3. Регенерация ЧО

  
   К 500 мл использованного раствора ЧО постепенно добавить при постоянном помешивании 5 мл концентирированной серной кислоты и 200 мл 6%-ного раствора перманганата калия и оста­вить на 30 мин. Если раствор стал коричневым, то надо добавить свежий перманганат, чтобы цвет вновь стал фиолетовым.
   Смесь следует экстрагировать путем интенсивного встряхива­ния в течение 2-3 мин в делительной воронке с тремя последова­тельно сменяемыми порциями по 150 мл ССЦ. Более тяжелую фракцию четыреххлористого углерода, содержащую ЧО, тщатель­но отделить в делительной воронке от водной фракции, содержа­щей двуокись марганца.
   Добавить 10 мл абсолютного этанола. При этом цвет раствора становится более темным и начинает осаждаться осмиевая чернь (OSO2). Колбу закрыть и оставить на 48 ч при t=20®С. Бесцвет­ный супернатант слить, а осадок оставить. Добавить к осадку 20 мл абсолютного ацетона. Колбу несколько раз встряхнуть, осадок, прилипший к стенкам, тщательно счистить стеклянной палочкой. Взвесь отфильтровать через фильтровальную воронку с сухим фильтром (Ватман N 1). Колбу промыть добавочными порциями ацетона для удаления остатков осмиевой черни. Ацетон отфильт­ровать через тот же фильтр. Осадок OSO2 промыть тремя порция­ми ацетона по 50 мл. Бумажный фильтр с осадком поместить на фарфоровую пластинку и перенести в вакуумную сушилку на ночь. В камере желательно иметь влагопоглотитель (хлорид кальция и т.п.).
   Сухой порошок OSO2 собрать в небольшую стеклянную бутыл­ку и закрыть пробкой; здесь он может храниться неограниченное время. Из каждого литра использованного 2%-ного раствора ЧО получается около 5 г сухой осмиевой черни (OSO2).
   Для приготовления раствора ЧО 1.0 г сухого порошка OSO2 поместить в чистую стеклянную бутылку, добавить 45 мл воды для получения суспензии, а затем 1 мл 30%-ной перекиси водоро­да; все перемешать, закрыть кусочком алюминиевой фольги и по­местить в холодильник на 30 мин. Если растворилась не вся дву­окись осмия, то бутылку оставить еще на 30 мин.
   При наличии иодидов и двухромовокислого калия метод не работает.
  

3.4. Приготовление раствора ФА

  
   Размешать параформ (2.0 г) в 25 мл воды; нагреть до t=60®С (закрыв пробку), добавить 1-5 капель 1 М NaOH до просветления, охладить.
  

3.5. Фиксаторы на основе ГА

   Вариант 1. Слить 10 мл 25%-ного раствора ГА и 90 мл 0,1 М ФБ (рН 7.4), добавить 2 капли 1%-ного раствора CaCl2.
   Вариант 2. Слить 10 мл 25%-ного раствора ГА и 90 мл раство­ра Хэнкса (или среды 199), добавить 1-2 капли 0,1 М раствора NaOH до окрашивания раствора в красный цвет.
   Вариант 3. Приготовить на 0,1 М ФБ (рН 7.4) 15%-ный рас­твор ГА, содержащий 2.5% поливинилпирролидона.
   Вариант 4, фиксатор Милонига. Слить 415 мл 2.26%-ного раствора NaН24 "2Н2О, 8.5 мл 2.52%-ного раствора NaOH и до­вести рН до 7.3. К 50 мл этого раствора добавить по каплям, поме­шивая, 0,1 мл 0,5 М раствора CaCl2. К 42 мл полученного раствора добавить 8 мл 25%-ного ГА.
  

3.6. Фиксаторы на основе ФА

   Вариант 1. Приготовить 4%-ный ФА на 0,1 М КБ (рН 7.4). Фиксация длится 2-16 ч.
  

3.7. Фиксаторы на основе ЧО

3.7.1. ЧО с двухромовокислым калием[253]

   Вариант 1. В 25 мл 0,13 М ФБ (рН 7.7) растворить 0,175 г К2СГ2О7 (рН снизится до 6.8) и 0,5 г ЧО. Фиксация длится 1-2 ч.
   Вариант 2. Растворить 2.0 г K2Cr2O7 в 40 мл воды, довести рН до 7.2 с помощью 5 М раствора КОН. Слить 2 мл этого раствора, 2 мл 3.4%-ного NaCl и 4 мл 2%-ного ЧО. Раствор фиксатора ста­билен несколько месяцев. Фиксация длится 1-24 ч.
  

3.7.2. Фиксатор Милонига

  
   Вариант 1. Приготовить растворы А-Г.
   Раствор А: 5.1%-ный раствор NaН242О.
   Раствор Б: 5.5%-ный раствор NaOH.
   Раствор В: 5.4%-ный раствор глюкозы.
   Раствор Р. слить 49.5 мл раствора А и 10,8 мл раствора Б.
   Слить 20 мл раствора Г, 5 мл раствора В и 25 мл 2%-ного рас­твора ЧО.
  
   Вариант 2. Слить 14.0 мл 6.71%-ного раствора NaН242О, 8.5 мл 2.52%-ного раствора NaOH, 55 мл 5.4%-ного раствора глю­козы, 27.5 мл 2%-ного раствора ЧО, 0,3 мл 1%-ного раствора CaCl2.
  

3.8. Фиксаторы на основе акролеина

3.8.1. 10%-ный акролеин на ФБ [253]

   Слить 25 мл 0,2 М ФБ (рН 7,6), 5 мл чистого акролеина и 20 мл воды. Фиксация длится 30-120 мин.
  

3.9. Смешанные фиксаторы

3.9.1. Фиксатор Карновского

   Приготовить на 0,08 М КБ (рН 7.2) раствор, содержащий 5% ГА и 4% ФА, и добавить 5 ммоль/л CaCl2.
  

3.9.2. Разведенный фиксатор Карновского

   Приготовить 1%-ный раствор ГА и 1%-ный раствор ФА на 0,1 М КБ (рН 7.3).

3.9.3. Фиксатор с акролеином

   Слить 50 мл 0,2 М КБ (рН 7.4), 1 мл акролеина, 8 мл 25%-ного раствора ГА, долить водой до 100 мл. Фиксация длится 2 ч. Нельзя добавлять сахарозу.

3.9.4. Фиксатор:1 акролеин + ФА + ГА + ДМСО [253]

   Слить 44.0 мл 2%-ного раствора ФА на 0,1 М КБ (рН 7.4), 5.0 мл 25%-ного раствора ГА, 05 мл акролеина, 1.25 мл ДМСО и доба­вить 8 мг CaCl2. Время фиксации - до 16 ч. Промывание в 0,1 М КБ (рН 7.4) с 0,1 М сахарозой (= 3.4%) длится 10 мин. Постфик­сация 2%-ным раствором ЧО в 0,2 М сахарозе (= 7%) - в течение 2-4 ч. Затем осуществить обезвоживание и заключение в смолу.
  

3.9.5. Фиксатор: ГА + ФА + акролеин + УА

  
   Приготовить на 0,1 М коллидиновом буфере (рН 6.8) раствор, содержащий 1% акролеина, 1% ФА, 1% ГА и 2% УА.
  

3.10. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ФИКСАТОРЫ

3.10.1. ЧО + феррицианид натрия

   Вариант 1. К 1%-ному раствору ЧО на 0,1 М КБ (рН 7.4) до­бавить ex tempore 50 ммоль/л феррицианида натрия. Фиксация длится 2 ч (t=4®С).
   Вариант 2. Приготовить на 0,1 М ФБ (рН 6.0) раствор, содер­жащий 2% ЧО и 1.5% феррицианида калия. Фиксация длится 2 ч (t=4®С).
  

3.10.2. ЧО + ферроцианид калия

   Смешать равные объемы 2%-ного раствора ЧО и 3%-ного рас­твора ферроцианида калия, приготовленного за 10 сут до этого; оба раствора готовят на 0,2 М КБ (рН 7.4). При смешивании ЧО с ферроцианидом калия раствор приобретает темно-коричневый цвет, поскольку ЧО восстанавливается. Постфиксация длится 2 ч (t=4®С). Промывать объекты в 6.8%-ном растворе сахарозы на 0,1 М КБ (рН 7.4), до тех пор пока промывочный раствор не ста­нет прозрачным.
   Провести обезвоживание и заключение в смолу.
  

3.10.3. Фиксатор для выявления гликозаминогликанов

  
   Приготовить 2%-ный раствор ГА с добавлением 0,1-1% аль-цианового синего (рН 6.5). В постфиксатор следует добавить лан­тан - осадок будет виден более четко.
  

3.10.4. Фиксатор для выявления липидов

   Приготовить на КБ (рН 7.1) 2%-ный раствор ГА с добавлени­ем 0,1% малахитового зеленого.

3.10.5. ГА + таниновая кислота

   Вариант 1. Приготовить 0,5%-ный раствор ГА на 0,05-0,1 М ГЕПЕС-буфере (рН 7.4) с добавлением 0,2% ТК.
   Вариант 2. Растворить 0,5 г ТК в 22.5 мл 0,05 М КБ (рН 6.8), добавить 2,5 мл 25%-ного раствора ГА. Фиксация длится 120 мин, промывание в 8%-ном растворе сахарозы на 0,05 М КБ (рН 6.8) -в течение ночи, постфиксация в 1%-ном растворе ЧО на 0,05 М КБ (рН 6.8) с добавлением 7% сахарозы - в течение 1.5 ч.
  

3.10.6. Обработка таниновой кислотой

   Фиксация перфузией 1%-ного раствора ГА на 0.1 М КБ (рН 7.3) с добавлением 1% ТК в течение 5 мин. Фиксация иссечен­ных кусочков в том же растворе в течение 2 ч. Промывание в КБ с добавлением 180 ммоль/л сахарозы. Постфиксация в 1%-ном растворе 40 на КБ (рН 7.3) в течение 1 ч.
  

3.10.7. ГА + лизин

   Раствор А: свежеприготовленный очищенный 4%-ный раствор ГА на 0.05 М КБ (рН 7.4).
   Раствор Б: свежеприготовленный 0.1 М раствор лизина (осно вания) на 0.05 М КБ (рН 7.4).
   Раствор В: слить растворы А и Б (1 : 1), рН снизится.
   Раствор Г: слить раствор А и 0.5 М КБ (рН 7.4) (1 : 1). Фикси­ровать 10-60 мин в растворе В, а затем 60 мин (можно оставить на ночь) в растворе Г.
  

3.10.8. Перйодат + лизин + ФА [246]

  
   Раствор А: к 0.2 М раствору гидрохлорида лизина добавлять 0.2 М раствор Na2НPО4, до тех пор пока рН не будет равен 7.4; раствор развести в 2 раза с помощью 0.1 М ФБ (рН 7.4).
   Раствор Б: растворить 8.0 г параформа в 100 мл воды (t=65®С), добавить несколько капель 40%-ного раствора NaOH для просветления жидкости и растворить 5.4 г глюкозы.
   Перед использованием смешать растворы А и Б (3 : 1) и доба­вить 10 ммоль/л метаперйодата натрия. Продолжительность фиксации - до 3 сут (t=4®С).
  

3.10.9. Фиксатор для МВИ

  
   Приготовить на 0.1 М КБ (рН 7.2) раствор, содержащий 2% ФА, 0.5% ГА, 2 ммоль/л CaCl2 и 1 ммоль/л MgCl2. Облучение продолжается 20 с (2.45 гГц, 500 Вт). Кусочки оставляют в фик­саторе на 60 мин (t < 35®С).
  

3.10.10. Фиксатор для перфузии и иммуно-ЭМ [281]

  
   Приготовить на 0.1 М КБ (рН 8.0) раствор, содержащий 2% ФА, 1% акролеина, 0.05% ГА, 0.1% пикриновой кислоты, 1% сахарозы.
  

3.10.11. Фиксатор для иммуно-ЭМ

  
   Вариант 1. Нагреть в конической колбе 100 мл 0.2 М ФБ (рН 7.2) до t=60®С, добавить 8.0 г параформальдегида, интенсивно пе­ремешать, добавить 1-3 капли 1 М раствора NaOH. Нагревать смесь до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (но не до кипения!); охладить, добавить 4 мл 25%-ного раствора ГА, долить водой до 200 мл, оттитровать рН.
   Вариант 2 [227]. Приготовить 0.5%-ный раствор ФА, содержа­щий 0.1 моль/л циклогексиламина (основания), 2 ммоль/л ЭГТА, 5 ммоль/л ПИПЕС, 2 ммоль/л MgCl2 (рН 6.5).
  

3.10.12. Фиксатор для иммуно-ЭМ и МВИ [255]

  
   Приготовить 4%-ный раствор ФА, содержащий 0.1% ГА, 2 ммоль/л CaCl2, 2 ммоль/л MgCl2. Время воздействия МВИ 15-30 с. После МВИ объекты оставить в том же растворе на 1 ч.
  

3.10.13. Постфиксационная обработка ТК [323]

  
   Фиксировать в 2%-ном растворе ГА на 0.1 М КБ (рН 7.4) в течение 90 мин. Промыть в КБ 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО на том же буфере 90 мин. Промыть в КБ (рН 7.2) 10 мин. Обработать в 1%-ном растворе ТК на 0.05 М КБ (рН 7.0) 30 мин. Промыть в 1%-ном растворе сульфата натрия на 0.05 М КБ (рН 7.0) 5 мин. Обезводить, заключить в эпоксидную смолу.

4. ЗАЛИВКА

4.1 Свойства основных компонентов эпоксидных смол [156]

Название

Молеку­лярная масса

Вязкость, сП

Плотность, г/мл

ВПЕ

ДДСА (DDSA)

266

290-295

1.0

-

МНА (MNA)

178

225-275

1.24

-

НСА (NSA)

224

117-120

1.00-1.05

-

ГХСА (HXSA)

182

20-26

1.00-1.10

-

ОСА (OSA)

210

32

1.00

-

Аралдит М (Araldit)

-

1300-1650

1.1-1.15

226-242

Аралдит MY 753

-

1800-2800

1.13-1.17

219-235

Аралдит 502

-

2100-3600

1.13-1.17

222-238

Эпон 812 (Ероп)

-

120-210

1.15-1.22

145-160

Г ТААБ (ТааЬ)

-

-

1.11

-

ДЕР 732 (DER)

-

-

1.07

-

Мараглас 655 (Maraglas)

-

-

1.19

-

Дибутилфталат

-

-

1.04

-

БДМА (DDMA)

-

-

0.93

-

ДМАЕ или Сl (DMAE, S1)

-

-

0.9

335

4.2. Стандартные заливочные смеси эпона и аралдита [156]

  

Название компонента

Аралдит, мл(г)

Эпон, мл(г)

Эпон+Аралдит, мл(г)

А

Б

В

Аралдит

19.0(22.0)

-

-

-

12.0(14.0)

Эпон

-

20.0(24.0)

20.0(24.0)

20.0(24.0)

20.0(24.0)

ДДСА

21.0(21.0)

22.0(22.0)

16.0(16.0)

9.0(9.0)

50.0(50.0)

МНА

-

5.0(6.0)

8.0(10.0)

12.0(15.0)

-

БДМА

1.2(1.3)

1.4(1.5)

1.3(1.5)

1.2(1.4)

2.5(2.6)

ДБФ*

0.6(0.6)

-

-

-

0.4(0.4)

  
   *Только для Аралдита 502 и Аралдита MY753.
   Блоки: А - мягкие, Б - средней твердости, В - твердые.
  

4.3. Стандартная схема заливки объектов в эпоксидные смолы [156]

  

N

п/п

Этап

Длитель­ность этапа

1

Обезвоживание в 100%-ном этаноле

30 мин

2

Замещение этанола его смесью с окисью пропилена (1 : 1)

10 мин

3

Инфильтрация чистой окисью пропилена

10 мин

4

Инфильтрация смесью смолы и окиси пропилена (1 : 1)

1-2 ч

5

Инфильтрация полной заливочной смесью эпоксидной смолы

На ночь

6

Инфильтрация полной заливочной смесью эпоксидной смолы

2-4 ч

7

Полимеризация при t=60®С

24-48 ч

  

4.4. Ускоренное обезвоживание и пропитывание

   После обезвоживания в абсолютном этаноле кусочки поме­стить для пропитывания в смесь смолы с абсолютным этанолом (1: 1) и поставить в термостат при t=37®С на 30 мин; затем пе­ренести в смесь для пропитки и оставить при t=37®С на ночь. После этого кусочки переложить в полную заливочную среду (ЗС) на 1-2 ч, а затем перенести в капсулы со смесью для заливки. Капсулы поместить в термостат на несколько часов при t=37®С, а затем на 2 сут при t=56®С.
  
  

4.5. Заливочная среда ТААБ [253]

Компонент

Количество компонента, мл

А

Б

В

ТААБ (смола)

20.0

20.0

20.0

ДДСА (пластификатор)

20.0

10.0

2.0

МНА (отвердитель)

   -

10.0

18.0,

Все смеша т ь

БДМА (акселератор)

1.2

1.2

1.2

Время полимеризации, ч

24-48

  
   Блоки: А - мягкие, Б - средней твердости, В - твердые.
  

4.6. Заливка в смолу с низкой вязкостью (СПЕРРА) [336]

  
   Компонент
   Количество компонента, г
  
  

А

Б

В

Г

Д

ЕРЛ 4206 (ERL 4206) (смола)

10.0

10.0

10.0

10.0

10.0

ДЕР 736 (пластификатор)

6.0

4.0

8.0

6.0

6.0

НСА (отвердитель)

26.0

26.0

26.0

26.0

26.0

ДМАЕ (акселератор)

0.4

0.4

0.4

1.0

0.2

Общее количество

42.4

40.4

44.4

43.0

42.2

Время полимеризации, ч (t=37®С)

8

8

8

3

16

Сохранность ЗС, сут

3-4

3-4

3-4

2

7

  
   Блоки: А - стандартной твердости, Б - твердые, В - мягкие.
   Полимеризация: Д - быстрая, Г - медленная.
   Пропитывание. К последней смене 100%-ного этанола доба­вить столько же ЗС, инкубировать 30 мин. Затем к этой смеси до­бавить равное количество ЗС - на 30 мин. Объект перенести в све­жую порцию ЗС и оставить на 4 ч, заменить на свежую ЗС, пропитывание длится всю ночь.
  

4.7. Заливочная смесь Мараглас + Кардолит

   Вариант 1. Отмерить 60-70 мл Марагласа 655, 20-30 мл Кардолита НС-513, 5-10 мл ДБФ. Перемешать и добавить 2 мл БДМА. После окиси пропилена поместить в разведенную окисью пропилена ЗС (1: 1) на 30 мин, а затем в свежую ЗС на 12 ч. За­лить в капсулы и полимеризовать при t=60®С 48-72 ч.
   Вариант 2 [253]. Отмерить 34 мл Марагласа 655, 10 мл Кардолита НС-513, 5 мл ДБФ. Перемешать и добавить 1 мл БДМА (2%). После обработки окисью пропилена объекты поместить в закрытые контейнеры с ЗС (t=10®С) на 12 ч, а затем перенести их в капсулы с ЗС (t=60®С) на 48 ч.
   Вариант 3. Отмерить 36 мл Марагласа 655, 8 мл ДЕР 732, 5 мл ДБФ. Перемешать и добавить 2% БДМА (1 мл или 4 капли на каждые 5 мл).
  

4.8. Заливочная среда Вестопал В [253]

  
   К 50.0 мл Вестопала В (Westopal W) добавить 0.5 мл инициато­ра (катализатора) и перемешать, затем добавить 0.25 мл активато­ра (ускорителя) и снова перемешать.
   После обезвоживания в ацетоне поместить объекты в смесь Вестопала В с ацетоном 3 : 7 на 30 мин, затем в смесь 5 : 5 на 30 мин, затем в смесь 7 : 3 на 30 мин и, наконец, в смесь 9 : 1 на 30 мин. Пропитать в ЗС Вестопал В 2 раза по 1 ч. Поместить в свежую ЗС в капсулах на 24 ч. Полимеризация длится 24 ч (t=60®С).
  

4.9. Заливочная среда Д.Е.Р. (D.E.R.) [253]

  

Компонент

Количество компонента, мл

А

Б

В

ДЕР 332 (нагреть до 60®С)

7

6

7

ДЕР 732

3

3

2

ДДСА

5

10

5

Все смешать

БДМА

0.45

0.57

0.42

  
   Блоки: А - средней твердости для обычного использования, Б -средней твердости с повышенной терморезистентностыо, В - твер­дые для твердых тканей.
   Пропитывание. После обработки окисью пропилена поместить объекты в смесь окиси пропилена с ЗС (1 : 1) в закрытом контей­нере на 1 ч (t=45®С); перенести объекты в открытый контейнер с ЗС (t=37®С) на 1 ч; разлить свежую ЗС в капсулы и поместить в них объекты (t=37®С) на 24 ч, затем температура поднимается до 45®С на 24 ч, после чего температуру поднять до 60®С на 24 ча­са; изготавливать УС можно через 24 ч.

4.10. Заливочная смесь ЕРЛ 4206 [253]

  

Компонент

Количество компонента, г

А

Б

В

ЕРЛ 4206 (ERL 4206)

20

20

20

ДЕР 736

16

12

8

НСА

52

52

52

Все смешать

ДМАЕ (в зависимости от продолжительности полимеризации) при t=70®С

16 ч

0.4 г (1% или 1 капля на 2 г смеси)

8 ч

0.8 г (2% или 1 капля на 1 г смеси)

3 ч

2.0 г (5%, или 5 капель на 2 г смеси)

  
   Блоки: А - средней твердости для обычного использования, Б - средней твердости с повышенной терморезистентностью, В - твердые для твердых тканей.
   Пропитывание. После обработки в окиси пропилена объект по­местить в смесь окиси пропилена с ЗС 1 : 1 на 30 мин, в смесь 3 : 1 на 30 мин, в полную ЗС (при постоянном помешивании) на 3-4 ч; перенести объекты в свежую ЗС в капсулах и оставить на ночь (последний этап для плотных тканей) в термостате.
  

4.11. Заливка в полиэтиленгликоль (ПЭГ)

   Обезводить объект в возрастающих концентрациях ПЭГ (луч­ше всего использовать ПЭГ-3350, который является жидким при t=55®С). Если необходимы более толстые срезы (более 0.5 мкм), то рекомендуется использовать ПЭГ-3350 в смеси с ПЭГ-1500 (9 : 1). Пропитать объект в водных растворах ПЭГ с возра­стающей концентрацией (25, 40, 50, 70, 95%) по 10-20 мин. Ин­фильтрировать в 100%-ном ПЭГ 3 раза по 60 мин (t=55®С). Объекты при переносе быстро обсушить на фильтровальной бума­ге, можно обезвоживать в этаноле, а затем выдержать в смеси эта­нола и ПЭГ (1 : 1) и 100%-ном ПЭГ по 60 мин.
   Налить ПЭГ в желатиновые капсулы, поместить туда объект и быстро охладить капсулы в жидком азоте. Резание проводить на сухой стеклянный или алмазный нож.
  

4.11.1. Монтирование срезов, залитых в ПЭГ

  
   Вариант 1. УС (или ПС) с сухого ножа с помощью ресницы перенести на покрытые полилизином сеточки или стекло, которые в свою очередь на 1-5 мин поместить в термостат (t=55®С). Срезы расправить и прикрепить к сеточке или стеклу.
   Вариант 2. Петлю диаметром 2-3 мм, сделанную из платино­вой проволоки и прикрепленную к деревянной палочке, погрузить в 2.3 М сахарозу или в 40%-ный раствор ПЭГ на 0.1 М ФБФР. Петлей, с образовавшейся на ее конце каплей, нужно коснуться ленты УС, контролируя процедуру под стереомикроскопом. УС предварительно следует отодвинуть от лезвия ножа, чтобы капля не коснулась ножа. УС на капле затем перенести на сеточку или на стекло.
  

4.13. Замещение воды в замороженном состоянии

  
   Вариант 1. Быстро заморозить объекты с линейными размерами меньше 1 мм. Поместить в 0.5%-ный УА на метаноле (t=-80®С) на 5 ч. Медленно (в течение 5-6 ч) поднять температуру до -35®С и оставить в свежем метаноле на 7 ч. Поместить в смесь Ловикрила К4М с метанолом (2 : 1). Далее - по протоколу 5.2.
   Вариант 2 [268]. Поместить монослой клеток в среду А или Б на 2 сут (t=-90 ® С).
   Среда А: смешать 0.5 мл 70%-ного раствора ГА, 0.5 мл 0.2 М КБ (рН 7.2) и 9.0 мл 100%-ного этанола.
   Среда Б: приготовить на метаноле раствор, содержащий 3% ГА, 1% ЧО, 0.5% УА, для лучшего растворения компонентов можно добавить 3% воды.
   Вариант 3. Поместить объект в среду В (см. ниже) при t=-80®С, поднять температуру до -60®С, а затем до -40®С (держать по 24 ч соответственно). Перенести в ацетон (три смены по 1 ч) (t =0®С). Заключить в аралдит.
   Среда В: 6 мл диметоксипропана; 3 мл ацетона; 2.25 мл мета­нола; 0.75 мл 10%-ного раствора УА на метаноле; 0.6 мл 25%-ного раствора ГА, 0.1 г ЧО.
  

5. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЕ ПРЕПАРИРОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

5.1. Состав смол [109]

   Ловикрил (Lowicryl) К4М: компонент А (отвердитель) - 2.7 г, компонент Б (мономер) - 17.3 г, компонент Г(6) (инициатор -этиловый эфир бензоина) - 0.10 г.
   Ловикрил НМ20: компонент Д (отвердитель) - 2.98 г, компо­нент Е (мономер) - 17.02 г, компонент С (инициатор) - 0.10 г.
   Ловикрил К11М: компонент А (Н) (отвердитель) - 1.0 г, компо­нент Б (I) (мономер) - 19.0 г, компонент В (С) (фотоинициатор -метиловый эфир бензоина) - 0.10 г.
   Ловикрил НМ23: компонент A (F) (отвердитель) - 1.1 г, компо­нент Б (G) (мономер) - 18.9 г, компонент С (фотоинициатор) -0.10 г (если полимеризация проводится при t > -50®С) или I (инициатор - Igracure 651) - 0.10 г (если полимеризация прово­дится при температуре от -50 до -70®С), либо 0.15 г (если поли­меризация идет при t < -70®С).
   ЛР ВАЙТ: 100 мл мономера и 10 капель ускорителя.
   ЛР ГОЛД: 100 мл мономера и 4 мл ускорителя (0.5%-ного бен­зила).
  

5.2. Обезвоживание и заливка в Ловикрил К4М

  
   Вариант 1. Обезводить объект в этаноле: в 30%-ном растворе 30 мин (t=20®С), в 50%-ном растворе 60 мин (t=0®С), в 80%-ном растворе 60 мин (t=-20®С), в 100%-ном этаноле 2 раза по 60 мин (t=-35®С). Пропитать в ЗС К4М, разведенной 100%-ным этанолом: в смеси 1: 1 - 60 мин (t=-35®С), в смеси 3:1-60 мин (t=-35®С). Поместить в чистую ЗС К4М на 60 мин (t=-35®С), в новой ее порции оставить на ночь (t=-35®С), а затем в желатиновых капсулах с такой же ЗС выдержать 6 ч (t=-35®С). Полимеризацию осуществить с помощью УФО (t=-35®С) в течение 24 ч. Ускоритель не добавлять.
   Вариант 2. Обезводить объект в метаноле: в 50%-ном растворе 10-15 мин (t=0®С), в 80%-ном растворе 30-60 мин (температу­ра от -20 до -30®С), в 90%-ном растворе 30-60 мин (температура от -20 до -30®С). Пропитать в ЗС К4М (без инициатора), разве­денной 100%-ным метанолом: в смеси 1: 1 - 30 мин (t=-30®С), в смеси 2 : 1 - 60 мин (t=-30®С). В чистой ЗС К4М (без иници­атора) инкубировать 2 раза по 60 мин (t=-30®С), в новой ее пор­ции оставить на ночь (t=-30®С). В чистой полной (добавить 0.6% метилового эфира бензоила) ЗС К4М в желатиновых капсулах вы­держать 6 ч (t=-30®С). Полимеризацию осуществить с помощью рассеянного УФО (А=360 нм) в течение ночи (t=-30®С). Затем блоки вынуть из холодильной камеры и дополимеризовать с по­мощью УФО в течение 2-3 сут (t=20®С).
  

5.3. Заливка в Ловикрил КИМ

  
   Обезводить объекты в дегидратанте (Д), лучше использовать ме­танол (проводят так, как описано в прописи 5.2, но при t=-60®С). Пропитать в смеси Д и ЗС (в соотношении 1 : 1) в течение 8 ч (t=-60®С), в разведенной среде (2 : 1) - 8 ч (t=-60®С), в не-разведенном заливочном составе - 8 ч (t=-60®С), в новой пор­ции свежего состава для заливки - 8 ч (t=-60®С), в свежем составе для заливки в желатиновых капсулах выдержать 8 ч (t=-60®С). Полимеризацию осуществить с помощью рассеянно­го УФО (Л=360 нм) в течение 72 ч (t=-60®С), а затем 2-3 сут под прямым УФО при комнатной температуре.
  

5.4. Заливка в Ловикрил НМ23

  
   То же самое, что и в прописи 5.3, но обезвоживание и пропи­тывание проводить при t=-80®С, и полимеризацию продолжать 6 сут под рассеянным УФО при t=-70®С, а затем 2-3 сут с по­мощью прямого УФО при комнатной температуре.
  

5.5. Заливка в ЛР ВАЙТ (LR WHITE) [224]

  
   Вариант 1. Объект фиксировать в альдегиде. Промыть в буфе­ре в течение 20 мин. Обезводить в возрастающих концентрациях этанола: в 50%-ном растворе - 2 раза по 30 мин, в 60%-ном раст­воре - 2 раза по 30 мин, в 70%-ном растворе - 2 раза по 30 мин. Пропитать в смеси смолы с 70%-ным этанолом (1 : 1) в течение 1ч, затем в неразбавленной смоле еще 12 ч (можно сменить ее не­сколько раз). Поместить объект в смолу, разлитую в желатиновые капсулы, и полимеризовать (при температуре от 50 до 60®С) в те­чение 24 ч. "Тепловую" полимеризацию лучше проводить в бес­кислородной среде.
   Вариант 2. Химическая полимеризация. После фиксации обез­водить объект в 70%-ном этаноле - 3 раза по 10 мин. Пропитать в смоле - 2 раза по 20 мин (t=4®С). Поместить в желатиновые капсулы с составом для заливки (t=4®С) - реакция экзотермичная (хотя температура редко поднимается выше 50®С), поэтому склянки лучше поставить в ванну с водой для отвода тепла. Дегидратацию можно проводить прямо в нескольких сменах смолы.
   Заливочная смесь: 10 мл смолы 15 мкл инициатора, тщатель­но перемешать непосредственно перед использованием - полиме­ризация завершается через 30 мин.
   Вариант 3. Ускоренная заливка. После ускоренного обезвожи­вания объекты пропитать сначала в смеси состава для заливки и 96%-ного этанола (1: 1) в течение 1 ч, а затем в чистом составе - раза по 20 мин. Полимеризовать при t=75®С в течение 30 мин, а затем при t=85®С еще 30 мин.
  

5.6. Заливка в ЛР ГОЛД (LR GOLD)

   Вариант 1. Обезводить объект в метаноле: в 50%-ном растворе 15 мин (t=0®С), в 70%-ном растворе 45 мин (t=-25®С), в 90%-ном растворе 45 мин (t=-25®С). Пропитать в смеси моно­мера и 100%-ного (можно 90%-ного) метанола: в смеси 1:1-30 мин (t=-25®С), в смеси 7 : 3 - 60 мин (t=-25®С), в 100%-ном мономере - 60 мин (t=-25®С). Поместить объект в смесь мономера, содержащего 0.1% бензила, на ночь (t=-25®С). Поли­меризация осуществляется в этой смеси с помощью голубого све­та от галогеновой лампы при недонакале (напряжение 7-9 В) в тече­ние 20-25 ч (t=-25®С).
   Вариант 2. В процессе обезвоживания в возрастающих концен­трациях метанола, если ткань не была зафиксирована, следует до­бавить во все растворы метанола по 10-20% поливинилпирроли-дона (ПВП; молекулярная масса 44000); обезвоживание осуществ­ляется в растворах метанола с возрастающей концентрацией: в 50%-ном растворе с 20% ПВП - 15 мин (t=0®С), в 70%-ном растворе с 20% ПВП - 45 мин (t=-25®С), в 90%-ном растворе с 20% ПВП - 45 мин (t=-25®С). Пропитывание: а) в смеси (1:1) мономера и метанола с добавлением 10% ПВП в течение 30 мин (t=-25®С), б) в смеси (7 : 3) мономера и метанола с добавлени­ем 10% ПВП - 60 мин (t=-25®С). Поместить объект в 100%-ный мономер на 60 мин (t=-25®С), затем в 100%-ный мономер с добавлением 0.1% бензила на 60 мин (t=-25®С) и, наконец, в свежую порцию такой же смеси мономера и бензила на ночь (t=-25®С). Полимеризация осуществляется в последней порции смеси с помощью голубого света от галогеновой лампы при недо­накале (напряжение 7-9 В) на протяжении 20-25 ч (t=-25®С).
  

5.7. Заливка в гликольметакрилат (ГМА)

  
   Вариант 1. Смешать 7 частей состава из 97% ГМА и 3% воды, 3 части бутилметакрилата и добавить Люперко до концентрации 2%. Небольшое количество смеси наливать в склянку с широким дном так, чтобы слой жидкости не превышал 1 см. Склянку быст­ро нагреть до начала кипения и немедленно охладить в емкости с ледяной водой. При нагревании и охлаждении жидкость необходи­мо перемешивать. Предполимер не должен иметь вязкость более 30 сП (как густой сироп). Если степень предполимеризации недостаточна, то процедуру повторять, до тех пор пока не будет достиг­нута нужная вязкость. Предполимер хранить в морозильной каме­ре и нагревать до комнатной температуры перед использованием.
   Обезводить объекты в смеси ГМА с водой: в смеси 4:1-15 мин, в смеси 37 : 3 - 15 мин. Пропитать в чистом мономере ГМА в течение 20 мин, в предполимере оставить на ночь. Затем предполимер налить в прозрачные желатиновые капсулы, поме­стить туда объекты, оставить капсулы на 30 мин открытыми для удаления пузырьков воздуха, после чего закрыть. Полимеризацию осуществить с помощью УФО при ? < 315 нм, объекты поместить на расстоянии 2.5 см от лампы.
   Вариант 2. Кусочки ткани после дегидратации пропитать в не­скольких сменах состава А (пропитывание длится от 4 до 48 ч). Из состава А кусочки ткани перенести в формы из алюминиевой фольги, залить смесью из 42 частей состава А и 1 части состава Б (полимеризация длится 30-45 мин).
   Состав А: смешать 80 мл 2-этоксиметакрилата, 8 мл 2-бутоксиэтанола и 0.5 г перекиси бензоила.
   Состав Б: смешать 8 мл ПЭГ-400 и 1 мл 1 N,N-диметиланилина.
   Вариант 3. Обезводить объекты в смеси ГМА с водой: в смеси 4 : 1 - 20 мин, в смеси 97 : 3 - 20 мин. Поместить в смесь соста­вов В и Г (1: 1) на 20 мин, а затем в предполимер на 30 мин. За­лить в прозрачные желатиновые капсулы (полиэтиленовые неже­лательны). Полимеризацию осуществить с помощью УФО (?=315 нм, расстояние 10 см) в течение 24-48 ч.
   Состав В: 68.0 г гликольметакрилата, 2.0 г воды.
   Состав Г: 29.0 г п-бутилметакрилата, 1.0 г перекиси бензоина. В и Г смешивать непосредственно перед использованием.
   Предполимер: нагревать смесь составов В и Г (1: 1) на водяной бане, до тех пор пока вязкость смеси не достигнет таковой у жид­кого сиропа (несколько минут при t=80®С), и быстро охладить до t=-4®С.
  

6. УЛЬТРАТОМИРОВАНИЕ

6.1. Материалы, необходимые для изготовления УС

      -- Свежий 5-10%-ный раствор ацетона или этанола на воде (либо профильтрованная вода).
      -- Шприц объёмом 1-2 мл с тонкими, изогнутыми под пря­мым углом инъекционными иглами (или пастеровская пипетка) для заполнения ванночки.
      -- Шприц для удаления раствора из ванночки.
      -- Стаканчик для сливания раствора, удаленного из ванночки.
      -- Пузырек с хлороформом или ксилолом, в пробку которого вставлена стеклянная или деревянная палочка с ватным тампоном на конце.
      -- Ресница для манипуляций с УС, укрепленная на конце дере­вянной палочки с помощью капельки воска или парафина.
      -- Два пинцета с остро заточенными концами (прямыми или изогнутыми).
      -- Чашка Петри с фильтровальной бумагой на дне для разме­щения чистых опорных сеточек.
      -- Вторая чашка Петри, выстланная фильтровальной бумагой, для размещения сеточек с нанесенными на них УС.
      -- Контейнер для хранения сеточек со срезами после оконча­ния резания.
      -- Опорные сеточки как без подложки, так и покрытые под­ложкой.
      -- Металлическая (лучше платиновая) петля для вылавлива­ния ПС.
      -- Обезжиренные предметные стекла для ПС.
      -- Пузырек с адгезивной смесью (см. Приложение, 6.3.1).
      -- Спиртовка.
      -- Воск или парафин для герметизации ванночек.
      -- Глазные ножницы.
      -- Безопасные бритвы для заточки пирамидок и других целей.
      -- Липкая лента для изготовления ванночек или готовые (промышленно изготовленные) ванночки.
      -- Бюкс с узкими полосками фильтровальной бумаги, кото­рыми сушат пинцет и сеточки со срезами.
  

6.2. Изготовление ПС

   Установить подачу в 1-2 мкм (угол резания ножа не должен превышать 6-7®). Подвести нож как можно ближе к блоку. При каждом подъеме и опускании блока производить указанную по­дачу ножа, до тех пор пока не будет получен первый срез. После получения 4-5 ПС снять их либо петлей, либо тонкой кисточкой и перенести в каплю, помещенную на чистое предметное стекло, ко­торое можно покрыть адгезивной смесью (см. Приложение, 6.З.1.). При резании ПС на жидкость налить в ванночку 10%-ный раствор ацетона (уровень жидкости должен быть горизонтальным), а ПС снимать петлей. Высушить ПС с помощью нагревания на горелке (не допускать закипания) или (лучше) в термостате (на термоста­тированном столике). Окрасить ПС (см. Приложение, 6.4-65.), промыть водой и высушить.
  

6.3. Укрепление ПС на стеклах

   Окунуть чистое предметное стекло в адгезивную смесь (см. Приложение, 6.3.1), высушить (t=50®С), нанести ПС на стекло I и снова высушить.
  

6.3.1. Адгезивные смеси

   Вариант 1. Смешать 5 мл 95%-ного этанола, 25 мл ледяной I уксусной кислоты, 70 мл воды и 10.0 г фторида натрия.
   Вариант 2. Раствор альбумина (1 мг/мл), перед использовани-I ем профильтровать.
   Вариант 3. Раствор яичного белка с глицерином [38].
   Вариант 4. Приготовить 1%-ный раствор желатины [38]. Покрыть чистое стекло желатиной при t=50®С. Положить ПС на I стекло. Высушить сначала при t=20®С, затем при t=60®С. Поместить стекло в раствор ФА или ГА на 30 с. Высушить сначала при t=20®С, затем при t=60®С.
   Вариант 5. Приготовить 0.1%-ный (25 мкг/мл) раствор поли-L-лизина (рН 8.5). Каплю раствора полилизина поместить на р стекло, через 5 мин промыть водой и высушить.
  

6.4. Монохромные красители

6.4.1. Одноступенчатые методы окрашивания ПС

  
   На ПС нанести каплю раствора А, Б или В. Окрашивать ПС при t=70®С в течение 10-15 с (если не прокрашиваются, то дольше). Промыть водой в течение 1-2 мин.
   Раствор А: приготовить 0.3%-ный раствор бриллиант-крезил-блау на ФБ (рН 9.1); визуализируются клетки и соединительная ткань.
   Раствор Б: приготовить 1%-ный раствор виктория-блау в 70%-ном этаноле; окрашиваются эластин и ретикулиновые волок­на, липидные включения после осмиевой фиксации приобретают черный цвет.
   Раствор В: приготовить краситель Гимза, разведенный в 10 раз 2%-ным раствором тетрабората натрия; ПС прикрепляют на стек­ла, покрытые желатиной, и окрашивают.
  

6.4.2. Толуидиновый синий (ТС)

   Вариант 1. На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А, отфильтрованного через миллипоровый фильтр, на­греть до температуры 60-70®С и выдержать 1 мин. Интенсивно промыть водой.
   Раствор А: 0.5 г буры (тетрабората натрия) растворить в 50.0 мл воды и добавить 0.5 г ТС.
   Вариант 2. ПС, прикрепленные к стекчу, поместить на 2 ч в раствор Б (t=60®С). Интенсивно промыть водой. Обезводить в возрастающих концентрациях этанола. Поместить в ксилол и за­ключить в Пермаунт.
   Раствор Б: 0.15 г ТС растворить в 50 мл 2.5%-ного раствора Na2CO3, рН 11.0 (готовится ex tempore и фильтруется).
   Вариант 3. На ПС капнуть раствор В. Окрашивать 20 с (t=80®С).
   Раствор В: 1.0 г ТС растворить в 100 мл 0.5%-ного раствора Na2CO3.
   Вариант 4. Каплю раствора Г или Д поместить на ПС, прикле­енный к стеклу, и слегка подогреть (в течение 3-4 с) на спиртовке, не допуская закипания, после чего промыть водой.
   Раствор Г: приготовить 1%-ный раствор ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.0).
   Раствор Д: приготовить 0.1%-ный раствор ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.4-8.5).
  

6.4.3. Метиленовый синий

   На ПС нанести каплю 1%-ного раствора метиленового синего и каплю 1%-ного раствора буры и смешать. Провести несколько раз над пламенем горелки, не допуская закипания жидкости. Если срез перекрашен, его можно дифференцировать в 96%-иом этаноле.

6.4.4. Сафранин

   На ПС нанести каплю раствора А или Б. Окрашивать ПС при t=20®С в течение 30-60 с. Промыть водой в течение 1-2 мин. Дифференцировать в 50%-ном этаноле. Высушить.
   Раствор А: приготовить 1%-ный раствор сафранина-О на 50%-ном этаноле.
   Раствор Б: разбавить в 2 раза водой 1%-ный раствор сафрани­на-О на 96%-ном этаноле.

6.4.5. Окраска гематоксилином

   ПС толщиной 1 мкм обработать несколькими каплями 2.5%-ного раствора железоаммиачных квасцов в течение 5-10 мин (на горячем столике, температура 70-90®С), сполоснуть водопровод­ной водой для удаления избытка протравы и обработать раствором А в течение 2-5 мин на горячем столике, пока срезы не примут вид черных пятен. Затем срезы промыть водой (температура 70-90®С), высушить и заключить в канадский бальзам. При плохом проникновении красителя ПС рекомендуется предварительно об­работать подкисленной перекисью водорода в течение 1-2 мин (температура 25-30®С).
   Раствор А: 0.5 гематоксилина растворить в 10 мл 96%-ного этанола и долить водой до 100 мл.

6.4.6. Метод ШИК

   Прикрепленные к стеклу ПС погрузить на 5 мин в 0.1 М рас­твор NaOH, сполоснуть водой, затем поместить на 15 мин в 1.5%-ный раствор йодной кислоты, вновь сполоснуть водой, после чего инкубировать в реактиве Шиффа [38] 45-60 мин. Промыть водой в течение 30 мин.

6.4.7. Метенамин серебра

   Обработать ПС толщиной 1-2 мкм 1%-ным раствором йодной кислоты в течение 5 мин. После промывания (в течение 15 мин) на срез нанести свежий раствор метенамина серебра (см. Прило­жение, 9.12.1) при t=60®С в темноте, после чего промыть в 5%-ном растворе тиосульфата натрия, затем в воде и этаноле.

6.4.8. Перегревание ПС

   ПС поместить в каплю воды и подсушить. Затем стекла нагре­вать до температуры 250-260®С в течение 15-30 с, необходимо постоянно следить за внешним видом ПС. Срезы приобретают ко­ричневый оттенок, интенсивность которого контролируют про­смотром предметных стекол на белом фоне. Перегрев часто сопро­вождается потерей контрастности.

6.5. Полихромные красители

6.5.1. Трехцветное окрашивание

   Вариант 1. На предметное стекло со срезами налить по 1 мл растворов А-Д, стекло нагреть в течение 4-5 с или дольше на горя­чей плитке или над пламенем (до появления пара). Затем срезы сполоснуть в проточной воде и высушить. На срезы капнуть иммерсионное масло, покрыть покровным стеклом, края которого смазать заливочной смесью эпона.
   Раствор А: смешать 50.0 мл ПЭГ-200, 0.75 мл 0.2 М КОН, 1.7 г основного фуксина и 0.3 г ТС; окрашивать срезы 2-3 мин, за­тем сполоснуть 10%-ным ацетоном.
   Раствор Б: 05 г NaН24, 0.25 г основного фуксина для фуксинсерной кислоты и 0.2 г метиленового синего растворить в 15 мл 0.5%-ного раствора борной кислоты при постоянном поме­шивании, добавить 70 мл воды и 10 мл 0.72%-ного раствора NaOH (рН 6.8); краситель можно хранить несколько месяцев, пе­ред употреблением встряхивать; эпоксидный матрикс не красится, ядра окрашиваются в фиолетовый цвет, митохондрии - в темно-красный, эритроциты - в розовый, коллаген - в ярко-розовый, эластический каркас артерий - в красно-фиолетовый, жировые капли - в бледно-оливковый.
   Раствор В: смешать равные объемы 1%-ного раствора метиле­нового синего и 1%-ного раствора азура II, оба красителя пригото­вить на 1%-ном растворе буры (рН 9.4).
   Раствор Г: приготовить на 0.1 М ФБ (рН 9.1) 0.2%-ный рас­твор азура I с добавлением 2% основного фуксина; окрашивать 2 мин; ядра и нуклеопротеиды цитоплазмы окрашиваются в си­ний цвет, коллаген - в красный, эластические волокна и гранулы базофилов - в пурпурный.
   Раствор Д: приготовить на 1%-ном растворе буры 1%-ный метиленовый синий с добавлением 2% основного фуксина.
   Вариант 2. Протравить ПС в растворе этоксида натрия (см. Приложение, 6.6.5), затем промыть в нескольких сменах воды. Поместить ПС в раствор А на 1-2 мин, промыть в воде. Теперь срезы можно либо высушить и заключить в бальзам, либо окра­сить в теплом (t=50®С) растворе Б в течение 1-5 мин под конт­ролем СМ, после чего промыть в нескольких сменах воды, высушить фильтровальной бумагой, снова промыть, высушить на воздухе и заключить в бальзам. Базофильные элементы окраши­ваются в темно-красный цвет, ацидофильные - в голубой, цитоп­лазма клеток и дендритов - в зеленый, аппарат Гольджи, вещество Ниссля - в темно-сине-зеленый.
   Раствор А: смешать 100 мл 30%-ного раствора этанола, 0.4 г азура-В, 1.0 г малахитового зеленого, 1 мл анилина, 1.0 г фенола кристаллического и профильтровать.
   Раствор Б: приготовить концентрированный (около 4%) рас­твор основного фуксина, профильтровать.
  

6.5.2. Двойное окрашивание ПС

  
   На высушенные срезы нанести каплю раствора А, подогретого до t=65®С. Время окрашивания варьирует в зависимости от тол­щины среза и ЗС. Отмыть ПС водой (2-3 смены), нанести на них каплю раствора Б. Можно окрашивать при комнатной температуре или слегка подогреть. Отмыть водой.
   Раствор А: смешать 0.130 г метиленового синего, 0.02 г азу­ра II, 10 мл глицерина, 10 мл метанола, 30 мл раствора В и 50 мл воды.
   Раствор Б: слить 3 мл раствора Г и 57 мл воды.
   Раствор В: растворить 1.338 Na2НPО4"2Н2О и 0.908 г КН2РО4 в небольшом количестве воды, долить водой до 100 мл (рН 6.9).
   Раствор Г: растворить 0.10 г основного фуксина в 10 мл 50%-ного этанола.
   Растворы А и Б не нуждаются в фильтровании, их можно хра­нить на холоде в течение 4 мес.
   Продолжительность окрашивания ПС растворами А и Б зави­сит от использованной ЗС.
  
   Смола

Раствор А

Раствор Б

   Аралдит

30 мин

30-90 с

   Эпон 812

30-60 мин и более

1-3 мин

   Смесь Эпона и Аралдита

5 мин

1 мин

   Смола Сперра

20 мин

1-5 мин

  
   ПС тоньше 1 мкм требуют больше времени для окрашивания в растворе А и меньше - в растворе Б. ПС, полученные со старых блоков, красятся быстрее, чем срезы из свежеприготовленных бло­ков [70].
   Ядро и ядрышко окрашиваются в темно-синий цвет; цито­плазма - в светло-голубой, гликоген - в красный, секреторные гра­нулы, содержащие мукополисахариды (гликопротеиды), - в цвета от красного до фиолетового, липидные включения - от зеленого до светло-голубого, клетки соединительной ткани - в розовый цвет, эластические волокна - в фиолетовый, коллагеновые волокна - в красный, эритроциты - в сине-зеленый.

6.5.3. Толуидиновый синий и метиленовый синий [253]

   На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А и нагревать при температуре 60-70®С в течение 1-3 мин. Промыть водой. Поместить на срез каплю подкисленной воды на 10 с. За­ключить в смолу.
   Раствор А: 0.5 г буры растворить в 50 мл воды, добавить 0.5 г ТС и 0.1 г метиленового синего (или азура II); раствор стабилен в склянке с закрытой пробкой.

6.5.4. Толуидиновый синий и азур II [253]

   На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А и нагревать при температуре 60-70®С в течение 5 мин. Промыть водой.
   Раствор А: смешать равные объема 1%-ного раствора азура II и 1%-ного раствора ТС; оба красителя приготовить ex tempore на 1%-ном растворе буры.

6.5.5. Толуидиновый синий и пиронин [253]

   На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора В и нагревать при температуре 60-70®С в течение 5 мин. Промыть водой. Обработать в течение нескольких секунд в 100%-ном этано­ле. Высушить.
   Раствор А: в 40 мл воды растворить 0.4 г буры и 0.4 г ТС.
   Раствор Б: в 20 мл воды растворить 0.2 г пиронина.
   Раствор В: смешать ex tempore растворы А и Б (2 : 1).

6.5.6. Толуидиновый синий и основной фуксин [253]

   После окрашивания в 1%-ном раствором ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.0) обработать ПС 2%-ным раствором основного фуксина в тече­ние 1-2 мин. Интенсивно промыть водой. Высушить. Заключить ПС в смолу.

6.5.7. Метиленовый синий и азур II

   Смешать равные объемы 1%-ного раствора азура II и 1%-ного раствора метиленового синего; оба красителя приготовить на 1%-ном растворе буры. Капнуть краситель на ПС и подогреть в тече­ние 5 мин. Промыть водой.

6.6. Смеси для травления ПС

6.6.1. Подкисленный раствор перекиси водорода

   Слить 30 мл воды, 15 мл 30%-ного раствора перекиси водоро­да и 0.18 мл 0.1 М раствора НСl (рН 3.2). Травление осуществля­ется в течение 1-2 мин при температуре 25-30®С.

6.6.2. Раствор йодной кислоты

   Приготовить 1-4%-ный раствор йодной кислоты и обработать им ПС толщиной 1-2 мкм в течение 5 мин.

6.6.3. Раствор таниновой кислоты (ТК)

   Приготовить 1%-ный раствор ТК, после обработки ПС необхо­димо тщательно отмыть водой.

6.6.4. Раствор метоксида натрия

   Растворить 2.0 г металлического натрия в 110 мл метанола, до­бавить 100 мл бензола. Раствор использовать сразу. Травление длится 3 мин. Отмывать ПС в смеси метанола и бензола 5 мин, затем обработать ацетоном в течение 5 мин.

6.6.5. Раствор этоксида натрия

   0.75-1.5 г NaOH растворить в абсолютном этаноле. Травить ПС на стеклах в этом растворе в течение 5-30 с. Промыть сначала в четырех сменах абсолютного этанола, затем в ФБ (рН 7.4) и не­сколько раз в воде.

6.6.6. Обработка парами брома

   Поместить ПС на 30 с в пары над жидким бромом, затем в ксилол на 1 ч с последующим отмыванием в нескольких сменах этанола при нисходящих концентрациях и наконец в воде.
  

7. КРИОУЛЬТРАТОМИЯ

7.1. Напыление стеклянных ножей вольфрамом

   Поместить нож в круговой держатель так, чтобы его нижняя грань находилась под углом 11® к горизонтали, а направление на­пыления соответствовало биссектрисе угла ножа. На высоте 75 мм от основания ножа укрепить испаритель в виде V-образной вольфрамовой проволоки с диаметром 0.5 мм. Между ножами и прово­локой поместить экран. После достижения высокого вакуума (ме­нее 10-2 Па) в течение 60 с прокалить проволоку для испарения окиси вольфрама. Убрать экран и напылять в течение 30 с при то­ке 30 А и напряжении 10 В (толщина получаемого слоя вольфра­ма составляет 2 нм).

7.2. Криоультратомия "сухим" способом

   Заморозить маленькие кусочки ткани и расколоть их в жидком азоте на более мелкие (если это необходимо), зажать в держатель криоультратома. Под слоем жидкого азота в специальном контей­нере перенести держатель в криокамеру и быстро закрепить в зара­нее охлажденной до температуры от -80 до -120®С штанге.
   Подвести предварительно охлажденный до той же температуры нож к образцу до почти полного контакта. Использовать тонкую механическую подачу до тех пор, пока не будет получен первый срез (не толще 1 мкм, в противном случае блок может быть по­врежден). Глубже 5 мкм располагаются кристаллы льда. Начать резание с помощью автоматической подачи со скоростью 1 мм/с.
   Срезы собирают на поверхности сухого ножа. Они полупро­зрачны и могут иметь те же цвета интерференции, что и пластико­вые УС, плавающие на поверхности жидкости, Но по данному при­знаку оценить толщину среза нельзя. С помощью ресницы срез надо перемещать вниз по ножу, чтобы освободить место следую­щему срезу. Лента срезов получается редко. Если возникают про­блемы со статическим электричеством, то надо использовать ионизатор.
   Затем с помощью ресницы срезы переносят на покрытую формваровой пленкой-подложкой сеточку, которая располагается рядом с ножом на охлажденной платформе. Сеточку со срезами помеща­ют на плоскую охлажденную медную поверхность в криокамере. С помощью охлажденного медного блока с плоским полированным основанием диаметром слегка превышающим 3 мм срезы придав­ливают к поверхности сеточки. После чего срезы либо высушива­ют в замороженном состоянии в аппарате для низкотемператур­ной возгонки, либо непосредственно исследуют в ТЭМ с охлажден­ным столиком. Можно сублимировать срезы и в ЭМ.
  

7.2.1. Перенос крио-УС "сухим способом"

  
   Проволочной петлей диаметром 2 мм взять каплю раствора сахарозы. Полузамерзающей каплей сахарозы коснуться крио-УС. Последние прилипают к капле снизу. Капля оттаивает, крио-УС расправляются. Каплей с плавающими внизу крио-УС коснуться сеточки, покрытой формваругольной подложкой, крио-УС при­липнут к сеточке, а капля сахарозы растечется по ее верхней по­верхности. Сеточку перевернуть и поместить на слой застывшего 2%-ного раствора желатины. Затем желатину нагреть (t=37®С), а когда она станет жидкой, разбавить ФБФР (1 : 1). Под сеточку подвести проволочную петлю диаметром 3 мм, с помощью кото­рой сеточку перенести на каплю ФБФР для удаления желатины. Затем крио-УС заключить в метилцеллюлозу, избыток которой удалить фильтровальной бумагой [163].
  

7.2.2. Метод "сухой нож - влажный перенос"

  
   Фиксатор отмыть изоосмотическим буфером. Погрузить сре­зы или небольшие кусочки в 2.1-2.3 М сахарозу (или 1.8 М саха­розу, содержащую 15-20% поливинилпирролидона) на ФБФР на 15-60 мин. Время пропитывания зависит от типа ткани.
   Поместить кусочек на медный металлический держатель. Же­лательно изменить форму кусочка таким образом, чтобы он в наи­большей степени контактировал с держателем. Быстро заморозить объект. Хранить объекты под жидким азотом. Затем перенести их в криокамеру микротома. Получить срезы. Собрать их с помощью ресницы в группы. Подобрать срезы с помощью платиновой петли с каплей сахарозы на конце. Вынести каплю со срезами из крио-камеры. Если она замерзла, то надо дать ей оттаять. При этом кап­ля из молочно-белой становится прозрачной. Нижней поверхно­стью капли со срезами на ней коснуться сеточки, покрытой форм-варовой или угольной пленкой-подложкой так, чтобы срезы были перенесены на сеточку.
   Немедленно, не допуская высыхания срезов, взять сеточку и поместить ее плавать срезами вниз на каплю ФБФР, содержащего 1% БСА и 2% желатины. Отконтрастировать срезы. Если конт­растирование не требуется, то сеточку перенести на воду (4 смены) для удаления ФБ.
  

8. КОНТРАСТИРОВАНИЕ

8.1. Приготовление воды, свободной от СО2

   Проавтоклавировать бутылку с бидистиллированной водой и запечатать в автоклаве или прокипятить 10 мин и закрыть, не охлаждая. При открывании возникает характерный звук входящего воздуха. Вода очень быстро поглощает СО2, поэтому ее можно использовать лишь первые 10-15 мин после открывания. Затем ее вновь нагревают, запечатывают и охлаждают до комнатной температуры.

8.2. Контрастирование кусочков с помощью УА перед обезвоживанием

   Вариант 1 [135]. После постфиксации в 1.5%-ном растворе 40 на коллидиновом буфере (см. Приложение, 2.2.5) промыть объек­ты в трех сменах 0.05 М натрий-малеатного (см. Приложение, 2.2.8) буфера (рН 5.2) и поместить их на 2 ч в 2%-ный водный раствор УА. Промыть объекты в трех сменах 0.05 М натрий-мале­атного буфера (рН 5.2), обезводить и подготовить для ТЭМ.
   Вариант 2. После постфиксации промыть кусочки 3 раза по 15 мин в 0.05 М натрий-малеатном буфере (см. Приложение, 2.2.8). Контрастировать свежеприготовленным 0,5-2.0%-ным рас­твором УА на натрий-малеатном буфере в течение 2 ч (t=4®С).
   Вариант 3. После постфиксации и промывания контрастиро­вать кусочки соответствующим раствором (см. Приложение, 8.2.1) в течение 2 ч (t=50®С).
  

8.2.1. Контрастирующие растворы [253]

   Раствор А: 7.5%-ный раствор уранил-магнезиумацетата на трижды дистиллированной воде.
   Раствор Б: 1%-ный раствор УА (в темноте раствор стабилен в течение недели); обработка длится 5-60 мин.
   Раствор В: 1%-ный раствор УА на вероналацетатном (см. Приложение, 2.2.10) буфере (рН 3.9-6.0). Обработка длится 2 ч.
   Раствор Г: 1%-ный раствор УА на 0.05 М натрий-малеатном буфере (рН 4.6).
   Раствор Д: 1%-ный раствор УА на ацетатном буфере (рН 5).
   Раствор Е: к 100 мл натрий-малеатного буфера (рН 6.0) доба­вить 0.5 г УА (рН снизится до 5.2) или 2.0 г УА (рН снизится до 4.2). Если рН превысит 6.0, то произойдет преципитация.
   Раствор Ж: 4%-ный раствор УА; контрастирование длится 60 мин.
  

8.3. Контрастирование с помощью. УА в процессе обезвоживания

   Вариант 1. В схеме обезвоживания (см. Приложение, 3.1) вме­сто 70%-ного этанола использовать 1-5%-ный раствор УА на 70%-ном этаноле (см. Приложение, 8.3.1), оставить объекты в растворе на ночь. Далее - по схеме.
   Вариант 2. В схеме обезвоживания (см. Приложение, 3.1) по­сле 100%-ного этанола провести обработку смесью абсолютных ацетона и этанола (1 : 1) в течение 10 мин, а затем 1-2%-ным рас­твором УА, приготовленным на этой смеси (1 ч), и вновь чистой смесью ацетона и этанола - 3 раза по 15 мин.
  

8.3.1. Спиртовой раствор УА

   К 5.0 г УА сначала добавить 50 мл 70%-ного этанола, а затем 50 мл 100%-ного этанола. Долить свежепрокипяченную и охлаж­денную воду. Обработать раствор ультразвуком. Добавить 10 ка­пель 100%-ной уксусной кислоты. Хранить в темноте. Раствор ста­билен в течение 6 мес.
  

8.4. Контрастирование объектов в заполимеризованном блоке

   Поместить залитый в смолу блок в 2%-ный раствор УА на 95%-ном этаноле. Плотно закрыть контейнер и поставить в тер­мостат (t=60®С) на 12-24 ч. Промыть блок в нескольких сме­нах 96%-ного этанола. Высушить и приготовить УС. Окрасить их с помощью ЦС.

8.5. Контрастирование УС

8.5.1. Контрастирование с помощью ЦС

   Контрастирование УС производится путем помещения сеточек на каплю раствора ЦС на время от 30 с до 15 мин. Отмыть в трех сменах воды. Раствор ЦС может храниться в холодильнике не­сколько месяцев. Для уменьшения грязи основной раствор можно центрифугировать. Раствор ЦС фильтровать нельзя.

8.5.2. Свинцовые смеси для контрастирования

8.5.2.1. Приготовление цитрата свинца (ЦС)

   Вариант 1. Взять чистую титровальную колбу-пикнометр объ­емом 50 мл. Тщательно смешать в нем 1.33 г нитрата свинца, 1.76 г цитрата натрия и 30 мл свободной от СОг бидистиллиро-ванной воды (см. Приложение, 8.1) - образуется мелкая молочная взвесь без наличия крупных частичек (если есть крупные частицы, то надо продолжать встряхивание). Добавить 5-7 мл 1 М раствора NaOH, свежеприготовленного на бидистиллированной воде, сво­бодной от СО2, и размешать - молочный раствор должен стать прозрачным. Если раствор остался мутным, то добавить еще не­сколько капель NaOH щелочи (объем щелочи не должен превы­шать 8 мл, если раствор опять не просветляется, то приготовление повторить); рН должен быть 12.0 Ђ 0.1 (при смещении рН крася­щие свойства падают). Если рН слишком низок, то надо еще до­бавить раствора щелочи, а если слишком высок, то необходимо уменьшить объем добавляемого к суспензии раствора щелочи (нельзя изменять рН с помощью кислоты, поскольку начинается образование осадка). После измерения рН долить бидистиллиро-ванную воду без СО2 до объема 50 мл.
   Вариант 2. В 10 мл бидистиллированной воды растворить 0.01-0.04 г ЦС. Добавить 0.1 мл 10 М NaOH, пробирку закрыть и тщательно встряхивать, до тех пор пока ЦС не растворится. От-центрифугировать.
   Вариант 3. В 50 мл автоклавированной, свободной от СО2 во­ды растворить 0.1-0.2 г NaOH. Добавить 0.25 г ЦС и встряхивать пробирку до тех пор, пока ЦС не растворится. Раствор хранится долго, но нуждается в центрифугировании перед использованием.

8.5.2.2. Сложный свинцовый контрастер

   Вариант 1. В 41 мл воды, свободной от СО2, растворить при сильном встряхивании 0.2 г безводного ЦС, 0.15 г нитрата свинца, 0.15 г ацетата свинца, 1.0 г цитрата натрия. Добавить 9 мл 4%-ного NaOH - раствор должен стать прозрачным. Хранить при t=4®С в течение 2 лет. Время контрастирования 2 мин. Раствор проника­ет в УС на глубину 1.2 мкм, он стабилен, свободен от загрязнений.
   Вариант 2. Растворить в 82 мл свежепрокипяченной бидистил­лированной воды 1.0 г нитрата свинца, 1.0 г цитрата свинца, 1.0 г ацетата свинца, 2.0 г цитрата натрия. Сильно взболтать или облу­чить ультразвуком до получения молокообразной консистенции. Добавить 18 мл свежеприготовленного 1 М раствора NaOH, силь­но взболтать - раствор должен стать прозрачным. Если просветле­ния не происходит, то обработать раствор ультразвуком. Раствор созревает в течение ночи (t=20®С). Он стабилен на протяжении 6 мес, если нет осадка. Раствор брать из верхней части колбы.

8.5.2.3. Хранение раствора ЦС

   Набрать готовый раствор в 30-миллилитровый шприц с миллипоровым фильтром. В полиэтиленовый пузырек налить немно­го жидкого азота, который начинает интенсивно испаряться. За­крыть пузырек пробкой с иглой. После испарения азота вставить шприц в эту иглу и ввести раствор в пузырек. Вынуть иглу из пробки. Перед взятием раствора ЦС с помощью шприца в пузы­рек вводят небольшое количество газообразного азота, а затем бе­рут нужное количество раствора. Желательно пользоваться иглой, позолоченной в растворе золотохлористоводородной кислоты или посеребренной в растворе азотнокислого серебра.

8.5.3. Контрастирование УС с помощью УА

   Вариант 1. Погрузить (полностью) сеточку с УС в насыщен­ный раствор УА на 70%-ном метаноле (t=37®С) на 1 ч. Отмыть 2-3 раза в воде (медленно).
   Вариант 2. Поместить сеточку в каплю супернатанта раствора А в закрытой банке на 5-30 мин. Промыть 2 раза в 100%-ном ме­таноле, 2 раза в 50%-ном метаноле, 2 раза в воде.
   Раствор А: приготовить 40%-ный раствор УА на метаноле, рас­творить при постоянном помешивании, хранить в холодильнике.
   Вариант 3. Поместить сеточку в насыщенный раствор УА (рас­твор Б) на безводном метаноле на время от 10-15 до 60 мин. Промыть в двух сменах абсолютного метанола и в двух сменах 50%-ного метанола, а затем в двух сменах воды.
   Раствор Б: насыпать избыток УА в абсолютный метанол (45 г на 100 мл), перемешать; для контрастирования брать супернатант и фильтровать.
  

8.5.4. Контрастирование с помощью ТК [354]

   Окрасить УС на капле 8%-ного водного раствора УА в течение 15 мин. Промыть 3 раза на большой капле воды. Перенести УС на каплю 2%-ного раствора ТК на 10 мин. Промокнуть сеточки фильтровальной бумагой и промыть на трех каплях 1%-ного рас­твора сульфата натрия. Отмыть водой.

8.5.5. Контрастирование акриловых УС после иммуномечения

   Вариант 1. Сеточки с УС помещают на поверхность лежащих на парафильме (парафине) капель соответствующих растворов (см. ниже), объем капель порядка 250 мкл.
   После иммуномечения сеточки с УС трижды промыть в воде. Обработать в 2%-ном растворе УА на 0.15 М щавелевой кислоте (рН довести до 7.0 с помощью 5%-ного раствора NH4OH) в тече­ние 10 мин. Трижды промыть в воде. Обработать 2-4%-ным вод­ным раствором УА в течение 10 мин. Быстро обработать последо­вательно в трех каплях 1.5%-ного раствора метилцеллюлозы. С помощью проволочной петли взять сеточку с последней капли ме­тилцеллюлозы и осторожно удалить избыток жидкости фильтро­вальной бумагой.
   Вариант 2 [141]. После иммуномечения высушить сеточки с УС и поместить на поверхность капли 1%-ного водного раствора УА на 10 мин. Промыть в воде. Затем обработать сеточки на кап­ле раствора ЦС в течение 10 мин. Тщательно промыть. Выдержать УС в парах ЧО в течение 1 ч.

8.5.6. Контрастирование крио-УС

   Крио-УС стабилизируют, контрастируя 10 мин в крупной кап­ле раствора А, промывают в 4-6 крупных каплях воды и переносят на каплю раствора Б на 10 мин. Для этой же цели можно исполь­зовать другую смесь: 0.005-0.1%-ный раствор кислого УА, содер­жащий 1.8% ПЭГ-1540 и 0.2% метилцеллюлозы.
   Раствор Л: смешать равные объемы 4%-ного раствора УА л 0.3 М раствора оксалата калия. рН довести до 7.0-7.4 путем добав­ления небольших объемов 10%-ного раствора гидрохлорида аммо­ния.
   Раствор Б: приготовить 2%-ный раствор метилцеллюлозы пу­тем растворения порошка в воде при t=95®С; затем немедленно поставить его на лед и перемешивать при t=-4®С в течение 24 ч; раствор может храниться при этой температуре по крайней мере еще в течение 3 сут. Его центрифугируют при 55 тыс. g в центри­фуге Бекмана в течение 1 ч. Пробирки хранят в холодильнике без перемешивания осадка. Небольшое количество этого раствора бе­рут перед самым использованием и смешивают с раствором А так, чтобы конечная концентрация УА была 0.1-0.4% (в соотношении 4 : 1 или 16 : 1).
  

8.6. Негативное контрастирование (НК)

8.6.1. Контрастирование взвесей

   Вариант 1. Суспензировать объект в 1-2%-ном растворе фосфор-но-вольфрамовой кислоты (ФВК) (рН доводится до 72-7.4 при по­мощи NaOH или КОН) и нанести суспензию на подложку (распы­ление, флотация, капля).
   Вариант 2. Поместить каплю взвеси (5-10 мкл) объекта на подложку ЭМ-сеточки на 5-30 с. Коснуться края капли краем фильтровальной бумаги - должен остаться тонкий слой взвеси. Поместить каплю контрастера (10 мкл) на сеточку на 5-30 с. Ак­куратно промокнуть концом фильтровальной бумаги. Высушить.
   Вариант 3. Нанести каплю (10 мкл) водной взвеси объекта и большую каплю (20 мкл) раствора контрастера на парафильм. Коснуться ЭМ-сеточкой с подложкой первой капли и выдержать 5-30 с. Аккуратно промокнуть, прикоснувшись краем сеточки к листу фильтровальной бумаги. Коснуться капли красителя и вы­ждать 5-30 мин. Аккуратно промокнуть. Высушить.

8.6.2. Контрастеры для НК

   Раствор А: приготовить 0.5-2.0%-ный раствор уранилформиата, рН довести до 4.5-5.2 с помощью 0.1 М гидрохлорида аммо­ния.
   Раствор Б: смешать равные объемы 0.012 М уранилоксалата и 0.012 М щавелевой кислоты, рН довести до 6.5-6.8 с помощью 0.1 М аммония гидрохлорида или концентрированного раствора аммиака.
   Раствор В: растворить в 100 мл воды 0.5 г УА и 0.15 г щавеле­вой кислоты.

9. ГИСТОХИМИЯ

9.1. Выявление фосфатаз свинцовым методом

   Приготовить вибратомные срезы. Обработать в инкубацион­ной среде в течение 30 мин. Промыть буфером 3 раза по 90 с. Промыть срезы (кусочки) в 0.1 М КБ (рН 7.4) с добавлением 4% сахарозы - 3 раза по 5 мин. Обезводить. Подготовить для ТЭМ.
   Контроль: 1) исключить глицерофосфат; 2) добавить в раствор 2 ммоль/л фторида натрия; 3) добавить 10 ммоль/л тартрата на­трия.

9.1.1. Инкубационные среды (ИС) [253] ИС на кислую фосфатазу.

   Состав 1: приготовить раствор, содержащий 3.0 ммоль/л бета-глицерофосфата, 45.5 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0), 10 ммоль/л нитрата свинца и 7.3% сахарозы.
   Состав 2: приготовить раствор, содержащий 3.6 ммоль/л нитрата свинца, 13.9 ммоль/л бета-глицерофосфата натрия, 50 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0)
   Состав 3: растворить 750 мг бета-глицерофосфата в 12.5 мл 0.1 М ацетатного буфера, довести рН до 5.0 с помощью 2 М НСl и довести объем раствора до 25 мл; добавить этот раствор при по­стоянном помешивании к 225 мл раствора, содержащего 300 мг нитрата свинца в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.0).
   ИС на щелочную фосфатазу. Приготовить раствор, содержа­щий 20 ммоль/л бета-глицерофосфата, 28 ммоль/л Трис-НСl (см. Приложение, 2.2.6) буфера (рН 9.4), 3.8 ммоль/л MgSO4, 2.0 ммоль/л цитрата свинца, 8.0% сахарозы.
   ИС на глюкозо-6-фосфатазу. Приготовить раствор, содержа­щий 1.5 ммоль/л глюкозо-6-фосфата, 80 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 6.7), 3.6 ммоль/л нитрата свинца, 6.0% сахарозы.

9.2. Выявление активности ферментов цериевым методом [119]

   Поместить объекты (вибратомные, криостатные среды или ма­ленькие кусочки) в инкубационную среду (ИС) без субстрата на 1 ч (t=37®С или 4®С - при использовании нефиксированных тканей). Обработать объекты в ИС (см. Приложение, 9.2.1) в тече­ние 30 мин (t=37®С). Оставить объекты в 6.8%-ном растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 6.0) на ночь. Обезводить, подготовить для ТЭМ.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить в среду 2 ммоль/л фторида натрия или 10 ммоль/л тартрата натрия (кис­лая фосфатаза); 3) преинкубировать в присутствии 5 ммоль/л левамизола (щелочная фосфатаза); 4) преинкубировать и инкуби­ровать в присутствии 5 ммоль/л левамизола (5'-нуклеотидаза); 5) преинкубировать и инкубировать в присутствии 1 ммоль/л пентоксида ваннадия (АТФаза и АДФаза).

9.2.1. Инкубационные среды [119]

   Все ИС готовят на свободной от СО2 воде.
   ИС на кислую фосфатазу. Приготовить раствор, содержащий 2 ммоль/л хлорида церия, 1 ммоль/л бета-глицерофосфата на­трия, 100 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0).
   ИС на щелочную фосфатазу [198]. Приготовить раствор, содер­жащий 14 ммоль/л хлорида церия, 11 ммоль/л цитрата натрия, 4 ммоль/л хлорида магния, 10 ммоль/л пара-нитрофенилфосфа­та, 100 ммоль/л глицин-NaOH буфера (рН 9.3).
   Для этого добавить к 6 мл 0.3 М глицин-NaOH буфера (рН 9.3) 1 мл 0.11 М раствора цитрата натрия, 1 мл 0.04 М раствора хлорида магния, 1 мл 0.1 М раствора паранитрофенилфосфата, 1 мл 0.14 М раствора хлорида церия. Отрегулировать рН с помощью 1 М раствора NaOH. Перемешивать или слегка нагревать, до тех пор пока раствор не станет прозрачным.
   ИС на 5'-нуклеотидазу. Приготовить раствор, содержащий 1 ммоль/л хлорида церия, 5 ммоль/л нитрата магния, 1.3 ммоль/л аденозинмонофосфата, 70 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 7.2).
   ИС для нуклеотидаз ди- и трифосфатаз. Приготовить раствор, содержащий 1 ммоль/л хлорида церия, 5 ммоль/л нитрата маг­ния, 2.3 ммоль/л субстрата (АТФ, АДФ, УТФ, УДФ, ИТФ, ГТФ, ГДФ), 70 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 7.2).
   ИС для глюкозо-6-фосфатазы. Приготовить раствор, содер­жащий 1 ммоль/л хлорида церия, 2 ммоль/л глюкозо-6-фос-фатдинатриевой соли, 80 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 6.5).
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить 100 ммоль/л цитрата или 1 ммоль/л диэтилпирокарбоната.
   ИС для оксидаз. Приготовить раствор, содержащий 3 ммоль/л хлорида церия, 100 ммоль/л азида натрия, 100 ммоль/л ПИПЕС-буфера (рН 7.8), 0.1-50 ммоль/л субстрата.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) пропускать азот через ИС; 3) добавить в ИС 0.01% каталазы; 4) добавить в ИС ммоль/л цианида калия (для НАД(Ф)Н-оксидазы результат не меняется); 5) добавить в ИС 100 ммоль/л 0,Ь-бета-гидроксибути-рата (для оксидазы D-аминокислот), 1 ммоль/л п-аргинина или ммоль/л 2-фенетилгидразинсульфата (для моноаминооксидазы), 2 ммоль/л 2,6,8-трихлорпурина (для уратоксидазы), 1 ммоль/л аллопуринола (для ксантиноксидазы), замена L-лейцина на L-ли-зин или L-серин (для оксидазы L-аминокислот).
   Субстраты: ввести в инкубационную среду 0S ммоль/л НАДН или НАДФН (для НАД(Ф)Н оксидазы), 10 ммоль/л D-пролина (для оксидазы D-аминокислот), 10 ммоль/л L-лейцина (для окси­дазы L-аминокислот), 13 ммоль/л глюконата (для глюконатокси-дазы), 2.5 ммоль/л гидрохлорида триптамина (для моноаминоок­сидазы), 10 ммоль/л оксалата (для полиаминоксидазы), 0.1 ммоль/л гипоксантина (для ксантиноксидазы).
   ИС для арилсульфатазы. Приготовить раствор, содержащий 26 ммоль/л паранитрокатехолсульфата, 96 ммоль/л хлорида ба­рия, 60 ммоль/л ацетатного буфера (рН 55).
   Особенности проведения реакции (см. Приложение, 9.2): инку­бировать в ИС без субстрата в течение 20 мин (t=20®С), а затем в ИС с субстратом в течение 20 мин (t=37®С).
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить 10 ммоль/л азида натрия.

9.3. Выявление цитохромоксидазы

   Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.05 М ФБ (рН 7.2) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подгото­вить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 0.05 М ФБ (рН 7.2) 25 ммоль/л ДАБ и 0.15% цитохрома С.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (10 мин) в 0.005 М цианиде калия, в 0.005 М азиде натрия или добавить их к ИС.

9.4. Выявление каталазы [119]

   Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.1 М глицин-NaOH буфере (рН 10.5) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подготовить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 0.1 М глицин-NaOH буфере (рН 10.5) 0.15% перекиси водорода и 5 ммоль/л ДАБ.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (10 мин) в присутствии 0.1 М азида или 0.05 М 3-амино-1,2,4-триазоля, либо добавить их к ИС.
  

9.5. Выявление пероксидазы [119]

   Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.1 М КБ (рН 6.5) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подгото­вить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 0.1 М КБ (рН 6.5) 0.02% перекиси водорода и 2.5 ммоль/л ДАБ.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (20 мин) в 0.15%-ном растворе перекиси водорода.
  

9.6. Выявление глюкозо-6-фосфатдепвдрогеназы

   После короткой фиксации в ФА (или без нее) инкубировать в ИС в течение 60 мин (t=37®С). Промыть в 0.22 М растворе са­харозы на 0.1 М ФБ (рН 5.3). Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 5.3) -1ч. Усилить реакцию путем обработки в растворе А в течение 20 мин. Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО - 90 мин (t= 4®С). Под­готовить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 0.1 М ФБ (рН 7.2) 18% поливинилового спирта (18.0 г спирта растворить в 100 мл буфера при температуре 80-90®С, интенсивно помешивая, пока раствор не станет прозрач­ным), 10 ммоль/л глюкозо-6-фосфата, 0.8 ммоль/л НАДФ, 4 ммоль/л хлорид магния, 5 ммоль/л азида натрия, 10 ммоль/л цитрата натрия, 1.5 ммоль/л сульфата меди. Растворять в указан­ном порядке, интенсивно перемешивая, отрегулировать рН, а за­тем добавить 0.5 ммоль/л феррицианида калия и 0.32 ммоль/л 1-метоксифеназинметосульфата.
   Раствор А: растворить в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.6) 1.5 ммоль/л ДАБ.
   Контроль: 1) исключить субстрат (глюкозо-6-фосфат или НАДФ); 2) включить в ИС 10 ммоль/л глюкоамин-6-фосфата.

9.7. Выявление холинэетеразы

   Вариант 1. Инкубировать в ИС в течение 20 мин (t=37®С). Промыть в 0.22 М сахарозе на 0.1 М ФБ (рН 7.2). Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) -1ч. Усилить реакцию путем обработки в растворе А в течение 20 мин. Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в тече­ние 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 2.5 мл воды 12.5 мг ацетилхолина, добавить 15.8 мл 0.82%-ного раствора ацетата натрия, 0.5 мл 0.6%-ного раствора уксусной кислоты, 1.5 мл 2.94%-ного раствора цитрата натрия, 2.5 мл 0.75%-ного раствора сульфата меди, 2.5 мл 0.165%-ного раствора феррицианида калия, перемешать. Раствор должен быть зеленым (рН 55).
   Раствор А: растворить в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.6) 1.5 ммоль/л ДАБ.
   Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить в ИС 0.01 ммоль/л эзерина или 0.01 ммоль/л диизопропилфторфосфа-та (растворять в диметилформамиде).
   Вариант 2. Инкубировать в ИС в течение 15-60 мин (t=37®С). Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
   ИС: растворить в 300 мкл диметилформамида 3 мг индоксил-ацетата и добавить к 10 мл 0.03 М Na-фосфатцитратного буфера (рН 6.0) (см. Приложение, 2.2.13), долить 600 мкл раствора пара-розанилина (см. Приложение, 9.8.1).
   Контроль: 1) исключить субстрат (ичдоксилацетат); 2) вклю­чить в ИС 40 ммоль/л фторида натрия, 0.5 ммоль/л диизопро-пилфторфосфата или 0.1 ммоль/л парахлормеркурийбензоата.
  

9.8. Выявление дипептидилпептидаз

   Инкубировать в ИС в течение 60 мин (t=37®С). Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО на ФБ (рН 7.8-8.0) в течение 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
   ИС: добавить к 1 мл 0.1 М КБ (рН 5.5) 60 мкл парарозанилина (см. Приложение, 9.8.1). Растворить 1 мг синтетического пептида ЛизПро-МНА в 10 мкл диметилформамида и добавить к ИС.
   Контроль: исключить субстрат.

9.8.1. Приготовление гексазотированного парарозанилина

   Растворить 800 мг парарозанилина и 2 мл концентрированной НСl в 8 мл воды. Перемешивать 2-3 ч, профильтровать. Раствор стабилен в темноте 2-4 недели (t=4®С). Перед самой инкуба­цией смешать раствор парарозанилина с 8%-ным раствором нит­рита натрия (1 : 1). Добавить 60 мкл полученного раствора к 1 мл инкубационной среды.

9.9. Окрашивание купролиновым голубым (Cuprolinic Blue)

   Фиксировать в течение ночи 3%-ным раствором ГА на 0.25 М натрий-ацетатном буфере (рН 5.6) с добавлением 2.5% купроли-нового голубого и 0.2% MgCte. Промыть тем же буферным без красителя 3 раза по 10 мин. Обработать 1%-ным раствором воль-фрамата натрия 3 раза по 10 мин. Обезводить в этаноле (30%- и 50%-ный этанол с добавлением 1% вольфрамата натрия). Подго­товить для ТЭМ.
  

9.10. Окрашивание рутениевым красным (РК)

   Вариант 1. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.2) в течение 24 ч. Промыть в 0.1 М растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Фиксировать в растворе А в течение 3 ч. Отмыть в 0.1 М растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 7.2) в те­чение 1 мин. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ (контр­астирование УС с помощью ЦС в течение 3 мин).
   Раствор А: слить 1 мл 2%-ного раствора ЧО на КБ (рН 7.2) и 1 мл 0.25%-ного раствора РК.
   Вариант 2 [253]. Фиксировать в 1.2%-ном растворе ГА с добав­лением 0.075% РК на 0.07 М КБ (смешать равные части 0.2 М КБ, рН 7.4, 3.6%-ного раствора ГА и 0.15%-ного раствора РК) в те­чение 1 ч. Промыть в растворе, состоящем из равных частей 0.2 М КБ и 0.15%-ного раствора РК, в течение 10 мин. Постфик­сировать в 1.3%-ном растворе ЧО с добавлением 0.075% РК на 0.07 М КБ (смешать равные части 4%-ного раствора ЧО, 0.15%-ного раствора РК и 0.2 М КБ, рН 7.4) в течение 3 ч. Быстро обез­водить и подготовить для ТЭМ.
   Вариант 3. Фиксировать 2-3%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.4), содержащем 1 мг/мл РК, - до 4 ч. Промыть КБ - 3 раза по 10 мин. Постфиксировать раствором А в течение 2 ч. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ.
   Раствор A: 7.5 мг РК растереть в ступке и растворить в 3 мл 0.4 М КБ (рН 7.5), добавить 4.5 мл 2%-ного раствора ЧО; раствор очень быстро портится, поэтому в процессе обработки его надо сменить несколько раз.

9.11. Выявление анионных сайтов

   Вариант 1. Фиксировать в ГА. Изготовить вибратомные срезы. Промыть в 0.1 М КБ (рН 7.4) 4 раза по 2 мин. Инкубировать в 0.05%-ном растворе РК на 0.1 М КБ (рН 7.4) в течение 30 мин. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ.
   Вариант 2. Обработать 1%-ным раствором Тритона Х-100 с добавлением 1% РК на буфере Мак-Ильвейна (см. Приложение, 2.2.13) (рН 5.6) в течение 1 ч. Префиксировать 5%-ным раствором ГА с добавлением 1% РК на том же буфере в течение ночи. Обра­ботать 1%-ным раствором РК на том же буфере (рН 5.6) 4 раза по 5 мин. Постфиксировать 1%-ным раствором ЧО, содержащим 0.75% РК, на том же буфере (рН 5.6) в течение 1 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
  

9.12. Окрашивание базальных мембран, коллагеновых волокон и гликогена на УС [249]

  
   УС (на никелевых или золотых сеточках) инкубировать в 25%-ном растворе аммиака в течение 10 мин. Промыть в воде. Инкуби­ровать в 1%-ном растворе йодной кислоты - 20 мин. Промыть в воде. Инкубировать в 1%-ном растворе тиокарбазида - 1 мин. По­сле промывания в воде инкубировать в 25%-ном растворе амми­ака - 5 мин. Промыть в воде. Инкубировать в растворе метенамина серебра (температура 50-55®С) - 50 мин. Промыть в воде, подго­товить для ТЭМ.
  

9.12.1. Раствор метенамина серебра

  
   К 50 мл 3%-ного раствора метенамина добавить 5 мл 2%-ного раствора желатины (тщательно перемешать), ввести 5 мл 5%-ного раствора AgN03 (по каплям, постоянно помешивая), долить водой до 95 мл, добавить 5-6 мл 5%-ного раствора тетрабората натрия и смешать. Готовить ex tempore, держать в темноте.
  

9.13. Выявление элементов эндоплазматической сети [95]

  
   Фиксировать в растворе А - 20 мин. Быстро промыть в 0.1 М вероналацетатном буфере (рН 7.0). Дофикеировать в растворе А (г=4®С) - 2 ч. Промыть водой 3 раза по 5 мин. Импрегнировать в 1%-ном растворе ЧО (t=37®С, объем раствора должен быть значительно больше объема кусочков) - 3-5 сут (раствор менять каждые 12 ч). Промыть водой. Обезводить и заключить в эпоксид­ную смолу.
   Раствор А: слить 32.7 мл 0.1 М веронала натрия, 30.7 мл 0.1 М соляной кислоты, 13.5 мл 0.1 М цитрата натрия, 13-5 мл 0.1 М хлорида кальция или никеля, 10.0 мл 25%-ного раствора ГА.

9.14. Выявление аргентаффинных клеток и биогенных аминов

   Фиксировать (лучше перфузией) в растворе, содержащем 1% ГА и 0.4% ФА и приготовленном на 0.2 М хроматном буфере (рН 7.2) (см. Приложение, 2.2.14.) в течение 5-10 мин (t=4®С). Промыть в том же буфере (рН 6.0) - 18 ч (t=4®С, помешивать). Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО на том же буфере (рН 7.2) - 1 ч (t=4®С). Контрастировать УА в блоках. Подгото­вить для ТЭМ. УС контрастировать ЦС.
  

10. АВТОРАДИОГРАФИЯ

10.1. ЭМ-АРГУС

      -- Ввести внутрибрюшинно специфичный и высокоактивный индикатор так, чтобы доза его составляла 10 мкКи на 1 г массы тела. Всю дозу лучше вводить в виде концентрированного раство­ра (обычно содержащего небольшой процент этанола), чтобы из­бежать повышения давления в брюшной полости вследствие вве­дения большого объема жидкости. Контрольным животным вво­дят такой же объем физиологического раствора с такой же концентрацией этанола. Разведение меченого вещества производят обычно стерильным физраствором.
      -- Забить животное через определенный промежуток времени, продолжительность которого зависит от особенностей материала, подлежащего исследованию. Обычно для изучения репликативной активности достаточно 1 ч.
      -- Фиксировать объект в ГА, ФА или ЧО. ЧО может ускорить исчезновение скрытого изображения. ГА и ФА могут снизить чувствительность фотоэмульсии. После фиксации в альдегиде ре­комендуется промывать в холодном буферном растворе в течение 1-2 сут перед постфиксацией в ЧО, однако при этом могут вымы­ваться и меченые продукты метаболизма.
      -- Ткань обезводить и заключить в заливочную среду. После полимеризации время хранения материала уже не имеет сущест­венного значения, поскольку период полураспада трития достаточ­но велик.
      -- Приготовить ПС и проверить на них уровень включения изотопа в объект, для чего покрыть ПС фотоэмульсией, экспони­ровать в течение 4 сут и проявить (см. Приложение, 10.2). Если автографов нет, то нет смысла работать и с УС.
      -- Приготовить УС. УС лучше снимать на золотые, позолочен­ные или палладированные опорные сеточки.
      -- УС контрастировать с помощью УА и ЦС, а затем покрыть слоем углерода толщиной 20 нм для предохранения эмульсии от вуалирования в результате действия на нее красителей.
      -- Стекла с прикрепленными сеточками быстро погрузить в
    эмульсию, в течение 30 с высушить в вертикальном положении на фильтровальной бумаге, а затем поместить для сушки в верти­кальный штатив. Когда последнее стекло будет покрыто эмуль­сией, фонарь выключить и сушить стекла в полной темноте в те­чение 30 мин, а затем уложить их в светонепроницаемую коробку с влагопоглотителем (прокаленным силикагелем) и поместить в холодильник. ПС обработать аналогично, но эмульсию развести 1 : 3 и подсушивание стекол в полной темноте производить в тече­ние 45 мин.
      -- Стекла с сеточками проявить в проявителе в течение 3-4 мин, что позволяет получать проявленные зерна размером 0.12-0.16 мкм. Этот режим нельзя использовать для СМ, поскольку размер проявленных зерен лежит за пределами разрешающей
    способности СМ.
      -- После проявления стекла промыть в двух сменах воды, за-
    крепить (не дольше 1 мин) в закрепителе, после чего окончательно
    промыть в течение 15 мин в трех сменах воды. Снятые сеточки
    хранить в контейнерах. Лучше снимать сеточки до того, как лента
    полностью высохнет после промывки.
  

10.2. Авторадиография ПС

      -- Поместить на стекло ПС и высушить.
      -- Покрыть ПС эмульсией, разведенной водой в 2-3 раза, и высушить.
      -- Экспонировать в темноте в течение 2-30 сут (t=4®С).
      -- Проявить, зафиксировать и промыть водой.

10.3. Приготовление проявителей для ЭМ-АРГ

   В настоящее время в АРГ широко используются следующие проявители.
   Фенидоновый: растворить в 250 мл воды последовательно 6.0 г аскорбиновой кислоты, 1.0 г фенидона, 2.0 г КВг, 5.2 г К2СО3, 40.0 г Na2CO3, 24.0 г NaCNS. Долить водой до 300 мл (раствор должен быть прозрачным) и отфильтровать. Проявление в течение 1 мин (t=17®С). Стоп-ванна - 2%-ная уксусная кислота. Фик­саж - 30%-ный тиосульфат натрия.
   Амидоловый: растворить в 600 мл воды последовательно 0.30 г амидола, 10.0 г сульфита натрия безводного, 0.50 г лимонной кис­лоты. Долить водой до 1 л (t=18®С).
   Гидрохиноновый: растворить в 100 мл воды 0.25 г сульфита на­трия, 0.27 г гидрохинона, 5.29 г карбоната натрия, 0.1 г бромида натрия. Раствор профильтровать, проявлять 1 мин.
   Пирогаллоловый (для эмульсии типа Пр): растворить в 600 мл воды последовательно 37.0 г Na2SO4, 25.2 г пирогаллола, 2.0 г амидола, 50.0 г буры, 3.0 г бромистого калия, долить водой до 1 л.
  

10.4. Абсорбционная ЭМ-АРГ

   Приготовить 1%-ный раствор золотохлористоводородной кис­лоты на трижды дистиллированной воде в склянке из особо чисто­го стекла (раствор хранится при t=4®С). Чистые предметные стекла слегка натереть глицерином и поместить в чашку Петри с прокаленным силикагелем. Сеточки тщательно промыть бидистиллированной водой и хорошо просушить при комнатной тем­пературе в чашках Петри с прокаленным силикагелем. На пред­метное стекло поместить каплю 0.01-0.04%-ного раствора золото-хлористоводородной кислоты, приготовленного ex tempore из 1%-ного раствора, и каплю трижды дистиллированной воды. За­крытые чашки Петри с предметными стеклами поставить в тер­мостат при t=35®С на 20 мин.
   Поместить на каплю раствора золотохлористоводородной кис­лоты сеточку на 50-60 с так, чтобы УС были обращены вниз. Тщательно промокнуть сеточку на чистом листе ватмана и поме­стить на каплю трижды дистиллированной воды на 50-60 с. Про­мыть в воде и просмотреть в ТЭМ.
  

11. ЛЕКТИНЫ

11.1. Конъюгирование лектинов (Л)

11.1.1. Конъюгирование Л с КЗ

   Вариант 1. К 5 мл раствора КЗ при постоянном перемешива­нии прибавить 0.1-1.0 мл 0.05%-ного раствора Л. Через 5 мин в полученную смесь влить 1 мл 10%-ного раствора NaCl. Отсутствие изменения цвета раствора свидетельствует об эффективной стаби­лизации комплекса. Изменение цвета раствора на синий указыва­ет на начало флоккуляции. В этом случае количество Л, при­бавляемого к КЗ, следует изменить. Для удаления крупных агрегатов золь надо центрифугировать 20 мин при 1500 об./мин, надосадочную жидкость центрифугировать еще раз 60 мин при 15000 об./мин, t=4®С. Осадок ресуспензировать в 0.5-1.0 мл ФБФР, центрифугирование при 1500 об./мин повторить. Темно-красную надосадочную жидкость используют сразу либо хранят при t=4®С несколько суток.
   Вариант 2. рН золя КЗ аккуратно подвести к изоэлектрической точке используемого Л. По таблице или экспериментально опреде­лить количество Л, необходимое для стабилизации КЗ при данном рН, увеличить его в 10 раз, растворить данное количество Л в 0.1 мл бидистиллированной воды и поместить в центрифужную пробирку. 10 мл КЗ, имеющего рН, оптимальный для связывания Л, добавить как можно быстрее к полученному раствору Л, кото­рые адсорбируются на поверхности частиц КЗ. В смесь добавить 0.5 мл 1%-ного раствора ПЭГ-20000. Раствор центрифугировать для удаления несвязанного Л. Центрифугирование проводить при t=4®С с использованием Ti-ротора (25000 об./мин, для частиц КЗ с диаметром 8 нм - 45 мин, для частиц КЗ с диаметром 14 нм -30 мин). После центрифугирования в пробирке образуются 3 фазы: вверху раствор чистого несвязанного Л, на самом дне тем­ное пятно нестабилизированных частиц КЗ, между ними у дна темно-красный осадок комплекса КЗ-лектин, который после отса­сывания верхнего слоя ресуспензировать в 0.5 мл 0.1 М ФБФР с 0.02% ПЭГ-20000 (рН раствора должен соответствовать значе­нию, оптимальному для связывания). Этот базовый раствор может храниться при t=4®С. Комплекс КЗ с Л сохраняет свою актив­ность по крайней мере 6 мес.

11.1.2. Конъюгирование Л зародышей пшеницы (WGA) с КЗ [312]

   Добавить 5 мг лиофилизированного WGA к 10 мл воды и пе­ремешать. Смешать 6 мл полученного раствора ВГА с 20 мл рас­твора КЗ (диаметр частиц 6-8 нм, рН 9.0). Центрифугировать при 28000 об./мин в течение 30 мин. Осадок ресуспензировать в 5 мл раствора Хэнкса с добавлением 4% ПВП и 0.02% ПЭГ.

11.1.3. Конъюгирование Л с ферритином

   К 5%-ному раствору ферритина, отдиализированному против воды, прибавить эквимолярное количество Л. Например, к 5 мл 0,5"10-6 М раствора ферритина прибавить Л до получения 0,5"10-6 М его раствора. Затем в раствор ввести углевод, блоки­рующий активный центр Л, до конечной общей молярности 0.05 М, рН смеси довести до 7.0-7.4 с помощью микродоз 1 М раствора NaOH и осветлить с помощью центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин. В смесь внести ГА до концентра­ции 0.03% и оставить на 1 ч. В процессе реакции необходимо тщательно контролировать рН раствора. Для каждого Л следует подбирать оптимальные значения рН (для канканавалина А рН 6.8, для лектина клещевины рН 7.4). Через 1 ч концентрацию ГА повысить до 0.06% и отрегулировать значение рН. Еще через 1 ч концентрацию ГА довести до 0.1% и опалесцирующий раствор диализировать против ФБФР в течение 4-6 ч. Остаточные альде­гидные группы восстановить путем добавления в раствор NaBH4 из расчета 1 мг/мл. Затем продолжить диализировать раствор против ФБФР в течение 12 ч, после чего конъюгат лектина с ферритином очистить путем аффинной хроматографии на биоспеци­фическом сорбенте. Очищенный конъюгат отделить от непрореа-гировавшего Л методом высаливания насыщенным раствором NaCl (за исключением Л сои). Насыщенный раствор NaCl не осаждает нативные Л, хотя осаждает большинство конъюгатов ферритина с белками. Л сои необходимо осаждать 25%-ным рас­твором сульфата аммония.
  
   Полученные ферритиновые конъюгаты разбавить до титра гемагглютинации, т. е. в диапазоне от 1: 128 до 1: 64 и диализиро­вать против ФБФР. Затем к растворам добавить 5 мг/мл сыворо­точного альбумина и провести стерилизацию фильтрованием че­рез миллипоровый фильтр Зейца. Полученные реагенты хранить при t=4®С. Необходимо избегать замерзания раствора, так как при этом происходит агрегация молекул ферритина или конъюгатов Л-ферритин, и он становится непригодным для использова­ния. Л, меченные ферритином, можно хранить в виде осадка в на­сыщенном растворе NaCl при t=4®С. Л сои, меченный феррити­ном, надо осаждать и хранить в 25%-ном растворе сульфата аммония.

11.1.4. Конъюгирование Л с ПХ

   К раствору активированной ПХ добавить 40 мг N-ацетилглюкозамина и 4 мг Л, например зародышей пшеницы - WGA (при конъюгировании с Л сои на 10 мг Л добавить 30 мг галактозы). Смесь оставить на 3 ч при t=20®С. К раствору добавить борогидрид натрия или лития из расчета 0.5 мг/мл и диализировать про­тив 4 М борогидрида на ФБФР, в течение 8 ч (t=4®С). Очистку конъюгата провести с помощью гельхроматографии на сефадексе Г150, используя в качестве элюэнта ФБФР. Перед нанесением об­разца на колонку раствор, содержащий продукты реакции, скон­центрировать до объема 0.4-0.5 мл в процессе ультрафильтрации, диализа под давлением либо с помощью сухого сефадекса Г 25. Раствор Л нанести на колонку высотой не менее 80-100 см. В элюате собрать фракции, обладающие одновременно пероксидазной и гемагглютинирующей активностью (первый пик белка).
   Для стандартизации очищенного конъюгата Л определить ак­тивность ПХ и титр гемагглютинации. Последний показатель яв­ляется более важным, так как указывает на сохранение биологиче­ской активности Л и возможности его применения для исследова­ния углеводных детерминант. Полученный реагент разбавить до титра гемагглютинации, т. е. в пределах от 1: 32 до 1 : 16, доба­вить 5 мг/мл сывороточного альбумина и консервант (0.02%-ный раствор NaN3 или 0.01%-ный раствор мертиолата) либо стерили­зовать фильтрацией; хранить при t=4®С.
  

11.2. Визуализация лектиновых рецепторов в ТЭМ

11.2.1. Прямой метод с ферритином

   Перфузировать сосуды 0.5%-ным раствором ГА на среде Хэнкса (рН 7.2) в течение 3 мин. Иссечь объекты и отмыть средой Хэнкса. Обработать 0.1 М раствором глицина на среде Хэнкса 3 раза по 1 мин. Промыть средой Хэнкса - 2 мин. Инкубировать в растворе Л, конъюгированного с ферритином, - 15 мин (t=4®С). Промыть средой Хэнкса - 1 мин. Фиксировать 2%-ным раство­ром ГА на ФБ (рН 7.2) - 30 мин (можно исключить). Постфиксировать в ЧО по Милонигу (см. Приложение, 3.7.2) -1ч. Подго­товить для ТЭМ (если Л конъюгирован с ПХ, то после инкубации в растворе комплекса Л с ПХ следует инкубировать объекты в сре­де на ПХ 3 раза по 1 ч при t=20®С, затем промыть в среде Хэнкса, а далее - так же).
   Контроль: 1) обработать 1%-ным овомукоидом перед введени­ем Л; 2) добавить в раствор Л 200 ммоль/л специфического саха­ра.

11.2.2. Прямой метод с КЗ

   Изолированные клетки фиксировать в 0.1%-ном растворе ГА, который приготовлен на 0.1 М ФБ (рН 7.3), содержащем 4% ПВП, и дважды отмыть тем же буфером и центрифугировать. За­тем клетки ресуспензировать в 0.1 М растворе хлорида аммония на ФБФР при t=4®С, отмыть тем же буфером, содержащим ПВП, и обработать раствором комплекса Л с КЗ в течение 30 мин (t=4®С). Несвязавшийся реагент удалить отмыванием клеток в буфере с ПВП 3 раза по 10 мин. Клетки фиксировать 2.5%-ным раствором ГА -1ч, постфиксировать 1%-ным раствором ЧО в ФБ -1 ч (t=4®С), отмыть в буфере. Приготовить для ТЭМ.
   Контроль: 1) обработать клетки меченым Л в присутствии спе­цифического углевода; 2) исключить Л из процесса обработки пре­паратов; 3) обработать объект 1%-ным раствором йодной кислоты.
  

11.3. Постэмбеддинг. Мечение УС пектинами

11.3.1. Прямой метод

  
   Снять УС на никелевую (или золотую) сеточку с подложкой, поместить сеточку на каплю ФБФР, имеющего рН, оптимальный для связывания КЗ с Л. Затем сеточку с УС перенести на каплю раствора комплекса Л с КЗ на 30 мин. Промыть сеточку сначала несильной струей ФБФР (рН 7.2) из пластиковой трубки, потом на большой капле того же буфера (2 раза по 5 мин), а затем в боль­шой капле воды. Контрастировать с помощью УА и ЦС.
   Контроль: 1) инкубировать сеточки на капле раствора комп­лекса Л с КЗ после преинкубации с раствором специфического са­хара; 2) предварительно инкубировать с немеченым Л, а затем с комплексом Л с КЗ; 3) инкубировать УС в растворе комплекса Л с КЗ после обработки раствором антител против Л; 4) инкубировать в растворе комплекса КЗ с другим белком (например, овальбумином или БСА); 5) инкубировать в суспензии КЗ, стабилизирован­ного с помощью ПЭГ.
  

11.3.2. Непрямой метод

  
   УС снять на никелевую сеточку с подложкой и поместить сре­зами вниз на каплю ФБФР, имеющего рН, оптимальный для свя­зывания КЗ с Л. Затем сеточку перенести на каплю раствора неме­ченого Л (20-300 мкг/мл) на ФБФР (рН 7.2) на 30 мин (можно 45-60). Обильно промыть в слабой струе ФБФР, погрузить в ФБФР на 5 мин. Промокнуть на фильтровальной бумаге. Сеточку поме­стить на каплю раствора комплекса КЗ со специфичным для Л белком (например, овомукоидом) на 30 мин. Обильно промыть сеточку в ФБФР и воде, затем высушить на воздухе. Контрастиро­вать с помощью УА и ЦС.
   Контроль: 1) инкубировать в растворе Л после предваритель­ной обработки срезов специфичными сахарами; 2) инкубировать только с комплексом КЗ с овальбумином (обработку Л из схемы исключить); 3) вначале инкубировать с Л, затем в растворе специ­фичного для Л белка (гликопротеина), а потом в растворе комп­лекса КЗ со специфичным белком (гликопротеином); 4) проинку­бировать УС в нейроминидазе (если используется Л, специфич­ный для сиаловых кислот, например Limas flavus aggl.), затем следует обработать Л, а потом комплексом гликопротеина с КЗ; 5) экстрагировать сиаловые кислоты из срезов с помощью 0.1 М H2SO4 в течение 60 мин (t=80®С) до инкубации УС как в Limas flavus aggl., так и в растворе комплекса овомукоида (или фетуина) с КЗ; 6) инкубировать в растворе Л, а затем в растворе комплекса БСА с КЗ или овальбумина с КЗ.
  

11.4. Мечение пектинами крио-УС или изолированных клеток

   Фиксировать объекты в приготовленном на 0.1 М КБ (рН 7.2) раствором, содержащим 0S% ГА и 4% ФА, в течение 30 мин (t=4®С). Обработать 0.05 М хлоридом аммония - 2 ч (t=30®С). Поместить объекты в 10%-ный раствор ДМСО на КБ - 3 раза по 1 мин. Заморозить в изопентане. Приготовить криосрезы толщи­ной 10 мкм и поместить их в ФБФР (рН 7.4). Инкубировать в рас­творе Л с добавлением 0.1% сапонина и БСА (0.1 мг/мл) - 3-6 ч. Инкубировать в растворе ПХ (100 мкг/мл, t=20®С) -6ч (поме­шивать). Промыть в ФБФР - 2 мин. Фиксировать 1%-ным рас­твором ГА (t=4®С) -1ч. Инкубировать в ИС - 15 мин (t=20®С). Промыть в бидистиллированной воде 3 раза по 1 мин. Постфиксировать 1%-ным раствором ЧО с феррицианидом (см. Приложение, 3.10.1) - 30 мин. Постфиксировать 1%-ным раство­ром ЧО на вероналацетатном буфере (рН 7.2) -8 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
   ИС: растворить ДАБ (0.5 мг/мл) в 10 мл 0.05 М Трис-HCi буфера (рН 7.6) и добавить 1%-ный раствор перекиси водорода (20 мкл/мл).
   Контроль: 1) исключить Л из ИС; 2) исключить ИС; 3) доба­вить в ИС специфичный конкурентный сахар (от 100 до 300 ммоль/л).

11.5. Визуализация лектиновых рецепторов эндотелия в СЭМ

   Обработку вести при t=4®С: проперфузировать сосуды средой Хэнкса - 1 мин, а затем 2%-ным раствором ГА на 0.1 М КБ (рН 7.2) - 5 мин; промыть раствором Хэнкса - 1 мин; ввести в просвет сосуда раствор конканавалина А на том же буфере на 15 мин; про­мыть средой Хэнкса. Поднять температуру до 37®С: ввести в просвет 0.1%-ный раствор гемоцианина на том же буфере -1ч; промыть раствором Хэнкса - 30 с; постфиксировать 1%-ным рас­твором ЧО - 1 ч (t=20®С). Подготовить для СЭМ.
   Контроль: 1) вместо 1%-ного раствора конканавалина А ис­пользовать смесь 1%-ного раствора конканавалина А и 0.1 М рас­твора L-метил-D-маннозида (1:9).

11.6. Визуализация лектиновых рецепторов в СЭМ с помощью антител [178]

   Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) -2ч (t=4®С). Обработать 0.2 М раствором глицина на ФБФР - 30 мин. Промыть в физрастворе (см. ниже), забуференном Трис (рН 7.4) - 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе лектина (напри­мер, 100 мкг/мл конканавалина в физрастворе, забуференном Трис (ТБФР), с добавлением 1 ммоль/л MnCl2 и 1 ммоль/л CaCl2) - 60 мин. Промыть ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе очищенных кроличьих антилектиновых антител -2 ч. Промыть ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе очи­щенных козьих противокроличьих антител, конъюгированных с КЗ (диаметр 30 нм) - 60 мин. Промыть в ТБФР. Постфиксиро­вать в ЧО и подготовить для СЭМ.
   Физраствор, забуференный Трис: приготовить раствор, содер­жащий 10 ммоль/л Трис и 150 ммоль/л NaCl (рН 7.4).
   Контроль: 1) исключить Л; 2) добавить 0.25 М раствор специ­фического ингибитора (d-метил-D-манноза) к раствору конкана­валина А (1 : 1).
  

12. ИММУНОМЕЧЕНИЕ

12.1. Блокирование альдегидных групп на крио-УС

   Сеточки с крио-УС поместить на крупную каплю 0.01 М раст­вора глицина, приготовленного на ФБФР. После трех таких про­мываний сеточку перенести на каплю такого же раствора, содержа­щего 2% желатины, на 10 мин, и вновь промыть на 4-6 каплях 0.01 М глицина на ФБФР.

12.2. Иммуномечение крио-УС

   Фиксировать образцы в ФА. Изготовить крио-УС и поместить их на никелевые или золотые сеточки. Обработать 0.02 М раство­ром глицина на ФБ (или свежеприготовленным 1%-ным раствором борогидрида на ФБФР) - 10 мин. Промыть ФБ 2 раза по 1 мин. Промыть раствором, блокирующим неспецифическое связывание (РБНС), например 0.1%-ным раствором БСА на ФБФР с добавле­нием 0.1% желатины, - 15 мин. Инкубировать срезы с раствором первых антител в соответствующем разведении - 30-60 мин. Про­мыть в РБНС 2 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе вторых антител в соответствующем разведении - 30-120 мин. Промыть в РБНС 2 раза по 5 мин. Промыть в ФБФР 2 раза по 5 мин. Фикси­ровать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 30 мин. Контрастировать срезы с помощью УА с добавлением метилцеллюлозы. Крио-УС по­сле контрастирования можно заливать в акриловую смолу.

12.3. Иммуномечение крио-УС с помощью биотин-авидиновой системы

   Фиксировать срезы в ФА и обработать их 1%-ным раствором борогидрида (или раствором глицина). Инкубировать в растворе первых антител (ПАТ) в соответствующем разведении - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе биотинилированных вторых антител (ВАТ) в соответствующем разведении - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 10 мин. Инку­бировать в растворе комплекса: стрептавидина (или авидина) с КЗ (развести, например, в соотношении 1 : 50 с помощью РБНС) -120 мин (можно инкубировать до 4 ч). Промыть в РБНС 3 раза по 15 мин. Промыть в ФБФР 3 раза по 5 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 10 мин. Промыть ФБФР 3 раза по 5 мин. Промыть водой 2 раза по 5 мин.
  

12.4. Преэмбеддинг с использованием КЗ в качестве маркера

   Фиксировать в 4%-ном растворе ФА - 20 мин. Провести пермеабилизацию (обработать метанолом или 0.1%-ным раствором Тритона Х-100 и т. п.). Обработать 1%-ным раствором борогидри­да или глицином - 30 мин. Обработать РБНС - 5 мин (лучше ис­ключить). Инкубировать в растворе ПАТ (1 мкг/мл, разводить в РБНС) - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин. Инкубировать в биотинилированных ВАТ (2 мкг/мл) - 60 мин. Промыть РБНС 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе комплекса стрептави­дина (или авидина) с КЗ (обычно разводят в соотношении 1 : 50 с помощью РБНС) - 120 мин (можно до 4 ч). Обработать РБНС 3 раза по 15 мин, а затем ФБФР 3 раза по 5 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 10 мин. Промыть в ФБФР 3 ра­за по 5 мин. Подготовить для ТЭМ.
  

12.5. Преэмбеддинг с ПХ [332]

   Вариант 1. Кусочки ткани (объемом 0.5 см ) фиксировать (можно исключить) и поместить в ФБФР, содержащий 2.3 М саха­розы, на 6-8 ч, быстро заморозить и оттаять в 2.3 М сахарозе (t=4®С). Промыть в ФБФР. В криостате приготовить срезы тол­щиной 20-80 мкм. Срезы инкубировать в РБНС (10%-ном раство­ре нормальной сыворотки, козьей или свиной) - 30-60 мин. Про­мыть в ТБФР (рН 7.2). Инкубировать в растворе ПАТ (кроличьи IgG, разведенные на ФБФР с 5% БСА) в течение ночи. Промыть в ТБФР. Инкубировать в растворе ВАТ (противокроличьих) - 60 мин. Промыть в ТБФР. Инкубировать в растворе комплекса пе-роксидаза - антипероксидаза (ПАП) - 90-120 мин (комплекс кро­личьих ПАТ с IgG, разведенный в ТБФР в соотношении 1 : 50). Промыть в ТБФР. Инкубировать в ИС (см. ниже) для выявления ПХ без добавления перекиси водорода - 10 мин. Инкубировать в полной ИС - 10 мин. Промыть в ТБФР. Постфиксировать в ЧО. Приготовить для ТЭМ.
   Вариант 2 [246]. Фиксировать в перйодат-лизин-параформальдегидном фиксаторе (см. Приложение, 3.10.8) в течение 6 ч. Криостатные срезы инкубировать (в течение ночи) в растворе IgG в соответствующем разведении (например, 1 : 100). Отмыть в про­мывочном растворе. Инкубировать с Fab-фрагментом овечьих противокроличьих IgG, конъюгированных с ПХ, в соответствую­щем разведении (например, 1 : 50) в течение 2 ч. Отмыть в про­мывочном растворе. Дофиксировать 3%-ным раствором ГА на 0.1 М КБ (рН 7.4). Провести реакцию на ПХ (см. Приложение, 9.5). Подготовить объекты для ТЭМ.
   ИС: приготовить на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.6) 0.06%-ный раствор ДАБ, добавить 0.01% перекиси водорода.
   Среда для пероксидазы [116]: 22 мг ДАБ растворить в 175 мл 0.05 М Трис-HCl буфера (рН 7.6), добавить 100 мкл 30%-ной пе­рекиси водорода и профильтровать через миллипоровый фильтр. Порошок ДАБ при t < 0®С может храниться в течение года. Раст­вор ДАБ также можно хранить в замороженном виде. Перекись во­дорода сохраняет свои свойства в течение 2 мес после откупорки банки. Однако, если к раствору ДАБ добавлена перекись водорода, раствор стабилен только в течение часа.
   Сеточки в ИС должны находиться в постоянном движении, для этой цели обычно используют магнитную мешалку.
  

12.6. Постэмбеддинг

12.6.1. Прямой метод с использованием акриловых УС

   Преинкубировать сеточку с УС в РБНС (см. ниже) - 30 мин. Инкубировать с первыми моноклональными антителами (МАТ), конъюгированными с КЗ (в соответствующем разведении), - от 30 мин до 2 ч. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин (в большой кап­ле). Промыть в ФБФР 3 раза по 5 мин (в большой капле). Про­мыть в воде 3 раза по 5 мин (в большой капле).
   РБНС: приготовить на ФБФР 0.5%-ный раствор БСА, добавить 0.1% желатины.

12.6.2. Непрямой метод с использованием акриловых УС [115]

   Поместить УС на никелевые сеточки. Инкубировать в нор­мальной сыворотке или БСА - 30 мин. Инкубировать в растворе ПАТ на 0.05 М ТБФР (рН 7.2) - 24 ч (t=4®С). Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2), содержащим 1% БСА, - 10 мин. Инкубировать в рас­творе ВАТ, конъюгированных с КЗ, который приготовлен на 0.02 М ТБФР (рН 8.2) и содержит 1% БСА, - 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) с 1% БСА - 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Промыть в воде - 10 мин. Контрастировать с помощью УА и ЦС.

12.6.3. Непрямой метод с использованием эпоксидных УС

   Обработать УС на сеточках 10%-ным раствором перекиси во­дорода. Промыть водой. Удалить избыток жидкости с сеточки и поместить ее в каплю раствора нормальной сыворотки животного (донора ВАТ) на ФБФР, содержащего 0.1% БСА. Удалить избыток нормальной сыворотки с сеточек и поместить их в раствор ПАТ, приготовленный на ФБФР с 0.1% БСА, на 1 ч при t=20®С или на 48 ч при t=4®С (оптимальное разведение ПАТ определяют эмпирически). Промыть, (при постоянном помешивании) в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.2), содержащем 0.2% БСА, 3 раза по 15 мин. Поместить сеточки на каплю раствора ВАТ, конъюги­рованных с КЗ, и инкубировать 1 ч (t=20®С) Тщательно про­мыть большим объемом 0.05 М Трис-HCl буфера (рН 7.2), содер­жащего 0.2% БСА, затем буфером без БСА и наконец водой. Осушить сеточки фильтровальной бумагой. Контрастировать УА и(или) ЦС.
  

12.6.3.1. Травление УС

   Вариант 1. Удаление осмия из тканей. Приготовить 1%-ный или насыщенный водный раствор метаперйодата натрия (за 2-3 сут до использования). Сеточки с УС поместить плавать на каплю раствора или погрузить в нее на 10-60 мин, затем отмыть в ФБФР.
   Вариант 2. Протравить УС в 10%-ном растворе перекиси водо­рода (10 мин) или в 1%-ном растворе йодной кислоты (1 мин). Это сделает смолу проницаемой для антител.

12.7. Иммуномечение поверхности клеток для СЭМ

   Вариант 1 [178]. Фиксировать объект в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.4) - 30 мин. Промыть в ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе ПАТ на ТБФР - 60 мин. Промыть в ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе ВАТ, конъюгированных с КЗ (например, с частицами диаметром 45 нм), -60 мин (после этого этапа можно увеличить диаметр частиц КЗ с помощью серебряного усиления). Промыть, обезводить, подгото­вить для СЭМ.
   Вариант 2 [178]. Отмыть клетки. Фиксировать в 1%-ном раст­воре ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) - 15 мин. Промыть клетки в ФБФР. Инкубировать в растворе кроличьих ПАТ (например, против фибронектина) в соответствующем разведении - 45-60 мин. Промыть в ФБФР. Инкубировать в растворе козьих противокро­личьих ВАТ, конъюгированных с КЗ (диаметр частиц - 45 нм), -2 ч. Промыть в ФБФР. Постфиксировать в ЧО. Подготовить для СЭМ.

13. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

13.1. Гибридизация in situ на ПС

   Инкубировать объекты на капле гибридизирующей смеси (t=37®С) - 5-10 ч. Промыть в ФБФР (или РБНС) 5 раз по 10 мин. Инкубировать в растворе кроличьих противобиотиновых антител (в соответствующем разведении) -2 ч. Промыть в ФБФР (или РБНС) 2 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе комплекса протеина А с КЗ - 1 ч. Промыть в ФБФР (или в РБНС). Инкуби­ровать в растворе антител против протеина А - 2 ч. Промыть в ФБФР (или в РБНС). Инкубировать в растворе комплекса протеи­на А с КЗ - 1 ч. Промыть в воде, высушить, просмотреть.

13.2. Гибридизация in situ радиационным способом

   Поместить сеточки с УС на каплю гибридизирующей смеси с зондом, меченным 3Н-тимидином, во влажную камеру (t=37 ® С) на 24 ч. Промыть формамидным буфером (несколько капель) (t=37®С) - 20 ч, затем в ФБФР и в воде. Высушить и провести процедуру ЭМ-АРГ (t=4®С). Меченные тритием зонды денату­рировать путем кипячения.

13.3. Гибридизация in situ с помощью биотинилированного зонда

   Поместить сеточки с УС на каплю 0.1 М глицина на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.4) на 10 мин. Обработать раствором РНКазы (100 мкг/мл на цитратном физрастворе (ЦФР) (см. ни­же), разбавленном в 2 раза) в течение 1 ч (t=37®С). Промыть в 70%-ном растворе формамида на разбавленном в 2 раза ЦФР -2 мин (t=70®С), затем в 50%-ном растворе формамида на ЦФР (разбавленном в 2 раза) с добавлением 10 ммоль/л Трис-НСl буфера (рН 7.5) и 1 ммоль/л ЭДТА - 2 мин. Инкубировать в смеси для гибридизации - 9-10 ч (во влажной камере, t=37®С). Обработать в 50%-ном формамиде на ЦФР (разбавленном в 2 раза; t=37®С, крупная капля, помешивать) 4 раза по 30 мин. Промыть в ФБФР, затем в 4%-ном БСА на ФБФР - 15 мин. Промокнуть. Обра­ботать противобиотиновыми антителами, разведенными на базовом растворе, содержащем 1% БСА и 0.5% Тритона Х-100, -2 ч, за­тем в том же растворе, но без антител (крупная капля, помеши­вать) - 30 мин. Инкубировать в анти-IgG на базовом растворе (с БСА и Тритоном Х-100) - 90 мин. Отмыть в 1%-ном растворе БСА на ФБФР (крупная капля, помешивать) 2 раза по 30 мин. Про­мыть в ФБФР - 30 мин. Промыть в воде - 30 мин. Контрастиро­вать в УА, а затем в ЦС.
   Цитратный физраствор (ЦФР): растворить 8.82 г цитрата нат­рия и 11S г NaCl в воде (свободной от РНКазы), долить водой до 1 л (рН 7.0).
   Смесь для гибридизации.
   Состав 1: приготовить 50%-ный формамид на ЦФР (разбавлен­ном в 2 раза), добавить 10% сульфата декстрана, 0.3% фикола, 0.3% ПВП, 0.3% БСА, по 100 мкг/мл тРНК и ДНК спермы лосося, 1 мкг/мл зонда. Прокипятить 2 мин и хранить при t=0®С.
   Состав 2: ввести нуклеотидный зонд в растворитель для гиб­ридизации (см. ниже) до концентрации 6-20 мкг/мл.
   Растворитель для гибридизации: смешать 20 мл 50%-ного рас­твора сульфата декстрана (Sigma) на воде, свободной от РНКазы, 15 мл, разбавленного в 2 раза ЦФР, 2 мл раствора 50-Денхардта (Denhardt, фирма Sigma), 10 мг ДНК спермы лосося (фирма Sigma), 100 мг пирофосфата натрия, 18 мл воды, свободной от РНКазы, 50 мл деионизированного формамида. Раствор может храниться при t=-30®С.
   Контроль: 1) обработать свежеприготовленным раствором ДНКа-зы (10 мкм/мл) или РНКазы (100 мкг/мл) на ФБФР (который кипятят 15 мин для инактивации ДНКаз и хранят не дольше 1 мес при t=4®С) в течение 1 ч; 2) пользоваться небиотинили-рованным зондом; 3) исследовать клетки в другом функциональ­ном состоянии (где данный ген не экспрессируется).
  

14. ТРЕЙСЕРЫ

14.1. Исследование проницаемости с помощью ПХ

   В 4 мл ФБФР растворить 40-50 мг ПХ и ввести внутривенно. Через несколько минут после введения ПХ (в зависимости от це­ли исследования) провести 5-7-минутную перфузионную фикса­цию с помощью 1.5%-ного раствора ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.4), содержащего 25% ПВП-4000. Извлечь кусочки тканей и промыть их в буфере в течение ночи. Затем 20 мин инкубировать в буфере, содержащем 0.05% ДАБ, а потом инкубировать в ИС на ПХ в те­чение 15-60 мин (t=37 ® С). Промыть в буфере, а потом в воде. Постфиксировать в смеси ЧО с ферроцианидом (см. Приложение, 3.10.1) в течение 1 ч. Приготовить для ТЭМ.
   ИС на ПХ: растворить в 10 мд Трис-HCl буфера (рН 7.6) 5 мг ДАБ и добавить 0.1 мл 1%-ной перекиси водорода.

14.2. Исследование проницаемости с помощью микропероксидазы

   Ввести в сосудистое русло раствор микропероксидазы (по 5-10 мг в 0.2 мл физраствора на 20 г массы). Фиксировать в раз­бавленном фиксаторе Карновского в течение 2 ч. Изготовить вибратомные срезы. Промыть срезы в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6). Выдержать в ИС (см. ниже) без добавления перекиси во­дорода (t=37®С) в течение 10 мин. Инкубировать в ИС (см. ни­же) в течение 3 ч. Промыть 5 раз в том же буфере. Обработать в осмий-феррицианидном растворе (см. Приложение, 3.10.1) в тече­ние 30-90 мин.
   ИС: растворить в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6) 0.1% ДАБ-тетрахлорида и 0.01% перекиси водорода.
   ИС для микропероксидазы НИР и Н8Р: приготовить на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6-9.0 для НИР и рН 7.0-7.2 для Н8Р) 0.1 М раствор имидазола, содержащий 0.15% ДАБ-тетрахлорида, 0.02% перекиси водорода. Время инкубации 60 мин (t=20®С). В дальнейшем желательна обработка с помощью ТК.
  

14.3. Окрашивание коллоидным лантаном [253]

   Фиксировать объекты в растворе Б в течение 1 ч. Промыть в растворе В в течение 16 ч. Постфиксировать в растворе Г в тече­ние 1ч.
   Раствор А: приготовить на бидистиллированной воде 3.5%-ный раствор La(NO3)2, оттитровать рН полученного раствора при помощи 0.1 М NaOH до 7.7, довести рН до 7.80 с помощью 0.01 М NaOH (на магнитной мешалке, контролируя рН) - осторожно, при рН 7.81 выпадает осадок. Раствор коллоидного лантана прозрачен и не опалесцирует.
   Раствор Б: слить 17.5 мл 0.1 М КБ (рН 7.4), 25 мл 25%-ного раствора ГА и 5.0 мл раствора А.
   Раствор В: а) слить 175 мл 0.1 М КБ (рН 7.4) и 5.0 мл раство­ра А; б) приготовить на 0.1 М КБ (рН 7.4) 2%-ный раствор ГА с добавлением 1.25% коллоидного лантана.
   Раствор Г: слить 6.0 мл 2%-ного раствора ЧО на 0.1 М КБ (рН 7.4) и 2.0 мл раствора А.

14.4. Окрашивание коллоидным никелем

   Фиксировать объекты в растворе Б с помощью иммерсии или перфузии -8 ч. Промыть в 0.1 М КБ (рН 7.2). Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО с добавлением 1% ферроцианид калия.
   Раствор А: 1.0 г Ni(NO3)2"6H2O растворить в 100 мл 0.1 М КБ (рН 7.2).
   Раствор Б: перед самой фиксацией смешать 4 части раствора А с 1 частью 25%-наго раствора ГА (конечная осмолярность -850 мОсм).

14.5. Мечение поверхности объекта с помощью катионизированного ферритина [312]

   Фиксировать объекты в разбавленном растворе Карновского (см. Приложение, 3.9.2). Промыть в 0.1 М КБ на 0.1 М сахарозе (рН 7.4) в течение 30 мин (сменить раствор несколько раз). Поме­стить в 0.15 М глицин с добавлением 7.5% сахарозы на 20 мин. Инкубировать при постоянном перемешивании в 2 мл суспензии катионизированного ферритина (фирма Sigma, 1 мг/мл) на среде 199 в течение 15 мин. Промыть и подготовить для ТЭМ.
  

15. ПОЛУЧЕНИЕ УГЛЕРОДНОЙ ПЛЕНКИ

   Пары нафталина впускают в вакуумную камеру и подвергают воздействию высоковольтного разряда в течение 10 с. Это вызы­вает полимеризацию газа в виде тонкой пленки на поверхности объекта. Биологические ткани затем растворяют в 1%-ном рас­творе гипохлорита натрия в течение 5-10 мин.
  

16. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В МЕМБРАНАХ

   Фиксировать объекты в 2.5%-ном растворе ГА на КБ (рН 7.4) с добавлением 50 ммоль/л филипина и 1% ДМСО (предвари­тельно филипин растворить в нескольких микролитрах ДМСО) в течение 5 мин. Отмыть в КБ. Поместить в 20%-ный раствор гли­церина на КБ на 15 мин. Заморозить. Методом замораживания - скалывания получить реплики для исследования в ТЭМ.
  

17. СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ЭМ

17.1. Оттенение макромолекул

   С помощью пинцета расщепить пластинку слюды и получить две чистые поверхности. Провести диализ раствора исследуемых макромолекул против раствора смеси летучих веществ (аммоний ацетат, аммоний гидроксид, уксусная кислота и др.). Развести полученный раствор белка до концентрации 50-100 мкг/мл и добавить 25-50% чистого глицерина. Распылить раствор пуль­веризатором так, чтобы верхний конец пластинки слюды смачи­вался сильнее (для создания градиента плотности фракций). Вакуумировать полученные препараты в течение 20 ч под давлением 10-7 Торр (1.33"10-5 Па), чтобы удалить с поверхности все лету­чие вещества. Напылить пластинку вольфрамом или танталом под углом 10 0 при постоянном вращении объекта (толщина ре­плики должна быть 5 нм). Напылить слой углерода, контролируя его толщину с помощью пьезоэлектрического монитора или по цвету пленки. Покрыть слюду 05%-ным раствором нитроцеллю­лозы в n-бутилацетате и промокнуть избыток. Высушить в тече­ние 5 мин и разделить пластинку на более мелкие кусочки. Снять реплику на поверхность воды и поместить на сеточки. Слой нит­роцеллюлозы можно удалить в амилацетате.
  

17.2. Метод распластывания и оттенения молекул ДНК с помощью формамида [114]

   Растворить ДНК в растворе А до концентрации 1 мкг/мл. До­бавить к полученному раствору цитохром С до конечной концент­рации 100 мкг/мл, 60% перегнанного формамида (объемные до­ли), 100 ммоль/л Трис-HCl буфера (рН 8.5) и 10 ммоль/л ЭДТА. Наслоить полученный раствор на "гипофазу" (см. ниже). Собрать распластавшиеся объекты на сеточки с углеродными подложками, обработанными альциановым синим. Погрузить сеточки в 5"10-4 М раствор УА на 96%-ном этаноле на 30 с. Промыть в 96%-ном этаноле и высушить. Провести круговое оттенение с по­мощью платинопалладиевого сплава (80 : 20) под углом 8®.
   Раствор А: приготовить 0.001 М раствор ЭДТА на 0.01 М Трис-HCl буфере (рН 8.0).
   Раствор-"гипофаза": приготовить 0.001 М раствор ЭДТА на 0.01 М Трис-HCl буфере (рН 85), добавить 30% формамида.
  

17.3. Исследование парафиновых блоков в СЭМ и ТЭМ

   Удалить парафин с помощью ксилола (до трех раз по 2 ч - в зависимости от величины объектов; крупные кусочки обрабаты­вать ксилолом при t=60®С). Поместить объекты в 100%-ный этанол на 15 мин, затем в 50%-ный этанол на 15 мин. Промыть водой 2 раза по 10 мин. Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО -1 ч. Подготовить для СЭМ или ТЭМ.

17.4. Последовательное изучение объектов в СМ, СЭМ и ТЭМ [191]

   После изготовления гистосрезов объект поместить в смесь (1 : 1) ксилола и этанола на 5 мин, потом в этанол на 5 мин, за­тем в смесь (1:1) этанола и изоамилацетата на 5 мин. Перенести срезы в изоамидацетат на 5 мин. Высушить с помощью перехода критической точки (ВКТ). Просмотреть в СЭМ, просмотренные объекты обводнить (этанол 100, 80, 65, 45, 25%-ный, затем вода -по 30 мин). Промыть в ФБ (рН 7.4) в течение 20 мин, постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО в течение 1 ч. Обезводить, заклю­чить в Аралдит и приготовить УС для ТЭМ.

17.5. Анализ объектов, подготовленных для ТЭМ, в СЭМ

   Растворить эпоксидную смолу 30%-ным раствором NaOH на 100%-ном этаноле (для кусочка размером 5 мм продолжитель­ность обработки 48-60 ч). Отмыть в 100%-ном этаноле 3 раза по 1 ч. Подготовить для СЭМ.

17.6. Исследование объектов в СЭМ после СМ [272]

   Обезводить в этаноле при возрастающих концентрациях (30, 50, 70, 85%-ный ) - по 1 ч в каждом растворе, затем в 100%-ном этаноле 3 раза по 15 мин. Обработать, перемеши­вая, смесью (1 : 1) среды А и абсолютного этанола в течение 30 мин. Пропитать в расплавленной среде A (t=37®С) 3 раза по 30 мин, а затем еще 1-12 ч. Поместить в свежерасплавленную и отфильтрованную среду А (см. ниже), дать объектам остыть до комнатной температуры и выдержать в течение 24 ч. Изготовить срезы толщиной 3-4 мкм. Обработать срезанные блоки (t=37®С) в 100%-ном этаноле 3 раза по 15 мин (для срезов 3 раза по 5 мин). Подвергнуть ВКТ и исследовать в СЭМ срезанную поверхность блока.
   Среда А: 9 частей расплавленного дистеарата ПЭГ-400 переме­шать с 1 частью 1-гексадеканола (t=60®С) до гомогенного со­стояния; хранить при комнатной температуре (не допускать дву­кратного нагревания до t=37®С).

17.7. Приготовление меламиновой подложки для культивирования клеток и ЭМ [345]

   Выполнить те же процедуры, что и при изготовлении подлож­ки из формвара (см. раздел 7.6.2), но перед погружением стекла в раствор меламина его следует нагреть до t=60®С, а при последу­ющих манипуляциях использовать пинцет. Стекла вынимать из раствора медленно - в течение 1-2 с, высушивать 5 мин и для поли­меризации смолы нагревать над пламенем (в ламинарном шка­фу). Толщина пленки меламина 80 нм.
   После культивирования клеток и подготовки объектов для СЭМ с использованием ВКТ пленка легко отделяется от стекла с помощью тонких пинцетов, ресницы или другого сверхтонкого инструмента.
   Раствор меламина: 1 мл эфира гексаметилолмеламина (Agar Scientific, Stansted) растворить в 99 мл 100%-ного сверхчистого этанола и добавить 03% паратолуенсульфоновой кислоты (ини­циатор); раствор стабилен при комнатной температуре несколько недель.

17.8. Фиксация бактерий

   Фиксировать в 6.25%-ном растворе ГА на буфере А (см. ниже) в течение 1 ч. Сполоснуть в буфере А. Постфиксировать в раство­ре Б в течение 1 ч. Сполоснуть в буфере А. Контрастировать в 0"5%-ном растворе УА на буфере А в течение 1 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
   Буфер А: (рН 6.2-6.4): смешать 5 мл 0.1 М раствора веронала натрия, 2.0 мл 8.5%-ного раствора NaCl, 6.7 мл 0.1 М раствора НСl и 11.3 мл воды.
   Раствор Б: смешать 12 мл вероналацетатного буфера, 0.25 мл насыщенного раствора СаCl2 и сразу добавить 12.5 мл 2%-ного раствора ЧО.
  

17.9. Фиксация бактериальных клеток по Рейтеру [9]

   К 1 части культуры бактерий в жидкой среде добавить 10 час­тей раствора ЧО (см. ниже), отцентрифугировать при 4000 об./мин в течение 5 мин. Осадок ресуспензировать в 0.1 мл питательной среды, к которой добавить 10 мл 1%-ного раствора ЧО, приготов­ленного на растворе Б, и оставить на ночь. Добавить 10 мл рас­твора А и отцентрифугировать при 4000 об./ мин в течение 4 мин. Осадок залить 0.03 мл 2%-ной желатины, хорошо перемешать и нанести каплю на предметное стекло при t=45®С. После засты­вания нарезать каплю на кубики объемом 1 мм и обработать их 0.5%-ным раствором УА, приготовленным на растворе А. Обезво­дить и подготовить для ТЭМ.
   Раствор ЧО: приготовить 1%-ный раствор ЧО на растворе А.
   Раствор А: 19.428 г уксуснокислого натрия, 29.428 г веронала натрия, 34.0 г NaCl растворить в небольшом количестве воды и до­лить водой до 1 л; к 5 мл полученного раствора добавить 7 мл 0.1 М НСl, 13 мл бидистиллированной воды и 0.25 мл 1 М CaCl2 (рН 6.0).
   Раствор Б: приготовить 10%-ный Тритон Х-100 на растворе А.
  

18. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ

18.1. Электропроводный клей

   Состав 1: растереть в фарфоровой ступке 150 г графита, 300 г серебра порошкового, 300 г сополимера винилхлорида-винилацетата и 320 мл ацетона.
   Состав 2: растереть в фарфоровой ступке 600 г серебра порош­кового, 60 г порошка графита, 40 г нитроцеллюлозы, 26 г канифо­ли и 300 мл ацетона.
   18.2. Осмирование образцов для СЭМ
   После фиксации в ЧО отмыть объекты в КБ (рН 7.4) - 10 мин. Обработать 1%-ным раствором ТК на 0.05 М КБ (рН 7.0) - 30 мин. Отмыть в КБ. Приготовить для СЭМ.
  

18.3. Выявление лимфатических сосудов в СЭМ [305]

   Перед фиксацией на 10 мин погрузить объекты в 0.75%-ный раствор перекиси водорода - лимфатические капилляры при этом растягиваются. Фиксировать иммерсией в 4%-ном растворе ФА с добавлением 1% перекиси водорода -2 ч. Покровные слои ткани осторожно удалить тонким пинцетом и поместить оставшийся ку­сочек в 8 М раствор НСl на 30 мин (t=40®С). Подготовить объ­екты для СЭМ.

18.4. Импрегнация межэндотелиальных границ для анализа в СЭМ

   Вариант 1. После перфузионной глютаровой фиксации отмыть сосуды 5%-ным раствором глюкозы в течение 5 мин. Последова­тельно проперфузировать (или промыть после извлечения кусоч­ка) сосуды 0.15%-ным раствором AgNO3 - 1 мин, 5%-ным раствором глюкозы - 1 мин, раствором, содержащим 3% СоВг2 и 1% NH4Br - 1 мин, 5%-ным раствором глюкозы - 1 мин, 2.5%-ным раствором ГА - 2 мин. Иссечь участок сосуда и дофиксировать в ГА в течение 24 ч. Приготовить для СЭМ.
   Вариант 2. Перед фиксацией промыть сосуды 5%-ным раство­ром глюкозы, приготовленным на 0.01 М ГЕПЕС (рН 7.0), -1 мин, перфузировать 0.05%-ным раствором AgNO3 на свежепри­готовленном 5%-ном растворе глюкозы - 30 с, затем отмыть 5%-ным раствором глюкозы на 0.01 М ГЕПЕС (рН 7.0) - 1 мин. Перфузировать раствором, содержащим 1% NH4Br и 3% СоВг2, -1 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.2) -2 ч. Подготовить для СЭМ.

18.5. Импрегнация трупного материала

   Не позднее чем через 2 ч после смерти отмыть сосуды раство­ром Хэнкса с гепарином (10 ЕД/мл). Фиксировать 2.5%-ным раствором ГА на растворе Хэнкса - 5 мин. Иссечь кусочки (мож­но хранить не более 1 сут в 0.9%-ном растворе хлорида натрия). Отмыть сосуд в 5-5%-ном растворе глюкозы - 1 мин. Инкубиро­вать в 0.15%-ном растворе AgNO3 - 90 с. Последовательно проин­кубировать в 5.5%-ном растворе глюкозы - 1 мин, в растворе, со­держащем 1% NH4BT и 3% СоВг2, - 1 мин, в 55%-ном растворе глюкозы - 1 мин, в 2.5%-ном растворе ГА - 5 мин. Вскрыть сосуд вдоль оси, отделить адвентицию пинцетом от комплекса внутрен­ней и средней оболочек. Приготовить для СЭМ.
  

19. ИССЛЕДОВАНИЕ В СЭМ НЕСВОБОДНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

19.1. Обнажение внутренней поверхности плазмалеммы

   Свежеотщепленную пластинку слюды погрузить в 0.01%-ный раствор альцианового синего или L-полилизина и сполоснуть в воде. Каплю взвеси изолированных клеток в ФБФР поместить на слюду и выдержать в горизонтальном положении для прикрепле­ния клеток к слюде. Промыть 10-кратным погружением пластин­ки в ФБФР. Прикрепленные клетки обработать 30%-ным раство­ром глицерина на 0.155 М ацетате аммония. Избыток раствора промокнуть фильтровальной бумагой. Клетки в течение 1 ч вакуумировать, а затем напылить слоем углерода (10 нм). Получен­ный препарат осторожно погрузить в воду - вследствие осмотиче­ского разрушения клеток угольная пленка с адгезированной плаз-малеммой всплывает на поверхность жидкости. На пленку разложить ЭМ-сеточки, снять их и подвергнуть негативному контрастированию со стороны внутренней поверхности на капле 2%-ного раствора УА (рН 45) или молибдата аммония (рН 6.9).

19.2. Обнажение внутриклеточных структур с помощью осмиевой мацерации

   Вариант 1. Фиксировать объект перфузией раствора, содержа­щего 0.5% ГА и 0.5% ФА, 5 мин. Вырезать кусочки. Пропитать растворами ДМСО при возрастающей (до 50%) концентрации. Заморозить в тающем пропане или фреоне-111. Расколоть под жидким азотом. Поместить в 50%-ный раствор ДМСО. Отмыть криопротектор буферным раствором. Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО. Мацерировать в 0.1%-ном растворе ЧО на 0.15 М ФБ (рН 7.4) - 3 сут (t=20®С). Импрегнировать осмием с по­мощью ТК или тиокарбогидразида (см. Приложение, 18.2). Обез­водить, подвергнуть ВКТ (или замораживанию - высушиванию), напылить платиной (или сплавом золота с палладием), изучить в СЭМ (или очистить реплику и изучить в ТЭМ).
   Вариант 2. Фиксировать объекты в 1%-ном растворе ЧО на 0.067 М ФБ (рН 7.4) в течение 15 ч. Промыть в ФБ. Погрузить в 25%-ный раствор ДМСО на ФБ на 1 ч (пока объекты не утонут). Перенести в 50%-ный раствор ДМСО на 1 ч. Промокнуть кусоч­ки, заморозить (например, в жидком азоте) и расколоть в заморо­женном состоянии. Отметить сколотую поверхность и поместить в 50%-ный раствор ДМСО до полного оттаивания. Погрузить в 0.1%-ный раствор ЧО на 30 мин, а затем в новую порцию на 72 ч. Обезводить в этаноле. Подвергнуть ВКТ. Смонтировать на столик сколотой поверхностью вверх.

19.3. Выявление цитоскелета [237]

   Промыть объекты раствором Хэнкса (t=37®С). Обработать свежеприготовленным 0.001 М раствором ДСТ на растворе Хэнкса -15 мин (t=37®С). Обработать свежеприготовленным 0.001 М раствором ДСТ с добавлением 05% Тритона Х-100 на цитоскелетстабилизирующем буфере (ЦСБ) - 10 мин (t=37®С). Про­мыть в ЦСБ - 5 мин. Фиксировать в 2.5%-ном растворе ГА на ЦСБ - 10 мин (t =37®С). Фиксировать в 2%-ном растворе ГА на 0.1 М КБ (рН 7.2) - 2-4 ч. Провести замораживание - высушива­ние. Приготовить для СЭМ.

19.3.1. Выявление цитоскелета эндотелия

   Промыть сосуды раствором Хэнкса (средой 199) с гепарином (10 ЕД/мл) - 1 мин. Перфузировать сосуды 1%-ным раствором Тритона Х-100 на ЦСБ (см. Приложение, 19.3.2) - 5 мин. Пер­фузировать 2%-ным раствором ГА на ЦСБ - 2 мин, а затем 2%-ным раствором ГА на растворе Хэнкса - 5 мин. Подготовить для СЭМ.

19.3.2. Цитоскелетстабилизирующие буферы (ЦСБ) (см: [22])

   Раствор А (ммоль/л): 137 NaCl, 5 КСl, 2 MgCl2, 2 ЭГТА, 5 имидазола, 4000 глицерина (рН 6.8, t=20®С).
   Раствор Б (ммоль/л): 1 ЭГТА, 4% ПЭГ-6000, 100 ПИПЕС (рН 6.9).
   Раствор В (ммоль/л): 1 ГТФ, 1 MgSO4, 2 ЭГТА, 100 ПИПЕС (рН 6.85).
   Раствор Г (ммоль/л): 10 ПИПЕС, 100 NaCl, 3 MgCl2, 1 ЭГТА (рН6.7)[92].
   Раствор Д (ммоль/л): 100 ПИПЕС, 1 ЭГТА, 0.0015% феноло­вого красного, 4% ПЭГ-4000 (рН 6.9) [92].
   Раствор Е (ммоль/л): 30 ГЕПЕС, 70 КСl, 5 MgCl2, 3 ЭГТА, 0.01 таксола, 0.25% ФМСФ (рН 7.0) [92].

19.3.3. Диссоциирующий раствор

   Состав (ммоль/л): 1% Тритона Х-100,80 КСl,5 MgCl2, 3 ЭГТА, 30 ГЕПЕС (рН 7.2); диссоциация длится 10 мин (t=0®С) [22].

19.3.4. Фиксатор для сохранения цитоскелета после диссоциации с помощью Тритона Х-100

   Приготовить на 0.1 М ФБ (рН 7.4) 2%-ный раствор ГА, доба­вить 50 ммоль/л лизинхлорида (t=23®С). Фиксировать 45 мин.

19.4. Обнажение скрытых поверхностей клеток

   Фиксировать объекты в 1%-ном растворе 40 на 0.2 М КБ (рН 7.2) в течение 3-5 ч (t=4®С). Промыть водой. Обработать 1%-ным раствором борной кислоты -5ч (если дольше, то может повреждаться плазмалемма). Через каждые 1-2 ч проводить из­мельчение с помощью медленно вращающегося гомогенизатора или стеклянной палочки. Суспензию налить на слой желатины, дать отстояться 5-10 мин. Жидкость удалить. Обработать осадок 2%-ным раствором ГА. Подготовить для СЭМ.

19.5. Выявление эластического каркаса с помощью муравьиной кислоты

   Фиксировать сосуд перфузией 4%-ного раствора ФА в течение 10 мин и оставить в том же фиксаторе на 12-24 ч. Удалить адвентицию, жировую ткань. Поместить колечки сосуда длиной 1 мм в 88%-ный раствор муравьиной кислоты (t=45®С) на 24-216 ч (кусочки становятся прозрачными и отечными). Тщательно от­мыть в 0.002 М растворе НСl до тех пор, пока кусочки не приобре­тут первоначальные размеры (нельзя использовать нейтральный буфер). Заморозить и лиофилизировать при давлении 10-6 Торр (1.33"10-4 Па) в присутствии поглотителя паров воды (пятиокись фосфора). Подготовить для СЭМ.

19.6. Выявление неклеточных структур в костях

   Фиксировать объекты 2%-ным раствором ГА в течение 24 ч. Обработать 4%-ным раствором ЭДТА, содержащим 3.5% сахаро­зы, - 16 ч. Фиксировать 2%-ным раствором ГА - 8 сут. Обработать 5 М раствором КОН (t=60®С) - 8 мин, а затем 2%-ным раство­ром ТК - 30 мин. Промыть водой. Постфиксировать 2%-ным рас­твором ЧО. Обезводить. Подготовить для СЭМ.

19.7. Визуализация базальных мембран

   Обработать нефиксированные тонкие (размером менее 1 мм) кусочки органа 0.01 М раствором ЭДТА - 8-12 ч (t=4®С). Интенсивно отмыть водой. Обработать 3%-ным раствором Три­тона Х-100 - 6-8 ч. Промыть водой. Обработать 4%-ным раство­ром дезоксихолата натрия с добавлением 0.1% азида натрия (t=20®С, встряхивать) - 6-8 ч. Для получения ровных краев пре­парата рекомендуется последующее криоскалывание. В органах с хорошо развитой стромой метод "работает" неудовлетворительно.
  

20. СЭМ КОРРОЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ

   Промыть сосуды солевым раствором с добавлением 10 ЕД/мл гепарина - 1-2 мин. Провести перфузионную фиксацию 0.5%-ным раствором ГА - 3 мин (можно исключить). Ввести в исследу­емую полость (например, в сосуды) инъекционную массу. Поме­стить животное (орган) в воду (t=60®С) для завершения поли­меризации на 2 ч. Мацерировать объект в 20%-ном растворе NaOH в течение 2 ч (t=60®С). Промыть водой. Мацерировать объект в 8 М НСl (можно исключить) - 1 ч (t=40®С). При необ­ходимости мацерацию и промывание повторить. Промыть водой, высушить на воздухе. Напылить проводящий слой и просмотреть в СЭМ.
   Состав смолы Батсонс 17 (Batson's 17): мономер - 200 мл, ка­тализатор - 24-40 мл, промотер (С) - 24 капли, состав отвердевает через 45-120 мин.
  

21. МАРКЕРЫ В ЭМ

21.1. Приготовление КЗ

   Вариант 1. Приготовить растворы А-Е.
   Раствор А: тщательно вымыть посуду (лучше использовать силиконизированное или специальное стекло); вскрыть ампулу с HAuCl4 и немедленно перенести в соответствующее количество бидистиллированной воды, чтобы получился 1%-ный раствор (этот раствор хранится в абсолютной темноте при t=4®С).
   Раствор Б: приготовить 1%-ный раствор цитрата натрия (ex tempore).
   Раствор В: приготовить 1%-ный раствор ТК (ex tempore). Раствор Г: приготовить 0.025 М раствор К2СО3. Раствор Д: слить 1 мл раствора А и 79 мл бидистиллирован­ной воды.
   Раствор Е: слить 4 мл раствора Б, X мл раствора В и (16 - X) мл раствора Г, долить бидистиллированной водой до 20 мл.
   Нагреть растворы Д и Е до t=60®С и влить раствор Е в рас­твор Д, интенсивно перемешивая. Поднять температуру до 100®С и оставить с обратным холодильником на 30 мин. При увеличе­нии X с 0.1 до 5 мл размеры частиц КЗ уменьшаются с 10 до 3.5 нм. Для измерения частиц КЗ на сеточку с подложкой капают раствор КЗ, высушивают и просматривают в ТЭМ.
   Вариант; 2. Приготовить 0.01%-ный раствор HAuCl4 и 1%-ный раствор трехзамещенного цитрата натрия на бидистиллированной воде. Нагреть до кипения 100 мл раствора золотохлористоводород-ной кислоты и при перемешивании к нему добавить 2.5 мл рас­твора цитрата натрия. Через 25 с кипящая смесь приобретает серовато-синий цвет (начало коллоидообразования), еще через 2 мин она становится оранжево-красной (образование монодис­персных сферических коллоидных частиц диаметром 15 нм). Если внести в кипящий раствор HAuCl4 не 25 мл, а 4 мл цитрата на­трия, то размер частиц будет не 15 нм, а соответственно 40 нм. Во всех случаях желательно проверить монодисперсность полученно­го золя и диаметр коллоидных частиц с помощью ТЭМ.
   Свежеприготовленный раствор КЗ имеет рН 55. Коррекцию рН проводят с помощью 0.2 М раствора К2СО3 или 0.1 М раство­ра Н3РО4. Перед регулированием рН к каждым 10 мл золя необ­ходимо прибавить 2 капли 1%-ного раствора ПВП.

21.2. Конъюгирование IgG с КЗ

   Адсорбировать 4 мл антисыворотки на 2 мл активированного геля Сефарозы, с которым связаны кроличьи иммуноглобулины (t=20®С). Гель промыть ФБФР, и противокроличьи иммуногло­булины элюировать с помощью 4 мл 3 М раствора KCNS. Концен­трацию белка довести до 1 мг/мл, п раствор диализировать про­тив 0.002 М раствора буры (рН 9.0). Агрегаты IgG можно отцентрифугировать (50 тыс. g , 30 мин). Агрегация уменьшается, если увеличить разведение и рН. Добавить к 30 мл раствора КЗ (12 нм) с рН больше 9.0 антисыворотку, причем ее количество должно превышать точку стабилизации на 10%. Через 1 мин добавить со­ответствующий объем 10%-ного раствора БСА, чтобы получить конечную концентрацию 0.25% для стабилизации частиц КЗ. От-центрифугировать при 50000 g в течение 45 мин. Осадок будет со­стоять из нижнего компактного слоя и верхнего рыхлого. Надосадочную жидкость аккуратно слить. Верхний (рыхлый) слой ресуспензировать в оставшемся супернатанте. Отцентрифугировать в градиенте плотности (10.5 мл, длина 8 см) сахарозы (10-30%), приготовленной на ТБФР (см. ниже) (рН 8.2) в течение 30 мин (20 тыс. об./мин). Комплекс IgG с КЗ хранится в течение нескольких месяцев, если добавить 0.02% азида натрия (t=4®С), или его порции могут быть заморожены и храниться при t=-70®С.
   Физраствор, забуференный Трис (ТБФР): приготовить раствор, содержащий 10 ммоль/л Трис и 150 ммоль/л NaCl (рН 8.2).

21.3. Конъюгирование протеина А с КЗ

   Довести рН взвеси частиц КЗ (15 нм) до рН 5.5-6.0. Затем 10 мл взвеси добавить к такому объему профильтрованного через миллипоровый фильтр раствора протеина А, который содержит 0.3 мг этого вещества (нельзя раствор протеина А вливать в рас­твор КЗ - могут образоваться агрегаты). Полученный раствор цент­рифугировать в ультрацентрифуге при 25000 об./мин (t=4®С), используя ротор Тисо. Если размер частиц КЗ соответствует 5 нм, то центрифугирование осуществляется при 40000 об./мин в течение 1 ч, а если 40 нм - то при 15000 об./мин - 30 мин. После окон­чания ультрацентрифугирования в пробирке образуются три фа­зы: 1) вверху чистый супернатант, содержащий свободный проте­ин А; 2) ниже темно-красный седимент - комплекс КЗ с протеи­ном А; 3) темное пятно на стороне пробирки около дна -металлическое золото, не стабилизированное протеином А. Седи­мент растворить в 1.5 мл 0.01 М ФБФР (рН 7.3), содержащего 0.02% ПЭГ-20000 (вместо ПЭГ можно использовать сывороточ­ный альбумин), и хранить при t=4®С. Конечная адсорбция рабочего раствора равна 0.5 при 525 нм. Перед мечением образо­ванные во время хранения агрегаты надо удалить 5-минутным центрифугированием при низкой скорости (3500 об./мин). Комп­лекс КЗ с протеином G приготовить тем же способом, но рН дол­жен быть равен 5.0, а ПЭГ лучше добавлять в конце очистки при ресуспензировании комплекса.
  

21.4. Серебряное усиление

   Вариант 1. После иммуномечения УС промывают 3 раза по 10 мин в том буфере, который использовался для разведения анти­тел, затем промывают в бидистиллированной воде или разведен­ном (0.02 М) Na-цитратном буфере 5 раз по 1 мин. Для того что­бы избежать потери метки, УС желательно постфиксировать с по­мощью 05-2.0%-ного раствора ГА - 10-15 мин. Вновь промыть в бидистиллированной воде - 10-45 мин. УС покрыть 0.05%-ным раствором желатины и высушить. Желатина предупреждает выпа­дение аутокаталитических преципитатов из проявителя, уменьша­ет зерно. Стекла должны быть очень чистыми. Всю процедуру же­лательно проводить при красном свете.
   После обработки в проявителе УС тщательно промыть в биди­стиллированной воде. Покрытые желатиной срезы в течение 45 мин промыть в теплой (t=40®С) воде для удаления слоя же­латины и сполоснуть в бидистиллированной воде.
   Вариант 2. После окрашивания комплексом стрептавидина с КЗ препарат отмыть в воде для удаления ионов серебра. Затем промыть в разведенном в 50 раз растворе А. Погрузить на 10 мин без встряхивания в свежеприготовленный раствор Г (проявитель). Промыть в воде. Закрепить в течение 5 мин в подходящем фик­саже, разведенном водой (1:5). Тщательно промыть в воде. Поте­ря частиц КЗ во время усиления серебром может быть предупреж­дена путем дополнительной фиксации в 1%-ном растворе ГА по­сле иммуноинкубации.
   Раствор А: в 100 мл воды растворить 11.7 г дигидрата трехзамещенного цитрата натрия и 12.75 г моногидрата лимонной кислоты.
   Раствор Б: в 7.5 мл воды растворить 0.055 г лактата серебра.
   Раствор В: в 7.5 мл воды растворить 0.425 г гидрохинона.
   Раствор Г: смешать 10 мл раствора А, 7.5 мл раствора Б, 75 мл раствора В, 25 мл воды (защищать от света).

21.5. Серебряное усиление после реакции на ПХ

   Отмыть объект в ФБФР. Проинкубировать в течение 4 ч в 10%-ной тиогликолевой кислоте. Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 10 мин. Проинкубировать в усилителе (см. Приложение, 21.5.1.) с постоянным (через каждые 5-10 мин) просмотром в СМ для определения времени окончания реакции. Сполоснуть в 1%-ной уксусной кислоте (стоп-ванна). Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 5 мин. Проинкубировать в 0.05%-ном растворе хлорида золота - 3-10 мин. Промыть в 3%-ном растворе тиосульфата на­трия - 5 мин. Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 5 мин. Об­работать в ЧО и подготовить для ТЭМ.

21.5.1. Усилитель коллоидного золота

   Вариант 1. Смешать 60 частей раствора А, 10 частей раствора Б, 15 частей раствора В, 15 частей раствора Г. Проявитель про­фильтровать через Ватман N 4. Обрабатывать в темноте в течение 5 мин.
   Раствор А: 1 кг гуммиарабика с помощью магнитной мешалки растворить в 2 л деионизированной воды (использовать только чистую посуду), затем профильтровать через несколько слоев мар­ли и хранить в пластиковых бутылях при t=-20®С.
   Раствор Б: 25.5 г лимонной кислоты и 236.0 г безводного цит­рата натрия растворить в воде, объем довести до 100 мл (рН 7.4).
   Раствор В: в 15 мл деионизированной воды растворить 0.85 г гидрохинона.
   Раствор Г: 0.11 г нитрата серебра растворить в деионизирован­ной воде, объем довести до 15 мл, серебро в усилитель добавить непосредственно перед использованием (в темноте).
   Вариант 2. Фотоэмульсию (например, L4) растворить до кон­центрации 40 мг/мл в проявителе следующего состава: метол -0.075 г, безводный сульфит натрия - 0.05 г, тиоцианат натрия -0.02 г, бидистиллированная вода - 10 мл (рН 6.3).
   Вариант 3. Приготовить на на 0.01 М цитратном буфере рас­твор, содержащий 0.6% ацетата серебра, 0.8% гидрохинона, 15% гуммиарабика. Проявлять 2-5 мин.
   21.6. Усиление никелем реакции на пероксидазу для СМ
   В 30 мл 0.05 М ацетатного буфера (рН 6) растворить 6-7 мг ДАБ и 0.45 г сульфата никеля-аммония. Перемешать и добавить 10 мкл 30%-ной перекиси водорода. Профильтровать. Использо­вать в течение 6-7 мин. Промыть. Высушить.
  
   ЛИТЕРАТУРА
  
   1.Аглинцт Т.С., Мартиросян Д.А. Метод плоско-параллельной заливки в эпоксидные смолы срезов тканей и пленчатых препаратов: Метод, реко­мендации. Ереван, 1982.
      -- Алиев Г.М., Миронов А.А. // Арх. патологии. 1991. Т.53, N 3. С.ЗО.
      -- Андриеш В.Н. и др. Способы подготовки секционного, биопсийного и экспериментального материала для комплексного морфологического исследо­вания: Метод, рекомендации. Кишинев, 1984.
   4.Арутюнов В.Д. и др. Методические возможности сканирующей электронной микроскопии при изучении органа-ткани-клетки. М., 1979. Рукопись деп. в ВИНИТИ. 1.105.79. N 1079-79 Деп.
   5.Атлас сканирующей электронной микроскопии клеток, тканей и органов Под ред. О.В.Волковой и др. М., 1987.
   6.Балашов Ю.С., Леонович С.А. Методы применения растровой электронной микроскопии в зоологии. Л., 1984.
   7.Банин В.В. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. Т.85, N8. С.67.
      -- Белое Л.Н. и др. // Цитология. 1975. Т.17, N 11. С.1332.
      -- Бирюзова В.И. и др. Электронно-микроскопические методы исследования биологических объектов. М., 1963.
   10.Бобрик И.И. и др. Методические рекомендации: сканирующая электронная микроскопия коррозионных анатомических препаратов. Киев, 1986.
   11.Боголепов Н.Н. Методы электронно-микроскопического исследования мозга. М., 1976.
   12.Бухвалов И.Б. и др. // XIV конф. по электронной микроскопии (биология, медицина): Тез. докл. М., 1992. С.6.
   13.Вакулин Г.М. II XIII Всесоки. конф. по электронной микроскопии (биология и медицина): Тез. докл. М., 1988. С.21.
   14.Втюрин Б.В., Пальцын А.А. Современные методы и приемы электронно-микроскопического исследования биологических объектов: электронно-микроско­пическая радиоавтография и растровая электронная микроскопия. М., 1985.
      -- Гайер Г. Электронная гистохимия. М., 1974.
      -- Гольдин Л.С. Основы гистологической техники электронной микроскопии. М., 1963.
      -- Гребное Л.М. Электронная микроскопия: Учеб. пособие. Пермь, 1984.
      -- Григорьев В.В. и др. // XIV конф. по электронной микроскопии (биология, медицина): Тез. докл. М., 1992. С.20.
   19.Караганов ЯЛ. и др. // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1981. Т.81, N 8. С.5.
      -- Караганов ЯЛ. и др. // Арх. патологии. 1982. Т.44, N 2. С.63.
      -- Караганов ЯЛ. и др. // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. Т.84, N 6. С.5.
   22.Караганов ЯЛ. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983.Т.85, N 12. С.5.
   23.Караганов ЯЛ. и dp*. 11 Арх. анатомии, гистологии иэмбриологии. 1986. Т.90, N 1. С.93.
   24.Караганов ЯЛ. и др. // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986.Т.90, N 3. С.83.
   25.Карелина Н.Р. и др. Современные методы электронно-микроскопическогоисследования в морфологии. Л., 1986.
      -- Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев, 1984.
      -- Качалка О.В. // Арх анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986. Т.90, N5.С.63.
   28.Киселева А.Ф и др. Морфофункциональные методы исследования в норме ипри патологии. Киев, 1983.
   29.Козинец Г.И. и др. Метод сканирующей электронной микроскопии в гемато-логии: Метод, рекомендации. М., 1982.
   30.Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток перифе­рической крови в норме и при заболеваниях системы крови. Таллин, 1984.
   31. Колпаков В.А. и др. // Арх. патологии. 1992. Т.54, Н® L. С.68.
   32.Кошссарчик Я.Ю., Миронов АА Электронная микроскопия клеток и тканей:замораживание-скалывание-травление. Л., 1990.
   33.Кошссарчик ЯЮ., Снигиревская Е.С. II VIII Всесоюз. конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. М., 1971. С.195.
   34.Королев Её. IJ XIV конф. по электронной микроскопии (биология, медицина): Тез. докл. М.. 1992. С. 10.
   35.Кортуков Е.В. и др. 11 X Всесоюз. конф. по электронной микроскопии:Тез. докл. М., 1976. С.16.
   36.Костиленко ЮЛ., Ковалев КВ. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1978. Т.75, N 12. С.68.
   37.Лившиц В.Л. Метод ориентирующего маркирования светооптических препаратов с целью идентификации клеток, избранных для сагиттальной ультратомии. М., 1985. Рукопись деп. в ВИНИТИ. 23.10.85. N 3486-85 Деп.
      -- Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., 1969.
      -- Луцик М.Д. и др. Лектины. Львов, 1981.
      -- Макарова НЖ // Цитология. 1990. Т.32, N 1. С.1106.
      -- Манохина М.С, Бахтыбаев О.Е. // Арх. патологии. 1978. Т.40, N 11. С.66.
      -- Миронов АА / J XIV конф. по электронной микроскопии (биология, меди-цина): Тез. докл. М., 1992. С.11.
   43.Миронов АА, Миронов В.А / / XII Всесоюз. конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. М., 1982. С.271.
   44.Миронов АА, Миронов В.А // XXXVII Всесоюз. науч.сессия, посвященная Дню Радио: Тез. докл. М., 1982. 4.2. С.123.
   45.Миронов АА, Миронов В.А // Изобретательство и рационализация в медицине. М., 1983. С.11.
   46.Миронов АА, Миронов В.А /1 Всесоюз. симпоз. "Криогенные методы в электронной микроскопии". Пущино, 1985. С.70.
   47.Миронов АА, Миронов В.А / / (К Всесоюз. симпоз. "Структура и функции клеточного ядра": Тез. докл. Черноголовка, 1987. С.24.
   48.Миронов АА и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983.Т.85, N 11. С.85.
   49.Миронов АА и др. 17 Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1989. Т.97, N 8. С.69.
   50.Миронов В.А, Миронов АА // Цитология и генетика. 1985. Т.19, N 1.С.5.
   51.Миронова В.А, Миронов Р.П. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1978. Т.75, N 11. С.98.
   52.Панова Л.А Адсорбционная электронно-микроскопическая авторадиография в изучении структурно-функциональных свойств клеток энтеробакте-рий: Автореф. дис.... канд.биол. наук. Иваново, 1983.
      -- Пиз Д. Гистологическая техника в электронной микроскопии. М., 1963.
      -- Полак Дж ., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М., 1987.
   55.Полянская Л.И. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1990.Т.98, N 5. С. 14.
   56.Пушкарь Н.С., Капрельянц АС. Введение в электронно-микроскопическую технику для медико-биологических исследований. Киев, 1982.
   57.Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ / Под ред. Д. Гольдстейна. М., 1984. Кн. 1 и 2.
      -- Ратнер О.Н. и др. // Арх. патологии. 1991. Т.53, N 5. С.71.
      -- Рехтер М.Д. и др. II Арх. патологии. 1992. Т.54, N 1. С.65.
      -- Рехтер М.Д. и др. // Цитология. 1992. Т.34, N 1. С.24.
      -- Рехтер М.Д., Миронов АА / / Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1989. Т.96, N 3. С.77.
   62.Рехтер М.Д., Миронов АА // Успехи соврем, биологии. 1990. Т.109, N 3.С.467.
   63.Рикберг АБ. и др. Метод изучения индивидуальных клеток в световом микроскопе и РЭМ. Киев, 1983. (Препринт / Ин-т физики АН УССР; N 17).
   64.Рикберг АБ. и др. Лазерная маркировка клеток для световой и электронной микроскопии. Киев, 1985 (Препринт / Ин-т физики АН УССР).
   65.Ровенский Ю.А Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М., 1979.
      -- РукосуевВ.С, Кашнус Л.Н. // Арх. патологии. 1979. Т.41, N 5. С.64.
      -- Соланина OA Функциональная морфология артериального эндотелия крыс в ранние периоды постнатального онтогенеза: Автореф. дис. канд.биол. наук. М., 1990.
   68.Саркисов Д.С. и др. Электронно-микроскопическая радиоавтография клетки. М., 1980.
      -- Свиткина Т.М., Васильев ЮМ. // Цитология. 1986. Т.28, N 1. С.38.
      -- Соколов BJL и др. Руководство по изучению кожного покрова млекопитающих.М., 1988.
      -- Трутное ИМ. и др. /I Арх. патологии. 1977. Т.39, N 2. С.69.
      -- Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М., 1975.
      -- Улитина ЕД., Юж аков ВЛ. // Арх. патологии. 1990. Т.52, N 4. С.63.
      -- Филиппенко В.Н. // Цитология. 1979. Т.41, N 10. С.1226.
      -- Фихте Б\А и др. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронно-микроскопических исследований (криофрактография и ионное травление): Метод, пособие. М., 1973.
   76.Хатанова И.А Введение в просвечивающую электронную микроскопию твердых тел и биологических объектов. М., 1983.
   77.Хомутовский OA. и др. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. Киев, 1986.
      -- Хохлов СЕ И Цитология. 1979. Т.21, N 10. С.1229.
      -- Хохлов СЕ, Шилов ВА. // Цитология. 1972. Т. 14, N 5. С.678.
      -- Шахламов В.А, Буравков СВ. / / Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1983. Т.84, N 4. С.95.
      -- Шиммель Г. Методика электронной микроскопии. М., 1972.
      -- Acetarin J.-D. et al // J. Electron Microsc. Techn. 1987. Vol.6. P.63.
      -- Afzelius BA. И Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.65.
      -- Akahori H. et al // J. Electron Microsc. 1988. Vol.37. P.351.
      -- Alman L et aL // J. Histochem. Cytochem. 1984. Vol.32. P.1217.
      -- Amemiya T. // Acta anat. 1984. Vol.120. P. 108.
      -- Baigent CL, Muuer G. // J. Microsc. 1990. Vol.158. P.73.
      -- Bancroft J.D. et aL Theory and practice of histological techniques. Edinburg etc.,
      -- Beats T.FJr. И Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.87.
      -- Bell P.BJr. 11 Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Mahwah, 1984. P.45.
      -- BellP.BJr. etal JI 1. Electron Microsc. Techn. 1987. Vol.7. P.149.
      -- BellPMJr. et aL 11 Scanning Micirasc. 1988. Vol.2. P.1647.
      -- Bendayan M. /J Colloidal gold: 'Principles, methods and applications / Ed.MA. Hayat. San Diego etc., 1989. Vol.2. P.117.
      -- Benichou J.C et aL // J. Electron Microsc. Techn. 1990. Vol.14. P.289.
      -- Bergeron M., ThieryG. 11 Biol. Cell. 1981. Vol.42. P.43.
      -- Berod A et aL // J. Histochem. Cytochem. 1981. Vol.29. P.844.
      -- Berryman M.A., Rodewald АЛ //J. Histochem. Cytochem. 1990. Vol.38. P.159.
      -- BertOSSiM. et aL 11 J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1992. Vol.24. P.215.
      -- Binder M. // Scanning Microsc. 1987. Vol.1. P.331.
      -- Bonn W. et aL // Scanning Microsc. 1987. Vol.1. P.319.
      -- Boon M.E, Kbk LP. Microwave cookbook of pathology. The art of microscopic visualization. 2nd ed. Leiden, 1988.
      -- Boonstra J. et aL 11 J. Microsc. 1991. Vol.161. P.135.
      -- Boorsma D.M. // Immunocytochemistry. 1983. Vol.2. P.156.
      -- Boyles J. et aL // J. Histochem. Cytochem. 1985. Vol.33. P.1116.
      -- Bozzola JJ., Russell LD. Electron microscopy: Principles and techniques forbiologists. Boston, 1992.
      -- BroadwellR.D., Brightman M.W. //Meth. Enzymol. J983. Vol.103. P.187.
      -- Budd G.C., PanskyB. // Micron microsc. acta. 1985. Vol.16. P.189.
      -- Cajander S.B. // J. Microsc. 1986. Vol.143. P.265.
      -- Carleman E, Viltiger W. // Techn. Immunocytochem. 1989. Vol.4. P.29.
      -- Carlson EC, KenneyM.C // J. Morphol. 1982. Vol.171. P.195.
      -- Carpentier J.-L et aL // J. Cell Biol. 1985. Vol.101. P.887.
      -- CastenholzA. et aL I f Mikroskopie (Wein). 1982. Bd 39. S.95.
      -- CavicchlaJ.C et aL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.20. P.34.
      -- Chaudhuri S. et al I j J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P.57.
      -- ChUds G.V. И Amer. J. Anat. 1986. Vol.176. P.125.
      -- Cnilds G.V. et aL // Amer. J. Anat. 1986. Vol.175. P.307.
      -- Christensen AJC, Komorowski T.E //J. Electron Microsc. Techn. 1985. Vol.2.P.497.
      -- Christensen M.M. et aL // Histochemistry. 1992. Vol. 97. P.207.
      -- Corneas J.F. etal // Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed.R-Harris. Oxford, 1991. P.125.
      -- Costello M.J. et aL II Science of biological preparation / Eds S.A. Bhatt et al. Mahwah, 1984. P.105.
   121.Crang RF.E, Klomparens KL Artifacts in biological electron microscopy. New York; London, 1988.
      -- CrissmanRS. // Amer. J. Anat. 1986. Vol.175. P.481.
      -- CrlssmanRS., Pakulski LA. // Stain Technol. 1984. Vol.59. P.171.
      -- CHveilato EetaL/j Ztschr. mikrosk.-anat. Forsch. Leipzig. 1990. Bd 104. S.769.
      -- Curtin W.A., Seville WJ. // J. Electron Microsc. 1990. Vol.39. P.191.
      -- Darby I. et aL // Lab.Invest. 1990. Vol.63. P.21.
      -- David H. // Acta histochem. 1989. Vol.85. P.155.
      -- DaviesP.F., Mackle ZM. // Analyt. Biochem. 1981.Vol.115. P.ll.
      -- De Groot DM. // J. Microsc. 1988. Vol.151. P.23.
      -- DeyS. etaL // J. Microsc. 1989. Vol.156. P.259.
      -- Dickson. C.P., Robinson T.F. // Histochemistry. 1988. Vol.89. P.105.
      -- Ding B. et aL // J.Microsc. 1992. Vol.165. P.367.
      -- DoreB. etaL // Basic. Appl. Histochem. 1991. Vol.35. P.38.
      -- Dubochet /., McDowalkl A.W. II Science of biological preparation / Eds S.A.Bhatt et al. Mahwah, 1984. P.147.
      -- Dvorak AM. // J.Electron Microsc.Techn. 1987. Vol.6. P.255.
      -- Dwivedi A.K et aL // Biotechn. Histochem. 1991, Vol.66. P.225.
      -- Edwards HJt. etaL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.39.
      -- Eldred W.D. et aL j) J. Histochem. Cytochem. 1983. Vol. 31. P.285.
      -- Electron microscopy in human medicine: Instrumental on and techniques / Ed.J.VJohannessen. New York etc., 1978. Vol.1.
   140.Elgsaeter A. et aL II Science of biological preparation / Eds SA.Bhatt et al.Chicago, 1984. P.195.
      -- Erickson РЛ. etaL 11 I. Electron Microsc. Techn. 1987. Vol.5. P.303.
      -- Erkandsen S.L et aL // Scanning. 1989. Vol.11. P.169.
      -- EvanA.P. I) Biomed. Res. 1981. Vol.2. P.119.
      -- Evan A.P. et aL // Anat. Rec. 1976. Vol.185. P.433.
      -- Fanning J.C. et aL // J. Microsc. 1991. Vol.162. P.355.
      -- Field E et aL // Stain Technol. 1965. Vol.40. P.295.
      -- Finch G. et aL // J. Electron Microsc. Techn. 1985. Vol.2. P.69.
      -- Fox CM. etaL // J. Histochem. Cytochem. 1985. Vol. 33. P.845.
      -- Frank J. et aL // J. Electron Microsc. Techn. 1987. Vol.6. P.193.
      -- Fredriksson B.-A., LindrothM. // Micron microsc. acta. 1992. Vol.23. P.83.
      -- Fujikawa S. // J. Electron Microsc. 1990. Vol.39. P.80.
      -- Fujikawa S. 11 Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed.RHarris. Oxford, 1991. P.173.
      -- Fujiwara Т., Uehara Y. // J. Electron Microsc. 1980.Vol.29. P.397.
      -- GlauertJ. // Microscopy. 1989. Vol.154. P.189.
      -- Glauert AM., Young RD //J. Microsc. 1989. Vol.154, pt.2. P.101.
      -- Glauert AM., HallC. // Europ. Microsc. Analys. 1991. N 9. P.13.
      -- Gomez A. et aL // Acta histochem. 1991. Vol.90. P.115.
      -- Gornsky G., Borisy G.G. //J. Histochem. Cytochem. 1986. Vol.34. P.177.
      -- Graham RC, KdrnovskyMJ. //J. Histochem. Cytochem. 1966. Vol.14. P.291.
      -- Griffin RE Ultratomy. London, 1972.
      -- Griffiths G. 11 Science of biological preparation / Eds SA.Bhatt et al. Chicaeo,1984. P.153.
      -- Griffiths G. et aL // J. Ultrastruct. Res. 1984. Vol.89. P.65.
      -- Griffiths G. et aL // Meth. Enzymol. 1983. Vol.96. P.466.
      -- Grote M. j j Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.242.
      -- Gunning W.T., Crang RE // J. Electron Microsc. Techn. 1984. Vol.1. P.131.
      -- Haggis G.H., Phipps-Todd B. // J. Microsc. 1977. Vol. 111. P.193.
      -- Haggis G.H. // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.22. P.151.
      -- Hamkalo BA. et aL I j Amer. J. Anat. 1989. Vol.185. P.197.
      -- HandleyRA. I/ Colloidal gold: Principles, methods and applications / Ed.MA.Hayat. San Diego etc., 1989. Vol.1. P.l.
      -- Hanyu Y. etaL И I. Microsc. 1992. Vol.165, pt.2. P.255.
      -- Harlow E, Lane D Antibodies: a laboratory manual. New York, 1988.
      -- Harris J.R // J. Electron Microsc. Techn. 1991. Vol.18. P.269.
      -- Harris R, Home R / / Electron microscopy in biology: A oractical approach / Ed.RHarris. Oxford, 1991. P.203.
      -- Hart M.L etal // Scanning Electron Microsc. 1978. Vol. 1. P.21.
      -- Harven К de // Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H. Planner.Boca Raton (Flor.), 1989. P.283.
      -- Hawkins H.K etal // Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.61.
      -- Hayat M.A. Principles and techniques of electron microscopy: Biological application. 2nd ed. Baltimore (Maryland), 1981. Vol.1.
      -- Hayat МЛ. Fixation for electron microscopy. New York etc., 1981.
      -- Hayat M.A. Principles and techniques of electron microscopy: Biological application. New York, 1989.
      -- Hegele-Hartu.ngC.etal 11 Acta anat. 1989. Vol.136. P.79.
      -- HegerlR // Europ. J. Cell Biol. 1989. Vol.48. P.135.
      -- Hettiam C. et al j j J. Cell Biol. 1982. Vol.93. P.357.
      -- Henstra S., Schmidt LXG. // Naturwissenschaften. 1970. Bd 57. S.247.
      -- Herrera G.A. // Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.37.
      -- Herrera G.A. // Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.71.
      -- Heumann H.-G. 11 Histochemistry. 1992. Vol.97. P.341.
      -- HeuserJ.E // Prog. Clin. Biol. Res. 1989. Vol.295. P.71.
      -- Hicks Д, Molday RS. / / Science of biological specimen preparation / Eds J.-P.Revel et al. Chicago, 1984." p.203.
   189.Hind J.V., Phillips J.I. I Proc. 23th Annu. Congr. Electron Microsc. Soc. S. Afr. 1984. Vol.14. P.109..
   190.Hirabayashi Y., Wamada К // Ztschr. mikrosk.-anat. Forsch. Leipzig. 1989. Bd
   103. S.90.
      -- Hodges GM. etal // Scanning Microsc. 1987. Vol.1. P.301.
      -- Hop-mod D. // Histochem. J. 1985. Vol.17. P.389.
      -- Hopwood D., Milne G. // Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. RHarris. Oxford, 1991. P.l.
      -- Horlsberger M., Clere M.-F. // Histochemistry. 1988. Vol.90. P.165.
      -- Hotta Y. etal // J. Electron Microsc. 1990. Vol.39. P.63.
      -- Hrouda G. II Mikroskopie (Wien). 1985. Bd 42. S.315.
      -- Hulser D.F. et al // Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H.Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P.33.
   198.Hulstaert C.E. et al. / / Techniques in diagnostic pathology / Ed. G.R Bullock.London, 1989. P.133.
      -- Humphreys WJ., Henk W.G. Ц J. Microsc. 1979. Vol.116, pt.2. P.255.
      -- Humphreys WJ. etal // Scanning Electron Microsc. 1979. Vol.2. P.345.
      -- Hyatt A.D. II Electron microscopy in biology. A practical approach / Ed.RHarris. Oxford, 1991. P.59.
   202.Ingram F.Dl, Ingram M.J. // Science of biological specimen preparation / EdsSA. Bhatt et al. Chicago, 1984. P. 167.
      -- Inokuchi T. et aL // J. Electron Microsc. 1989. Vol.38. P.201.
      -- Inoue T. // J. Electron Microsc. 1982. Vol.31. P.261.
      -- Inoue T. et aL // J. Electron Microsc. 1989. Vol.3S. P.246.
      -- ItoEetaL // Acta cytol. 1988. Vol.32. P.588.
      -- Jiao R et aL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.23.
      -- Jingujt Y., Ishikawa H. // J. Electron Microsc. 1990. Vol.39. P.59.
      -- Johnson RE, Cantino M.E // Advanced techniques in biological electronmicroscopy / Ed. J.K. Koehler. Berlin etc., 1986. Vol.3. P.73.
      -- Jones RB. 11 Scanning Electron Microsc. 1982. Vol.2. P.805.
      -- Jones L\B. И Lab. Invest. 1985. Vol.52. P.453.
      -- Jones D.B. I/ Anat. Rec. 1985. Vol.213. P.121.
      -- Kaeser W. // J.Microsc. 1989. Vol.154. P.273.
      -- Kan F.W.K, Nanci A. // J. Electron Microsc. Techn. 1988. Vol.8. P.363.
      -- Karaganov Ya.L. et aL // Ztschr. mikrosk.-anat. Forsch. Leipzig. 1982. Bd 96.S.995.
      -- KatohM. Ц1. Electron Microsc. 1978. Vol.27. P.329.
      -- Kazuhiro A. et aL // J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P.113.
      -- Kellenberger E et aL // J. Histochem. Cytochem. 1987. Vol.35. P.959.
      -- KingsleyRE // J. Electron Microsc. Techn. 1991. Vol.18. P.205.
      -- KinnamonJ.C. et aL // Science of biological preparation / Eds S.A. Bhatt et al.Chicago, 1984. P.39.
      -- Kirk RG. et al // J. Microsc. 1991. Vol.161. P.445.
      -- Kok LP., Boon M.E // J. Microsc. 1990. Vol.158, pt.3. P.291.
      -- Komissarchik Ya.Yu. et aL // Acta histochem. 1981. Suppl. Bd 23. S.275.
      -- Kuo J. П J. Microsc. 1980, Vol.120, pt.2. P.221.
      -- Kushnaryov VM. et aL // Cytobios. 1988. Vol.54. P.167.
      -- Larramendi P.C.H. // J. Electron Microsc. Techn. 1988. Vol.10. P.119.
      -- Lawton J.R // J. Microsc. 1990. Vol.158. P.343.
      -- LeaPJ. etaL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.22. P.185,
      -- Le Cam Ret aL // J. Electron Microsc. 1991. Vol.18. P.375.
      -- Le Furgey A. et aL /1 J. Microsc. 1992. Vol.165. P. 191.
      -- Lee R etaL // J. Microsc. 1982. Vol.125. P.77.
      -- Leapman RD., Andrews S.B. // J. Microsc. 1991. Vol.161, pt.l. P.3.
      -- LeongA.S.-Y. I/ Pathol. Annu. 1988. Vol.23. P.213.
      -- LevisonDA. 11 J. Pathol. 1989. Vol.157. P.95.
      -- Lewis P.R, Knight HP. Cytochemical staining methods for electron microscopy: Practical methods in electron microscopy J Ed. A.M. Glauert. Amsterdam etc., 1992. Vol.14.
      -- Undley V.A. И Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.355.
      -- Lindroth M. et aL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.22. P.130.
      -- LinnerJ.G. et aL // J. Histochem. Cytochem. 1986. Vol.34. P.1123.
      -- lipostts Z. etaL 11 Neuroscience. 1984. Vol.13. P.513.
      -- Lockard KG. // Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.47.
      -- Login G.R, Dvorak AM. 11 Histochem. J. 1988. Vol.20. P.373.
      -- Login G.R et aL 11 J. Histochem. Cytochem. 1990 Vol.38. P.755.
      -- Luther P.W., BlochRJ. // J. Histochem. Cytochem. 1989. Vol.37. P.75.
      -- Lyman C.E. et aL Scanning electron microscopy, X-ray microanalysis and analytical electron microscopy: A laboratory workbook. New York, 1990.
      -- Marshall A.T. // J. Electron Microsc. Techn. 1988. Vol.9. P.57.
      -- McLean I.W., Nakane P.K // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol.22. P.1077.
      -- McMullan D. // J. Microsc. 1989. Vol.155. P.373.
      -- Mentre P., Escaig F. // J. Histochem. Cytochem. 1988. Vol.36. P.49.
      -- Mesy Jensen KL de, di SanfAgnese P. // Ultrastruct. Pathol. 1992. Vol.16. P.51.
      -- Michel M. etaL // J. Microsc. 1992. Vol.166. P.43.
      -- MiethingA. // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.73.
      -- Migheli A. etaL И Histochemistry. 1992. Vol.97. P.413.
      -- Millonig G. Laboratory manual of biological electron microscopy. Vercelli, 1976.
      -- Minaghan P., Robertson D. // J. Microsc. 1990. Vol.158, pt.3. P.355.
      -- Minda JM. etaL I / Surg. Pathol. 1989. Vol.2. P.345.
      -- Minns RJ., Steven F.S. // Micron. 1974. Vol.5. P.127.
      -- Miyai К etaL U Lab. Invest. 1976. Vol.35. P.369.
      -- Mizuhira V. etaL I j Acta histochem. cytochem. 1990. Vol.23. P.501.
      -- Monaghan P., Robertson D. / / J. Microsc. 1990. Vol.158. P.355.
      -- Monsigny M. et aL I/ Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H.Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P.239.
   261.Morel G. 11 Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. RHarris. Oxford, 1991. P.83.
      -- Morioka H. et aL 11 J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P.l.
      -- MuraiN. etaL // J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P. 123.
      -- Murakami M., Sugita A. // Cell. 1981. Vol.13. P.38.
      -- Myklebust RetaLH J. Microsc. 1975. Vol.105. P.57.
      -- NagatoT. etaL // Cell Tissue Res. 1980. Vol.209. P.l.
      -- Nagato Y. etaL И J. Electron Microsc. 1990.Vol.39. P.115.
      -- Nagele RG., Ш H. 11 J. Microsc. 1987. Vol.148. P.89.
      -- Namimatsu S. / j J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1992. Vol.24. P.19.
      -- Narayanswami S., HamkabBA. I / Cytometry. 1990. Vol.11. P.144.
      -- Nermut M.V. I j Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Chicago, 1984. P.181.
      -- Norenburg J.L, Barrett JM. // J. Electron Microsc. Techn. 1987. Vol.6. P.35.
      -- Normandin DJC 11 Trans. Amer. Microsc. Soc. 1973. Vol.35. P.381.
      -- Notoya M. et aL // Acta histochem. cytochem. 1990. Vol.23. P.525.
      -- ODormellM.D, McGeeneyKF. 11 i. Electron Microsc. Techn. 1991. Vol.19. P.486.
      -- Ohtani H. etaL // Acta histochem. cytochem. 1990. Vol.23. P.585.
      -- OrekhovAM. etaL // Acta anat. 1984. Vol.119. P.99.
      -- ParmkyRT. etaL 11 HistochemJ. 1979. Vol.11. P.379.
   279.Pavelka M., Ellinger A. / / Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H. Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P. 199.
   280.Peters K-R II Advanced techniques in biological electron microscopy / Ed. J.K. Koehler. Berlin etc., 1986. Vol.3. P.101.
      -- Piekut ИТ. 11 Amer. J. Anat. 1986. Vol.175. P.197.
      -- Pihakaskl-Maunsbach К et at // J. Electron Microsc. Techn. 1990. Vol.15. P.414.
      -- Pignot-Paintrand I. // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.21. P.75.
      -- Plattner H. 11 Electron Microscopy of subcellular dynamics / Ed. H. Plattner. Boca Raton (Йог.), 1989. P.I.
   285.Plattner H., Knoll G. // Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Chicago, 1984. P.139.
      -- Plattner H., Knoll G. // Scanning Microsc. 1987. Vol.1. P.1199.
      -- Plattner #., Zingsheim H.P. Elekrtonenmikroskopische Methodik in der Zell- und Molekularbiologie. Stuttgart, 1987.
      -- Portman IX et al jI Acta oto-laryngol. Suppl. 1990. N 470. P.7.
      -- Puvion-DutlUeul F., Puvion E // Europ. J. Cell Biol. 1989. Vol.49. P.99.
      -- Puvion-Dutilleul F., Puvton E II J. Electron Microsc. Techn. 1991. Vol.18. P.336.
      -- Rautenfeld D.B.V. et al // Acta anat. 1989. Vol.136. P.172.
      -- Read N.Dl, Jeffree C.E // J.Microsc. 1991. Vol.161. P.59.
      -- Reiss G. et aL // Progr. Clin. Biol. Res. 1989. Vol.295. P.563.
      -- Rickberg A. et aL // Scanning. 1984. Vol.6. P.183.
      -- Rlckert RR, Malinlak RM. // Arch, pathol. lab. med. 1989. Vol.113. P.673.
      -- Rts H., Pay/ley J.B. // Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H.Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P.309.
      -- Roach M.R, Song SJt. I] Scanning Microsc. 1988. Vol.2. P.993.
      -- Robards A.W., Bald W.B. // Proc. Xlth Intern. Congr. Electron Microsc. Kyoto, 1986. P.2215.
      -- Roberts J.C. etal // Ultrastr. Pathol. 1990. Vol.14. P.177.
      -- Robinson IXG. et al Methods of preparation for electron microscopy. Berlin; Heidelberg, 1987.
   301.Robinson G., GrayT. // Theory and practice of histo'jgical techniques / Eds J.D.Bancroft et al. Edinburg etc., 1990. P.525.
   302.Robinson G., GrayT. // Theory and practice of histological techniques / Eds J.D.Bancroft et al. Edinburg etc., 1990. P.563.
   303.Roomans G.M. /I 12th Intern. Congr. X-ray optics and microanalysis. Krakow, 1990. Vol.1. P.37.
   304. Roos N. N Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. R.Harris. Oxford, 1991. P.39.
      -- Rosenbauer KA. // Progr. Clin. Biol. Res. 1989. Vol. 295. P.597.
      -- RothJ. l)l. Microsc. 1986. Vol.143, pt. 2. P.125.
      -- Roth J., Taajes DJ. I/ Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H. Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P.219.
      -- RothJ. etal j) Histochemistry. 1989. Vol.92. P. 47.
      -- RothJ. et aL // Histochemistry. 1990. Vol.95. P.123.
      -- Rutter G. et aL 11 J.Histochem.Cytochem. 1988. Vol.36. P.1015.
      -- Sakata S. et aL /1 J. Electron Microsc. 1991. Vol.40. P.67.
      -- Sarphie T.G. // Exp. Mol. Pathol. 1986. Vol.44. P.281.
      -- Sasaki К j j У Electron Microsc. 1988. Vol.37. P.171.
      -- Saubermann A.J. // Scanning. 1988. Vol.10. P.239.
      -- Schmidt M.E et al // Acta anat. 1976. Vol.95. P.468.
      -- Schramm U., Kuhnel W. // Anat. Anz. 1989. Suppl.164. S.385.
      -- Schwartz E et aL j j Exp. Mol. Pathol. 1981. Vol.34. P.299.
      -- ScopsiL If Colloidal gold: Principles, methods and applications / Ed. MA. Hayat, New York,1989. Vol.1. P.251.
      -- SeversNJ./l I. Microsc. 1991. Vol.161, pt.l. P.109.
      -- Shimada T. et aL // Arch. Histol. Cytol. 1990. Vol.53. P.115.
      -- Shiraishi T. et aL // Cell Tissue Res, 1986. Vol.243. P.329.
      -- Shotton D.M. et aL // Neuroscience. 1979. Vol.4. P.427.
      -- Simionescu N., Simionescu M. // J. Cell Biol. 1976. Vol.70. P.608.
      -- Simionescu N., Simionescu M. // J. Cell Biol. 1976. Vol.70. ?.622.
      -- Simionescu N. //J. Histochem. Cytochem. 1979. Vol.27. P.l 120.
      -- Singer RH. et aL // 1. Cell Biol. 1989. Vol.108. P.2343.
      -- Singer RH. et aL I j Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1989. Vol.143. P.55.
   328.Sitte Я. // Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Chicago,1984. P.97.
      -- Sitte H. И Micron microsc. acta. 1991. Vol.22. P.291.
      -- Slayter H.S. // Electron microscopy in biology: A practical approach /Ed.R.Harris. Oxford, 1991. P.151.
      -- Smith JM H J. Electron Microsc. 1984. Vol.33. P.378.
      -- Smith KJ., Larramendl P.C. // J. Electron Microsc. Techn. 1988. Vol.8. P.223.
      -- Smith M, Croft S. II Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed.RHarris. Oxford, 1991. P.17.
      -- Smith M.W. etaL II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. Vol.88. P.4926.
      -- Song S.H., Roach МЛ. // Acta anat. 1985. Vol.123. P.45.
      -- SpurrAJ>. H J. Ultrastruct. Res. 1969. Vol.26. P.31.
      -- Srewart M. 11 Electron microscopy in biology: A practical approach /Ed.RHarris. Oxford, 1991. P.229.
      -- Sugi Y. И J. Electron Microsc. 1989. Vol.38. P.126.
      -- Sugimoto Т., Ogata T. // Arch. Histol. Cytol. 1989. Vol.52. P.257.
      -- SwannJ.D. etaL 11 Toxicol. Pathol. 1991. Vol.19. P.128.
      -- Takagil. etaL I/ J. Electron Microsc. 1990. Vol.39. P.67.
      -- Takahashi I., Amakam Y. // J. Electron Microsc. 1989. Vol.38. P.242.
      -- Tamaki T.etaL Ц i. Electron Microsc. 1992. Vol.4i. P.76.
      -- Tanaka К et aL I j Progr. Clin. Biol. Res. 1989. Vol.295. P.21.
      -- Tanaka K, Mitsushtma А. Ц J. Microsc. 1984. Vol.133, pt.2. P.213.
      -- TandlerB. j/ J. Electron Microsc. 1990. Vol.14. P.285.
      -- Todd JM. et aL // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.22. P.301.
      -- TokuyasuKT. И Histochem J. 1980. Vol.12. P.381.
      -- Tokuyasu KT. // J. Microsc. 1986. Vol.143, pt.2. P.139.
      -- Tokuyasu KT. //Histochem. J. 1989. Vol.21. P.163.
      -- Trump B.F., Berezesky IJC // Toxicology. 1989. Vol.3. P.47.
      -- TvedtKE Ц Ultrastruct. Pathol. 1991. Vol.15. P.l 11
      -- Uehara Y., Suyama К // J. Electron Microsc. 1978. Vol.27. P.157.
      -- UphoffC. et aL 11 I. Electron Microsc.Techn. 1984. Vol.1. P.419.
      -- UrrylXW. etaL // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1988. Vol.151. P.686.
      -- Ushiki Т. И J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P.60.
      -- Van Noorden CJ.F., Hulstaert C.E. // Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. RHarris. Oxford, 1991. P.125.
      -- Vial J., Porter KR // J. Cell Biol. 1975. Vol.67. P.345.
      -- Viliiger W., Bremer A. // J. Struct. Biol. 1990. Vol.104. P.178.
      -- Wachtier F. et aL Ц Exp. Cell Res. 1990. Vol.187. P.346.
      -- Wakui S. etaL И 1. Electron Microsc. 1991. Vol.40. P.78.
      -- Walker-Caprioglio HM. etaL 11 Cell Tissue Res. 1991. Vol.264. P.63.
      -- WangN.-S., Wei F. // Scanning Electron Microsc. 1976, pt.5. P.233.
      -- Warley A. // J. Microsc. 1990. Vol.157. P.135.
      -- Warley A., Gupta B.L. // Electron microscopy in biology: A practical approach /Ed. RHarris. Oxford, 1991. P.243.
      -- Wasano K, Yamamoto Т. 11 J. Electron Microsc. 1983. Vol.32. P.33.
      -- Watt I. The principles and practice of electron microscopy. Cambridge, 1989.
      -- Wendt-Gallitelli M.F., Jsenberg G. Ц Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed, H.Plattner. Roca Raton (Flor.), 1989. P.341.
      -- Westphal C. et aL // J. Microsc. 1988. Voi.150. P.225.
      -- Wigglesworth V.B. // Biol. Revs. 1988. Vol.63. P.417.
      -- WtsseEetaL /I Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al.Chicago, 1984. P.31.
   372.WolberRA., Beats T.F. II Colloidal gold: Principles, methods and applications /Ed. MA. Hayat. New York, 1989. Vol.2. P.379.
      -- Yamaguchi M. etaL I / J. Electron Microsc. 1992. Vol.41. P.7.
      -- Yasuda К etaL I f Acta histochem. cytochem. 1989. Vol.22. P.91.
      -- Xu W., Roomans GM. // Proc. Xlth Intern. Congr. Electron Microsc. Kyoto,1986. P.2341.
      -- Zierold К И J. Electron Microsc. Techn. 1988. Vol.9. P.65.
      -- Zorick T.S., SchooIeyC. // Microsc. Res. Techn. 1992. Vol.20. P.103.
  

Научное издание

Миронов Александр Александрович,

Комиссарчик Ян Юдович, Миронов Владимир Александрович

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Утверждено к печати Институтом цитологии Российской академии наук

Редактор издательства Л.С.Евстигнеева

Художник Ю.П.Амбросов Технический редактор О.Б.Мацылевич. Корректор И.А.Крайнева, А.Х.Салтанаева, С.И.Семиглазова и Г.И.Тимошенко

ЛР N 020297 от 27.11.91. Сдано в набор 22.08.94. Подписано к печати 27.12.94. Формат 60 х 90 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Усл. печ. л. 25.0. Уч.-изд. л. 27.7. Тираж 390 экз. Тип. зак. N 3234. С 990.

Санкт-Петербургская издательская фирма РАН 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 1

Санкт-Петербургская типография N 1 РАН 199034, Санкт-Петербург, 9 линия, 12

  
  
   0x01 graphic
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

Оценка: 8.00*3  Ваша оценка:

Связаться с программистом сайта.

Новые книги авторов СИ, вышедшие из печати:
О.Болдырева "Крадуш. Чужие души" М.Николаев "Вторжение на Землю"

Как попасть в этoт список

Кожевенное мастерство | Сайт "Художники" | Доска об'явлений "Книги"